Эутопическая имплантация наступает тогда, когда эндометрий матки, находящийся под определенным гормональным воздействием, вступает в фазу восприимчивости к имплантации бластоцисты [1, 2]. Эта фаза достаточно короткая и должна совпадать с развитием эмбриона до стадии бластоцисты, определяя таким образом короткий интервал времени, когда возможна имплантация. Период, в течение которого эндометрий остается рецептивным для нидации эмбриона, получил название «окна имплантации». Предполагаемое «окно имплантации» человека теоретически совпадает с 20—22-м днем идеального 28-дневного менструального цикла [3—10]. Методом сканирующей электронной микроскопии на поверхности эпителия эндометрия мышей и крыс было выявлено наличие характерных выпячиваний апикальной части плазматической мембраны поверхностного эпителия в период имплантационного окна. В это время мембраны теряют свои микроворсинки и формируют гладкие выпячивания. Так как у грызунов эти структуры участвуют в абсорбции маточного секрета, они были названы «пиноподии» (от греческого pino — пить, podes — нога) [11]. В эндометрии человека также было показано наличие аналогичных пиноподиям структур, появляющихся в середине лютеиновой фазы. В пролиферативную фазу отмечается рост микроворсинок и увеличение числа ресничатых клеток эпителия. Первые признаки формирования пиноподий представляют собой выраженное вздутие клеток, сочетающееся с исчезновением микроворсинок. Затем формируются гладкие и тонкие выпячивания мембраны, поднимающиеся со всей верхушки клетки («развивающиеся пиноподии»). Вскоре после того как микроворсинки полностью исчезают, выпячивания достигают своей максимальной величины и образуют складки, напоминая цветы или грибы («развитые пиноподии»). Эта стадия длится меньше 48 ч [12]. Затем вздутие клеток уменьшается и кончики микроворсинок вновь появляются на поверхности мембран, которые становятся сморщенными, в то время как сама клетка начинает увеличиваться в размере (так называемый «регресс пиноподий»). Как выяснилось, эти изменения клеток возникают в вышеописанной последовательности во всех типах изученных циклов, а продолжительность существования развитых пиноподий не превышает обычно 2 дней. Однако конкретный день их формирования может варьировать у разных женщин. В естественных циклах развитые пиноподии наблюдались в дни пика ЛГ+6—9 (дни 19—22-й) у различных индивидов, в среднем на 20-й и 21-й дни цикла. Выявлена корреляция между наличием пиноподий и успешной имплантацией при переносе эмбрионов [9, 13—15].
Клеточный состав эпителия маточных труб идентичен таковому эпителия эндометрия, в нем также выявляются секреторные и ресничатые клетки. Различие касается количественного соотношения клеток — в маточных трубах отмечается преобладание ресничатых клеток [16]. Имеются многочисленные работы, показывающие изменение морфологии секреторных клеток маточных труб в лютеиновой фазе менструального цикла как у человека [17, 18], так и у животных [19].
A. Makrigiannakis и соавт. [20] впервые охарактеризовали изменения трубного эпителия во время «окна имплантации» появлением пиноподий и показали, что клетки трубного эпителия, как и все органы женской репродуктивной системы, во время менструального цикла претерпевают циклические изменения под действием эстрогенов и прогестерона. Авторы изучали выраженность пиноподий в перешейке, ампулярном и фимбриальных отделах маточных труб с помощью сканирующей электронной микроскопии. Пиноподии были обнаружены в биоптатах маточных труб в секреторную фазу, совпадая с их формированием в эндометрии. Также было выявлено одновременное резкое увеличение содержания интегрина αvβ
В предыдущей работе мы исследовали эпителий фимбриального отдела маточных труб женщин с доброкачественными опухолями и кистами яичников с помощью трансмиссионной электронной микроскопии [21]. Мы обнаружили в ресничатых клетках фимбриального отдела атипичные реснички, содержащие несколько аксонем под одной мембраной и с нарушенной структурой транзитной зоны ресничек — отдела, расположенного при переходе плазматической мембраны клетки в плазматическую мембрану ресничек. В настоящей работе мы проводили исследование фимбриального отдела маточных труб у женщин репродуктивного возраста с доброкачественными опухолями и опухолевидными образованиями яичников во время фолликулярной, овуляторной и лютеиновой фаз менструального цикла. Атипичные реснички были нами обнаружены независимо от фазы цикла. В фимбриальном эпителии во время лютеиновой фазы были выявлены развивающиеся и зрелые пиноподии.
Материал и методы
С помощью растровой электронной микроскопии исследовали структуру эпителия фимбриального отдела маточных труб у 22 женщин репродуктивного возраста с доброкачественными опухолями и опухолевидными образованиями яичников. Критериями включения были репродуктивный возраст пациентки (до 40 лет) и наличие доброкачественных опухолей, опухолевидных образований яичников. Критерии исключения: возраст старше 40 лет, злокачественные новообразования, сочетанная с доброкачественными опухолями и кистами яичников патология половых органов, сопутствующие гормонально-зависимые образования матки, наличие острого воспалительного процесса. Биопсийный материал фимбриального отдела маточных труб для исследования получали во время оперативных вмешательств по поводу указанной патологии. Письменное информированное согласие, одобренное Комитетом по этике МГМСУ, было получено у всех пациенток до включения в исследование. Забор материала проводили у 3 пациенток в фолликулярную фазу (6—11-й день), у 5 — в период овуляции (12—15-й день), у 14 — в лютеиновую фазу менструального цикла (17—25-й день). Общих анамнестических данных у этих женщин не выявлено. При изучении гистологической структуры опухолей и опухолевидных образований яичников было выявлено невыраженное превалирование эндометриоидных кист в 3-й группе пациенток.
Биопсийный материал исследовали с помощью сканирующей электронной микроскопии. Материал фиксировали 2,5% раствором глутарового альдегида («Ted Pella Inc.», США) на 0,1 М какодилатном буфере (рН 7,2—7,4) («Sigma», США) при 4 ˚С в течение 2 ч. Материал дофиксировали 1% раствором осмиевой кислоты («Serva», Германия), дегидратировали в градиенте этанола (50% — 30 мин, 70% — 2 ч, 96% — 2 ч) и ацетоне (2—24 ч).
Препарат высушивали в критической точке возгонки углекислоты (Critical Point Dryer HCP-2, «Hitachi»), рабочий газ СО
Результаты
Фолликулярная фаза цикла. В биопсийном материале фимбриального отдела маточных труб, полученном в фолликулярной фазе менструального цикла, у 3 пациенток были обнаружены зоны с обильным содержанием ресничатых клеток (рис. 1). Секреторные клетки, расположенные между ресничатыми клетками, покрыты микроворсинками, имеют гладкую или куполообразную форму и занимают примерно 25% от всей поверхности в изученных образцах. В одном образце мы наблюдали зоны с уменьшенным количеством ресничатых клеток: их количество было равно количеству секреторных клеток, причем ресничатые и секреторные клетки формировали «островки» (рис. 2). Характерной чертой ресничатых клеток являлось наличие атипичных утолщенных ресничек толщиной до 2 мкм (рис. 3), обнаруженных в 2 из 3 образцов. Утолщенные реснички на 1—1,2 мкм длиннее ресничек, имеющих нормальную толщину (0,1—0,15 мкм). Основание атипичных ресничек и их основная часть имеют одинаковый диаметр, апикальная часть атипичных ресничек конусообразная, закругленная или заостренная.
Овуляторная фаза цикла. Во время овуляторной фазы в фимбриальном эпителии мы обнаружили большое количество ресничатых клеток. В 4 из 5 образцов выявили атипичные утолщенные реснички (рис. 4). В 3 образцах наблюдали зоны со значительно уменьшенным количеством ресничатых клеток, расположение которых было идентично таковому в эндометрии (рис. 5) [14]. Секреторные клетки имели выраженные межклеточные контакты, ровную поверхность, их апикальная часть покрыта микроворсинками.
Лютеиновая фаза цикла. В фимбриальном эпителии во время лютеиновой фазы цикла мы наблюдали зоны со «спокойными» секреторными клетками, которые имели ровную апикальную поверхность, покрытую микроворсинками. Во всех изученных образцах выявляли зоны как с большим количеством ресничатых клеток, так и со значительно уменьшенным их количеством.
В 11 из 14 образцов мы обнаружили формирование выростов апикальной поверхности секреторных клеток. В 5 образцах выявляли выросты секреторных клеток с неравномерно расположенными утолщенными и укороченными микроворсинками, с нарушенными межклеточными контактами (рис. 6), которые можно характеризовать как созревающие пиноподии [14]. Островки зрелых пиноподий выявили в 6 образцах из 11. Морфологической характеристикой зрелых пиноподий является куполообразная форма, отсутствие микроворсинок на апикальной поверхности и нарушение межклеточных контактов (рис. 7). Секреторные клетки со зрелыми пиноподиями и ресничатые клетки выявляли в равной пропорции (рис. 8), причем островки пиноподий можно было характеризовать как обильные.
В 9 из 14 образцов выявили ресничатые клетки с атипичными утолщенными и удлиненными ресничками (см. рис. 7).
Обсуждение
Известно, что секреторные клетки эндометрия млекопитающих подвергаются циклическим изменениям во время фаз менструального цикла, образуя выросты апикальной поверхности (пиноподии), формирование которых совпадает по времени с «имплантационным окном» [22]. Пиноподии, таким образом, являются морфологическими маркерами рецептивности эндометрия [22]. Описана позитивная корреляция между количеством пиноподий эндометрия и наступлением беременности при использовании вспомогательных репродуктивных технологий [14, 23]. В ряде случаев неудачи беременности после переноса эмбриона связаны с отсутствием пиноподий [24].
А. Makrigiannakis и соавт. [20] показали, что эпителий маточных труб, как и эпителий эндометрия, реагирует на гормональные стимулы формированием пиноподий, что, по мнению авторов, является фактором риска внематочной беременности.
Появление пиноподий связано с другими маркерами рецептивности, такими как потеря рецепторов прогестерона и максимальная экспрессия интегрина αvβ
Данные настоящей работы подтверждают возможность формирования пиноподий в трубном эпителии во время «окна имплантации» эндометрия. Это свидетельствует о том, что эпителий маточных труб отражает состояние рецептивности эндометрия, в течение которого может произойти взаимодействие эмбриона и эндометрия, приводящее к имплантации бластоцисты и наступлению беременности. Можно предположить, что при замедленном движении эмбриона по маточным трубам возможна эктопическая имплантация (трубная беременность). Хотя беременность в фимбриальном отделе составляет 5% всех эктопических беременностей [30], она, как и другие типы, внематочной беременности, представляет существенную угрозу репродуктивному здоровью женщины и в отдельных случаях даже ее жизни [31]. Это уникальное явление, свойственное только человеку [32], у других млекопитающих трубная беременность не возникает ни спонтанно, ни экспериментально [33]. Именно поэтому исследования природы эктопической беременности, позволяющие выявить некоторые стороны механизма ее возникновения, можно проводить только на биопсийном материале, что связано с определенными сложностями.
Исследования в сканирующем электронном микроскопе биоптатов эпителия фимбриального отдела маточных труб подтвердили наши находки, сделанные с помощью трансмиссионной электронной микроскопии [21]. Мы описали атипичные реснички, содержащие большое количество аксонем, где была обнаружена аномальная структура транзитной зоны. В настоящей работе были выявлены аномальные утолщенные реснички, диаметр которых достигал 1 мкм. Основание атипичных ресничек и их основная часть имеют одинаковый диаметр, который уменьшается в апикальной части ресничек. Такие реснички расположены вертикально по отношению к поверхности эпителия и, судя по отсутствию волнообразных изгибов, характерных для типичных ресничек, не совершают колебательного движения.
Нами впервые описано наличие таких атипичных ресничек в фимбриальном отделе эпителия маточных труб человека. Аналогичные структуры наблюдали H. Abe и H. Hoshi [34] в фимбриальном эпителии маточных труб морских свинок. Авторы предположили, что эти структуры формируются в лютеиновой фазе цикла и их функцией является децилиация ресничатых клеток. Однако постоянный диаметр подобных ресничек, отсутствие отшнуровывающихся фрагментов ресничек позволяют думать, что это — постоянные структуры, присутствующие в ресничатых клетках фимбриального отдела труб пациенток с доброкачественными опухолями и опухолевидными образованиями яичников.
Непонятны и требуют дальнейшего тщательного изучения вопросы, являются ли эти структуры патогномоничными для доброкачественной патологии яичников и влияют ли найденные изменения на репродуктивное здоровье пациенток [35]. Мы предполагаем, что аномалии транзитной зоны атипичных ресничек могут быть и генетически обусловленной формой цилиопатии.
Известны некоторые белки, которые могут быть ответственны за нарушение структуры транзитной зоны, например, белок СЕР290. Этот белок в нормальных ресничках выявляется в районе Y-связок между плазматической мембраной и наружными дуплетами аксонемы транзитной зоны. В медицинской литературе широко обсуждаются мутации гена транзитной зоны СЕР290, которые вызывают группу цилиопатий — от слепоты до перинатальной летальности. СЕР290 необходим для формирования связи мембраны и микротрубочек [36]. Потеря белка приводит к дефектам структуры жгутиков, включая изменение нормального баланса внутрицилиарного транспорта. У мутантов по СЕР290 расстояние между мембраной и микротрубочками аксонемы сильно варьирует. Мутанты по СЕР290 имеют выраженные дефекты структур, локализованных между микротрубочками транзитной зоны и плазматической мембраной ресничек, — отсутствуют Y-связки. Именно эти параметры мы отмечали при описании атипичных ресничек — наличие цитоплазматических выростов, диаметр которых может значительно превышать диаметр аксонемы, отсутствие Y-связок.
Таким образом, мы показали: 1) формирование пиноподий в лютеиновой фазе менструального цикла у женщин репродуктивного возраста с доброкачественными опухолями и опухолевидными образованиями яичников, что, возможно, является физиологической нормой для всех женщин во время «окна имплантации» или, наоборот, фактором риска эктопической беременности для изучаемой группы пациенток; 2) наличие атипичных ресничек в клетках фимбриального отдела маточных труб у женщин репродуктивного возраста с доброкачественными опухолями и опухолевидными образованиями яичников.
Необходимы дальнейшие молекулярно-биологические исследования для выявления генных аномалий, вызывающих нарушения структуры транзитного отдела ресничек у вышеназванных пациенток, а также поиск способов неинвазивной диагностики данных состояний (исследования генов, кодирующих белки транзитной зоны).