Эндометриоз — доброкачественное гинекологическое заболевание, характеризующееся наличием ткани, подобной эндометрию, вне полости матки. Распространенность данного заболевания достигает 10—15% среди женщин репродуктивного возраста [1]. Несмотря на длительное изучение эндометриоза, этиология данного патологического процесса до сих пор не ясна. Эндометриоз является многофакторным заболеванием. Предложено множество теорий патогенеза эндометриоза: имплантационная (теория ретроградной менструации), метапластическая, эмбриональная, дисгормональная и теория нарушения иммунного баланса [2].

Теория ретроградной менструации предполагает, что клетки эндометрия могут быть перенесены с током крови в брюшную полость и прикрепиться к брюшине. Метапластическая теория подразумевает, что эндометриоз вызывается спонтанной метаплазией мезотелиальных клеток целомического эпителия. Данную теорию подтверждают следующие факты. Во-первых, целомический эпителий может дифференцироваться в несколько типов клеток; во-вторых, мезотелий и производные мюллеровых протоков сходны по своей эмбриональной природе, так как образуются из мезотелиальных клеток мезодермального происхождения.

Теория развития эндометриоидных очагов из эндометриальных стволовых клеток подразумевает формирование гетеротопий из циркулирующих стволовых клеток (из костного мозга) или из стволовых клеток, расположенных непосредственно в эндометрии. Эмбриональная теория описывает развитие эндометриоза из гетеротопий парамезонефральных (мюллеровы) протоков, возникших вследствие нарушения эмбриогенеза [2].

Однако у каждой пациентки с эндометриозом развитие и прогрессирование заболевания объясняется по-своему и протекает сугубо индивидуально. Лечение включает консервативные (гормональные препараты, анальгетики, нестероидные противовоспалительные препараты) и оперативные (иссечение и коагуляция очагов эндометриоза, энуклеация эндометриоидных кист) методы. Несмотря на активное применение перечисленных методов, риск рецидивов эндометриоза после курса лечения остается достаточно высоким [3].

Отсутствие единой теории этиологии и патогенеза, описывающей все известные случаи заболевания, и качественных методов своевременной диагностики обусловливает актуальность изучения эндометриоза на более глубоком, молекулярном уровне [4]. Подобный подход к изучению заболевания открывает новые возможности в вопросе поиска биомаркеров для ранней диагностики и мониторинга эффективности проводимой терапии.

За последнее время опубликовано множество статей, касающихся изучения экспрессии генов при эндометриозе [5—9]. Данные исследования отличаются количеством пациентов и анализируемых генов, типом взятой для анализа ткани, платформой для секвенирования, а также статистическими методами, используемыми для расшифровки полученной информации. Количество дифференциально экспрессированных генов, выявленных в указанных выше исследованиях, варьируется от единиц до сотен. Тем не менее роль данных генов в патогенезе и прогрессировании эндометриоза лишь предполагалась, а дальнейшего развития эта гипотеза не получила.

Современной тенденцией генетических исследований при эндометриозе является сравнение профилей экспрессии генов в образцах эутопического и эктопического эндометрия [10—13]. Полученные данные могут быть использованы для оценки роли генетических факторов в патогенезе эндометриоза, а также с целью создания перспективной диагностической тест-системы.

Цель исследования — провести транскриптомный анализ образцов эутопического и эктопического эндометрия пациенток с эндометриозом и образцов эутопического эндометрия женщин, не имеющих данного заболевания; сравнить транскриптом очагов эндометриоза с транскриптомом условно нормального эндометрия.

В исследование включены 6 пациенток с эндометриозом и 3 пациентки с несостоятельностью рубца на матке после операции кесарева сечения.

Критериями включения в исследуемую группу являются: репродуктивный возраст (15—49 лет), гистологически верифицированный эндометриоз. Всем пациенткам в зависимости от диагноза выполнены лапароскопия, иссечение очагов эндометриоза, энуклеация эндометриоидных кист яичников и пайпель-биопсия эндометрия.

Критериями включения в группу сравнения являются: репродуктивный возраст (15—49 лет); отсутствие эндометриоза, подтвержденное лапароскопически, гистологически верифицированное отсутствие патологии эндометрия (гиперплазия, эндометрит). В данную группу включены пациентки с несостоятельностью рубца на матке после операции кесарева сечения, которым проведены метропластика лапароскопическим доступом и пайпель-биопсия эндометрия.

Критерии исключения: воспалительные заболевания органов малого таза, гиперплазия эндометрия, миома матки, аденомиоз, прием гормональных препаратов или применение внутриматочной спирали в течение года до оперативного лечения.

В нашем исследовании мы проанализировали транскриптом очагов эндометриоза для выявления молекулярных механизмов, лежащих в основе данного заболевания. В частности, мы сравнили транскриптом эутопического и эктопического эндометрия пациенток с эндометриозом с транскриптомом эндометрия женщин, не имеющих данного заболевания. Эутопический и эктопический эндометрий взят у одних и тех же пациенток. Данные о пациентках представлены в таблице.

У каждой пациентки с эндометриозом взято минимум два образца ткани: биоптат эутопического эндометрия и материал из очага эндометриоза. В случае эндометриоза яичников в качестве исследуемых образцов использованы фрагменты капсулы эндометриоидной кисты. До непосредственного выполнения анализа все образцы хранились в пробирках с раствором RNA Later для сохранения целостности РНК. Далее из полученных образцов ткани выделена РНК и приготовлены пробы для гибридизационного микрочипа. Транскриптом изучаемых образцов исследовали методом микрочиповой гибридизации. Для осуществления описанного этапа работы использованы приборы для синтеза (B3 Synthesizer, «CustomArray», США) и анализа (ElectraSenseReader, «CustomArray», США) микрочипов.

Для анализа внутриклеточных сигнальных путей использовали различные биоинформатические алгоритмы. Данные методы обеспечивают количественный и качественный анализ активации сигнальных путей. Для каждого исследуемого образца ткани выполняли сравнение по типу случай—контроль и вычисляли силу активации пути (PAS — pathway activation strength), значение которой служит качественной мерой активации сигнального пути.

Внутриклеточные сигнальные пути регулируют многочисленные процессы, нормальные и патологические, включая пролиферацию и апоптоз. Белковые взаимодействия в пределах одного сигнального пути могут быть конкурентными и независимыми. Общая схема функционирования отдельного белка может включать как последовательные (сигнальный путь), так и параллельные (сетевые) взаимодействия. Роль каждого генного продукта в передаче сигнала может зависеть от типа подобных взаимодействий. Существующие методы в основном используют данные об экспрессии отдельных генов и определенных соматических мутациях в указанных генах. В отличие от описанного метода, используемый нами подход учитывает функцию каждого молекулярного «участника» передачи сигнала и определяет, является ли активность сигнального пути усиленной или, наоборот, подавленной, по сравнению с нормой. Понимание того, как активированы сигнальные пути, позволяет понять, какие процессы изменены в патологической клетке на молекулярном уровне. Важным аспектом является то, что степень активации сигнальных путей является более устойчивым и достоверным маркером патологических состояний, чем уровень экспрессии отдельных генов.

Выполнено профилирование 17 биологических образцов, из них 3 условно нормальных (от пациенток, не имеющих эндометриоза) образца эндометрия, 6 образцов эутопического эндометрия от пациенток с эндометриозом и суммарно 8 образцов очагов эндометриоза.

Сигналы проб снимали путем измерения электрохимических потенциалов реакций; дизайн микрочипов представляет собой расположение четырех подложек на одном чипе, суммарное число проб на каждой из подложек составляет 2240. Для некоторых генов экспрессия измеряется несколькими пробами; в таком случае для получения значения экспрессии сигналы проб геометрически усреднялись. Всего в ходе работы анализировали 2227 генов.

Проведено статистическое тестирование (T-test: образцы эутопического и эктопического эндометрия пациенток с эндометриозом сравнили с образцами нормального эндометрия пациенток, не имеющих эндометриоза) для каждого гена c поправкой на FDR Беньямини—Хохберга (Benjamini—Hochberg FDR).

При тестировании получены статистически значимые результаты по регулируемому (adjusted) порогу (p<0,05) — 241 дифференциально экспрессированный ген: ILK, ILMN_2079991_ERVWE1, ITGA4, ITGB8, JAK2, KCNK6, KCNT2, KITLG, KRAS, KREMEN1, LAG3, LAMA1, LAMC1, LAMC2, LAMTOR3, LAT, LCP1, LCP2, LFNG, MAP2K5, MAP2K6, MAP3K13, MAP3K4, MAP3K7, MAP4K4, MAP4K5, MDM2, MITF, MMP14, MMP3, MMP7, MMP8, MRGPRF, MUC1, MYH9, MYL12A, MYL5, MYL6, MYL7, MYLK, MYO15A, MYO5A, NACA, NCOA2, NFATC3, NFKBIB, NOTCH3, NOTCH4, NOV, NR0B1, NRP2, PAK1, PARP9, PARVA, PAX5, PDGFA, PHB2, PHKG2, PIAS2, PIAS4, PIK3C2A, PIK3CA, PIK3R1, PIK3R6, PLA2G12A, PLA2G2D, PLA2G4D, PLCB1, PLCB3, PLCE1, PLK1, PLS3, POLD1, PPARG, PPP1CB, PPP1R10, PPP1R1B, PPP1R3B, PPP2R5C, PPP2R5D, PRKCD, PRKCH, PRLR, PSENEN, PSMA4, PSMA6, PSMB7, PSMB8, PSMC5, PSMD1, PTCH2, PTGS2, PXN, PYGO1, RAD51, RASGEF1B, RASGEF1C, RASGRF1, RFC3, RGS19, RGS22, RGS6, RIN1, ROCK2, RPS6KC1, RPTOR, RXRB, RXRG, SCN1A, SCN9A, SH2B2, SLC7A5, SMAD2, SMAD5, SMAD9, SMARCA1, SMARCD3, SNW1, SPOCK1, SRC, STK11, SULT2A1, TAB1, TAF1, TAF11, TAF9, TBC1D4, TCF21, TGFB1I1, TGFB3, TGFBR2, THEM4, TIAM1, TIMP2, TLN1, TLN2, TMSB4X, TNFRSF10B, TNFSF12, TNFSF4, TOP1MT, TUBA1B, TUBE1, UBE2A, UBE2C, UBE2E1, UBE2J2, UBE2V1, USP36, USP39,USP4, WNT11.

Расчеты PAS проведены в соответствии с биоинформатическими методами, количественно оценивающими экспрессию сигнальных путей относительно «нуля», заданного образцами условно здорового эндометрия.

В рамках данного исследования проведены расчеты для 378 сигнальных путей. Применены экспрессионный фильтр, отсекающий экспрессии, составляющие менее 5% от максимума для каждого из образцов, как источник шума, а также σ-фильтр.

Используя метод основных компонент (PCA — principal component analysis), проанализировали общее распределение и кластеризацию профилей биообразцов. В целом исследуемые биоразмеры можно разделить на четыре основные группы: нормальный эндометрий (n=3), эутопический эндометрий (n=6), эктопический эндометрий из очагов ретроцервикального эндометриоза и эндометриоза брюшины (n=4), а также эктопический эндометрий, представленный фрагментами эндометриоидных кист яичников (n=4).

Полученные данные свидетельствуют о том, что все, кроме одного образца очага эндометриоза, сгруппированы вместе, а образцы нормального эндометрия определенно не входят в данный кластер, что свидетельствует о значительном различии между образцами нормального эндометрия от пациенток без эндометриоза и образцами из очагов эндометриоза от пациенток с этим заболеванием (рис. 1, а,

Следующее наблюдение заключалось в том, что образцы эутопического и эктопического эндометрия показали очень высокое сходство в отношении профилей экспрессии генов в целом.

Иерархический метод кластеризации, выполненный как на уровне экспрессии генов, так и на уровнях активации внутриклеточных сигнальных путей, подтвердил эти результаты (рис. 2, а,

Как показано на иерархических кластерных тепловых картах, образцы не образуют каких-либо конкретных групп в соответствии с индивидуальностью пациента или типом биообразца (см. рис. 2, а) для уровня экспрессии генов и (см. рис. 2, б) для уровня активации внутриклеточных сигнальных путей. Это говорит о том, что независимо от локализации большинство образцов из очагов эндометриоза имеют сходные молекулярные профили, существенно отличающиеся от профиля эндометрия пациенток, не болеющих эндометриозом.

Затем мы вычислили взаимосвязь по экспрессии генов (рис. 3, а)

В большинстве случаев отмечена сильная корреляция между образцами из различных очагов эндометриоза, независимо от локализации и принадлежности к конкретному пациенту. На уровне экспрессии генов вычислены парные корреляции между следующими группами образцов:

— между всеми индивидуально взятыми образцами из очагов эндометриоза и образцами здорового эндометрия;

— между всеми соответствующими эутопическими и эктопическими образцами эндометрия (рис. 4).

Результат анализа показал, что корреляция между образцами эутопического и эктопического эндометрия значительно выше, чем корреляция между образцами эндометрия женщин, не имеющих эндометриоза, и образцами эутопического эндометрия от пациенток с эндометриозом (р=0,0013, тест Уилкоксона — Wilcoxon Signed Ranks Test).

Таким образом, полученные данные говорят о том, что эутопический эндометрий является показательным в отношении наличия эктопических очагов. Несомненно, необходимо расширение выборки пациентов в исследуемой группе и группе сравнения, однако наши предварительные результаты показывают, что анализ транскриптома эутопического эндометрия может быть положен в основу инновационной малоинвазивной диагностики эндометриоза.

Молекулярные характеристики эндометриоидных очагов индивидуальны для каждой из пациенток и для различных очагов эндометриоза одной пациентки. В данном исследовании проанализированы 14 образцов эутопического и эктопического эндометрия, а также сила активации сигнальных путей в данных образцах вне зависимости от фазы менструального цикла и распространенности эндометриоза. Важным аспектом являлось включение в исследование пациенток, не принимавших гормональные препараты, и соответственно демонстрирующих непосредственную молекулярную картину заболевания.

Для обнаружения надежных биомаркеров и создания тест-системы, подходящей для диагностики эндометриоза вне зависимости от второстепенных факторов, необходимо проанализировать большую выборку пациенток и выявить гены и сигнальные пути, аберрантное действие которых не детерминировано фазой менструального цикла и стадией патологического процесса.

В ходе данного исследования в образцах эутопического и эктопического эндометрия выявлен определенный набор сигнальных путей и включенных в них генов, изучение которых необходимо продолжить.

Учитывая степень корреляции нарушений активации внутриклеточных сигнальных путей в образцах эутопического и эктопического эндометрия и имея репрезентативное количество образцов для формулирования обоснованных выводов, можно предположить, что в перспективе оценка эутопического эндометрия окажется полезной для ранней диагностики эндометриоза и мониторинга эффективности проводимой терапии.

Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда (проект № 18−15−00165).

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Сведения об авторах

Азнаурова Яна Борисовна — аспирант, кафедра репродуктивной медицины и хирургии, Московский государственный медико-стоматологический университет им. А.И. Евдокимова; тел.: +7(964)629-1966, e-mail: yaznaurova@mail.ru; https://orcid.org/0000-0002-9651-2865

Петров Иван Владимирович — магистр, Московский физико-технический институт

Сунцова Мария Владимировна — младший научный сотрудник, Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова

Гаража Андрей Владимирович — научный сотрудник, Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова

Буздин Антон Александрович — д.б.н., проф., Первый онкологический научно-консультационный центр

Адамян Лейла Владимировна— академик РАН, д.м.н., проф., заведующая кафедрой репродуктивной медицины и хирургии, Московский государственный медико-стоматологический университет им. А.И. Евдокимова