Введение
Врожденные пороки развития (ВПР) являются причиной детской инвалидности и высокой смертности в первый год жизни. По данным эпидемиологических исследований, в разных популяциях людей частота ВПР при рождении составляет 3—6% [1]. Несмотря на то что истинные причины ВПР часто бывают неизвестными, большинство исследователей допускают связь аномалий развития в период эмбриогенеза и фетогенеза с генетическими и внешними факторами (перинатальные инфекции матери, курение, прием алкоголя, наркотиков, лекарств и т.д.) [1, 2].
Успех беременности зависит от уникальных врожденных и приобретенных иммунных реакций матери [3]. Решающую роль в этих процессах играют неклассические молекулы человеческих лейкоцитарных антигенов I класса — HLA-G. Молекулы HLA-G обладают иммуносупрессивными и противовоспалительными свойствами. Их функции во время беременности заключаются в ингибировании активности и запуске апоптоза натуральных клеток-киллеров (NK-клеток) и CD8+ цитотоксических T-лимфоцитов, стимулировании пролиферации CD4+ T-клеток и активировании дендритных клеток и регуляторных T-клеток, обеспечивающих состояние толерантности матери и плода [4, 5].
Молекулы HLA-G напрямую взаимодействуют с поверхностными ингибирующими рецепторами ILT2 и ILT4 (известными как IgG-подобные рецепторы 1 и 2) на клетках лимфоидного и миелоидного происхождения и рецептором KIR2DL4 (IgG-подобный рецептор NK-клеток) [6]. Многие исследователи указывают на принадлежность HLA-G к молекулам иммунной контрольной точки, их продукция подавляется при воспалении и аутоиммунных состояниях и индуцируется при вирусных и микробных инфекциях, и неоплазии [6—10].
Молекулярные исследования показали, что при экспрессии гена HLA-G в результате альтернативного сплайсинга первичного транскрипта образуются семь изоформ белка, из них четыре связаны с клеточной мембраной (G1—G4), а три являются растворимыми — sHLA (G5—G7). Обе формы имеют одинаковую специфичность к рецепторам NK-клеток и T-клеток [11]. Во время беременности концентрация sHLA-G в периферической крови женщин в несколько раз выше, чем у небеременных женщин [7]. Обнаружены корреляции между низкими концентрациями sHLA-G в плазме/сыворотке крови у женщин и осложнениями беременности [12].
Продукция молекул HLA-G контролируется полиморфизмом гена HLA-G. Полиморфизм в кодирующем регионе гена (69 аллелей, включая нулевые HLA-G*01:05N и HLA-G*01:13N) отвечает за состав аминокислотной последовательности белка, количество его продукции и связывание с пептидами. Полиморфизм в некодирующих участках гена HLA-G (промоторная область -5’URR и 3’-нетранслируемая область — 3’UTR) контролирует уровень экспрессии гена и стабильность мРНК [4]. Обнаружены ассоциации аллелей и гаплотипов HLA-G с осложнениями беременности (спонтанные выкидыши, преэклампсия) у женщин в разных популяциях [12]. Связь материнского полиморфизма гена HLA-G с ВПР у плода мало изучена. В то же время обнаружено, что аллели и гаплотипы HLA-G у матери могут контролировать иммунные реакции на вирусы во время беременности и отвечать за передачу вирусной инфекции ребенку [4, 13].
Цель исследования — изучить связь материнского полиморфизма гена HLA-G (rs41551813, rs12722477, rs41557518 и rs66554220), перинатальных инфекций и курения в семье с риском ВПР у плода.
Материал и методы
Выборки. Исследуемую группу (группу ВПР) составили 335 женщин с ВПР у плода/новорожденного. На момент обследования 225 (67%) женщин были беременными (15—41 нед), а 110 (33%) женщин — роженицы. Критериями включения в основную группу были результаты: ультразвукового исследования (УЗИ) на разных сроках беременности, подтверждающие наличие порока(ов) у плода; диагностического тестирования, подтверждающие отклонение от нормы уровня маркеров состояния плода (альфа-фетопротеина и хорионического гонадотропина человека); патолого-анатомического заключения о наличии порока(ов) у абортусов и мертворожденных; клинического подтверждения диагноза неонатологами у живорожденных детей в соответствии с МКБ-10 (Q00-Q99); гинекологического обследования женщины во время беременности. Структура ВПР у ребенка представлена на рисунке.
Структура врожденных пороков развития у плода/новорожденного.
ВПР ССС — пороки сердечно-сосудистой системы (Q20—Q28, n=73): дефект межжелудочковой и/или предсердной перегородки, аномалии магистральных сосудов, тетрада Фалло; ВПР ЦНС — пороки центральной нервной системы (Q00—Q07, n=62): анэнцефалия, агенезии мозолистого тела, мальформации Арнольда—Киари и Денди—Уокера, spina bifida; ВПР МВС — пороки мочевыводящей системы (Q60—Q64, n=60): врожденный гидронефроз, дисплазия почек, одно/двухсторонняя пиелоэктазия, поликистоз почек; ВПР КМС — пороки костно-мышечной системы (Q65—Q79, n=36): полидактилия, укорочение трубчатых костей, нарушение развития передней брюшной стенки, гастрошизис; ВПР ЖКТ — пороки желудочно-кишечного тракта (Q38—Q45, n=16): атрезия пищевода, атрезия двенадцатиперстной кишки, высокая кишечная непроходимость, поликистоз печени; ВПР губы и/или нёба (Q35—Q37, n=13): расщелина нёба, расщелина верхней губы, расщелина губы и нёба; ВПР ПС — пороки половой системы (Q50—Q56, n=7): гипоспадия, кистозная аномалия развития яичника; МВПР — множественные врожденные пороки развития (n=68): сочетание двух, трех видов врожденных аномалий.
Критериями исключения были: хромосомные аномалии у плода (синдром Дауна и т.д.), сахарный диабет и ВПР у матери. Характеристика обследуемых женщин представлена в табл. 1. Средний возраст женщин исследуемой группы составил 26,1±4,7 (SD) года.
Таблица 1. Характеристика исследуемых групп
| Осложнения, исходы | Группа | |
| ВПР (n=335) | контроль (n=418) | |
| Осложнения настоящей беременности, n (%) | ||
| Угрожающий выкидыш | 140 (41,8) | 69 (16,5) |
| Дисфункция плаценты | 261 (77,9) | 122 (29,2) |
| Преждевременная отслойка нормально расположенной плаценты | 3 (0,8) | — |
| Гестоз | 95 (28,3) | 56 (13,4) |
| ЗВУР плода | 41 (12,2) | — |
| Сексуально-трансмиссивные инфекции, в том числе: | 147 (43,8) | 46 (11,0) |
| вирусныеа | 64 (19,1) | 16 (3,8) |
| бактериальныеb | 83 (24,7) | 33 (7,9) |
| простейшиеc | 12 (3,6) | 8 (1,9) |
| бактериальный вагиноз и/или вульвовагинальный кандидоз | 146 (43,6) | 191 (45,7) |
| ОРВИ в I триместре | 61 (18,2) | 9 (2,1) |
| Курение в семье | 176 (52,5) | 120 (28,7) |
| Курение женщины | 42 (12,5) | 51 (12,2) |
| Курение мужчины | 173 (51,6) | 111 (26,5) |
| Неизвестно | 62 (18,5) | 155 (37,1) |
| Сопутствующая соматическая патологияd | 150 (44,7) | 134 (32,5) |
| Выкидыши в анамнезе, бесплодие | 47 (14,0) | 9 (2,1) |
| Исход настоящей беременности, n (%) | ||
| Прерывание беременности по медицинским показаниям | 94 (28,1) | —- |
| Антенатальная гибель плода | 3 (0,8) | — |
| Поздний выкидыш | 6 (1,8) | — |
| Роды | 232 (69,2) | 418 (100,0) |
| Смерть ребенка на 1—2-е сутки после рождения | 6 (1,8) | — |
Примечание. ЗВУР — задержка внутриутробного развития; a — герпетическая и/или цитомегаловирусная инфекции, гепатит C; b — гонококковая, хламидийная, микоплазменная моно- и микст-инфекции; c — урогенитальный трихомониаз и токсоплазменная инфекция; d — частые ОРВИ, хронический гайморит, тонзиллит, хронический гастрит, хронический пиелонефрит, цистит, кольпит, эндоцервицит.
В группу сравнения (контроль) включены 418 женщин без ВПР у плода/ребенка, из них 275 (66%) женщин были беременными (15—36 нед) и ранее уже имели 1—2 детей, а 143 (34%) — роженицы (роды в сроки 35—40 нед; масса тела новорожденного больше 2000 г). Критериями включения женщин в группу послужили: отсутствие ВПР у плода, подтвержденное УЗИ на разных сроках беременности, при рождении ребенка — неонатологами; объективная оценка соматического и акушерского статуса (см. табл. 1). Средний возраст женщин группы сравнения составил 26,7±4,9 (SD) года.
Урогенитальные инфекции во время беременности рассматривали в качестве возможного фактора риска ВПР у плода/ребенка. В связи с этим проведен анализ медицинских карт обследуемых женщин. Инфекционный статус беременных женщин оценивали, исходя из данных трех лабораторных тестов: микроскопического исследования — выявление бактериального вагиноза и вульвовагинального кандидоза, Treponema pallidum; иммуноферментного анализа и полимеразной цепной реакции (ПЦР) — выявление вируса простого герпеса I и II типа, цитомегаловируса, вируса краснухи, гепатита C; Neisseria gonorrhoeae, Chlamydia trachomatis, Mycoplasma hominis, Mycoplasma genitalium, Ureaplasma urealyticum и Gardnerella vaginalis; Trichomonas vaginalis и Toxoplasma gondii.
В качестве фактора курения считали курение в семье, которое оценивали как курение одного или обоих супругов (см. табл. 1).
Всеми женщинами подписано информированное добровольное согласие на участие в исследовании. Исследование построено на принципах Хельсинкской декларации 1975 г., проведено с соблюдением условий конфиденциальности и одобрено местным этическим комитетом (протокол №87 от 14.03.22).
Генотипирование. Геномную ДНК выделяли из лимфоцитов периферической крови методом фенол-хлороформной депротеинизации, образцы ДНК хранили при температуре –20°C.
Однонуклеотидные замены (SNP) Thr31Ser (rs41551813, HLA-G*01:03) в экзоне 2, Leu110Ile (rs12722477, HLA-G*01:04) и 1597 delC (rs41557518, HLA-G*01:05N) в экзоне 3 гена HLA-G типировали методом асимметричной Real Time ПЦР с последующим анализом кривых плавления на амплификаторе CFX96 (Bio-Rad, США). Описание праймеров и зондов, а также выполнения ПЦР приведено ранее [14].
Полиморфизм гена HLA-G 14 bp Ins/Del (rs66554220) в 3’UTR области экзона 8 детектировали с помощью электрофореза в 7% полиакриламидном геле. Для амплификации фрагмента гена HLA-G использовали специфические праймеры: 5’-TAAAGTGTCACCCCTCACTGT-3’ (прямой) и 5’-GAGTCAGGGTTCTTGAAGTCA-3’ (обратный). Постановку реакции амплификации проводили на термоциклере «Терцик» (НПФ «ДНК-Технология», Россия) с соблюдением следующих условий: денатурация (95°C — 3´), 32 цикла в режиме 92°C — 10´´, 60°C — 10´´, 72°C — 10´´, заключительный синтез (72°C — 3´). Общий объем реакционной смеси составил 15 мкл, смесь содержала: 40—100 нг ДНК; 300 nM каждого праймера; 0,2 mM dNTP, 2 мкл 10 mM Tris-HCl (pH=8,9), 55 mM KCl; 2,5 mM MgCl2, 0,05% (v/v) Tween 20; 0,5 e.a. термостабильной Taq-полимеразы.
Статистическая обработка данных. Соответствие частот генотипов гена HLA-G равновесию Харди—Вайнберга (HWE) оценивали с помощью критерия χ2 Пирсона. Нулевую гипотезу отвергали при P≤0,05.
Для выявления ассоциаций материнских SNP HLA-G с ВПР у плода/новорожденного в качестве базовой модели выбрана аддитивная модель наследования признака [14]. Силу ассоциации — отношение шансов (odds ratio — OR) и его доверительный интервал (95% CI) оценивали с помощью логистического регрессионного анализа — функция glm программы R, GenABEL, пакет Genetics программного обеспечения R-project (www.r-project.org). Поправку Бонферрони применяли для исключения статистических ошибок при множественных сравнениях. Неравновесие по сцеплению между SNP HLA-G анализировали на основе значений D´, рассчитанных с использованием программы CubeX (https://www.oege.org/software/cubex). Оценку статистической мощности исследования проводили с помощью генетического online-калькулятора, адрес свободного доступа: https://pngu.mgh.harvard.edu/~purcell/gpc/cc2.html.
Результаты
Было изучено влияние факторов перинатальных инфекций, курения в семье и материнского полиморфизма гена HLA-G на предрасположенность к ВПР у плода (табл. 2).
Таблица 2. Влияние перинатальных инфекций, курения в семье и материнского полиморфизма гена HLA-G на формирование врожденных пороков развития у плода
| Фактор | Группа | χ2 (df) P | OR [95% CI]a | |
| ВПР n | контроль n | |||
| Перинатальные инфекции, | 204/131 | 197/221 | 14,16 (1) 0,0001 | 1,75 [1,31—2,34] |
| в том числе: | ||||
| вирусные | 94/131 | 24/221 | 63,80 (1) <0,001 | 6,61 [4,02—10,87] |
| бактериальные | 83/131 | 33/221 | 41,45 (1) <0,001 | 4,24 [2,69—6,71] |
| бактериальный вагиноз | 146/131 | 191/221 | 0,50 (1) 0,49 | — |
| микст-инфекция | 98/131 | 45/221 | 40,11 (1) <0,001 | 3,67 [2,43—5,56] |
| Курение в семье: | 19,23 (1) <0,001 | 2,15 [1,52—3,04] | ||
| курят | 176 | 120 | ||
| не курят | 97 | 143 | ||
| Полиморфизм гена HLA-G: | ||||
| Thr31Ser (rs41551813) экзон 2 | ||||
| Thr/Thr | 304 | 390 | ||
| Thr/Ser | 16 | 18 | ||
| Ser/Ser | –16 | 1 | 0,94 | |
| аллель риска Ser (*01:03) | (0,025)c | 20 (0,024) | (0,90)d | |
| PHWEb | 0,64 | 0,63 | ||
| Leu110Ile (rs12722477) экзон 3 | ||||
| Leu/Leu | 266 | 357 | ||
| Leu/Ile | 53 | 52 | ||
| Ile/Ile | 4 | 1 | ||
| аллель риска 110Ile (*01:04) | 61 (0,094) | 54 (0,065) | 0,04 (0,12) | 1,47 [1,00—2,16] |
| PHWE | 0,46 | 0,52 | 0,01d (0,03)e | 1,86 [1,13—3,05]d |
| 1597 delC (rs41557518) экзон 3 | ||||
| C/C | 303 | 396 | ||
| C/delC | 19 | 13 | ||
| delC/delC | — | — | ||
| аллель риска delC (*01:05N) | 19 (0,029) | 13 (0,016) | 0,07 | |
| PHWE | 0,58 | 0,74 | 0,02 (0,06)e | 3,03 [1,19—7,73]d |
| 3’UTR 14bp Ins/Del экзон 8 | ||||
| (rs66554220) | ||||
| Del/Del | 74 | 116 | ||
| Ins/Del | 180 | 219 | ||
| Ins/Ins | 73 | 80 | ||
| аллель риска Ins | 326 (0,498) | 379 (0,456) | 0,08 | |
| PHWE | 0,06 | 0,21 | 0,08 | |
Примечание. n — количество наблюдений; a — приведены только значимые результаты; b — уровень статистической значимости при оценке равновесия частот генотипов по закону Харди—Вайнберга; c — в скобках приведена наблюдаемая частота аллеля; d — результаты с учетом поправки на инфекции и курение в семье; e — приведены значения P после статистической коррекции по Бонферрони (количество статистических тестов равно 3).
Выявлено, что у обследованных нами женщин перинатальные инфекции являлись статистически значимым фактором риска ВПР у плода (OR=1,75 [1,31—2,34], P<0,001). Анализ этиологических признаков перинатальных инфекций у женщин показал, что в группе ВПР статистически значимо чаще наблюдались вирусные и бактериальные инфекции по сравнению с группой контроля (P<0,001). По частоте выявления бактериального вагиноза и/или вульвовагинального кандидоза во время беременности исследуемая группа женщин и группа контроля сопоставимы (P=0,49).
Обнаружена статистически значимая ассоциация фактора курения в семье с риском ВПР у плода (OR=2,15 [1,52—3,04], P<0,001).
Изучение полиморфизма гена HLA-G у женщин в группах ВПР и контроля показало, что распределение наблюдаемых и ожидаемых частот генотипов rs41551813, rs12722477, rs41557518 и rs66554220 HLA-G у женщин этих групп соответствует равновесию Харди—Вайнберга (PHWE>0,05) (см. табл. 2). Полиморфные сайты rs41557518 и rs66554220 HLA-G находились в неравновесии по сцеплению (D´= –0,751 (r=0,014), χ2=10,31, P=0,001).
С помощью логистического регрессионного анализа оценили влияние изучаемых полиморфизмов гена HLA-G у женщин на риск развития ВПР у плода, в том числе с учетом поправок на перинатальные инфекции и курение в семье. В изучаемых нами группах женщин значимые ассоциации полиморфных сайтов rs41551813, rs41557518 и rs66554220 HLA-G с риском ВПР у плода отсутствовали, за исключением rs12722477 HLA-G (Leu110Ile в экзоне 3). Выявили значимую ассоциацию аллеля 110Ile (HLA-G *01:04) с риском ВПР у плода только с учетом поправок на перинатальные инфекции и курение в семье (OR=1,86 [1,13—3,05]) и после коррекции по Бонферрони (Pc=0,03). Размер нашей выборки имеет мощность 80%, для того чтобы обнаружить ассоциацию с OR=1,86 для rs12722477 HLA-G при уровне статистической значимости 0,05 (https://pngu.mgh.harvard.edu/~purcell/gpc/cc2.html).
Далее была изучена возможная связь материнского rs12722477 полиморфизма гена HLA-G, перинатальных инфекций и курения в семье с ВПР у плода в отдельных морфологических системах (табл. 3). Поэтому внутри основной группы женщин выделили подгруппы в зависимости от типа ВПР у плода/ребенка. Адекватное сравнение подгрупп женщин с ВПР у плода костно-мышечной системы (n=36), пищеварительной системы (n=16), расщелиной губы и/или нёба (n=14) и половой системы (n=7) с группой контроля (n=418) провести не представлялось возможным, они исключены из дальнейшего анализа.
Таблица 3. Влияние перинатальных инфекций, курения в семье и материнского rs12722477 полиморфизма гена HLA-G на формирование порока развития у плода в отдельных морфологических системах
| Фактор | Контроль (n=418), n | ВПР ССС (n=73) | ВПР ЦНС (n=62) | ВПР МВС (n=60) | МВПР (n=68) | ||||
| n | OR [95% CI]а, P | n | OR [95% CI]a, P | n | OR [95% CI]a, P | n | OR [95% CI]a, P | ||
| Инфекции | |||||||||
| есть | 197 | 40 | 41 | 2,18 [1,25—3,83] | 38 | 1,94 [1,11—3,40] | 47 | 2,57 [1,49—4,45] | |
| нет | 221 | 33 | 0,22 | 21 | 0,006 | 22 | 0,02 | 21 | 0,0007 |
| Курение в семье | |||||||||
| курят | 120 | 44 | 3,06 [1,66—5,66] | 24 | 37 | 2,08 [1,16—3,75] | 30 | 2,15 [1,14—4,09] | |
| не курят | 143 | 17 | 0,0003 | 21 | 0,34 | 21 | 0,01 | 17 | 0,02 |
| rs12722477 HLA-G | |||||||||
| аллель риска 110Ile (*01:04) | 0,065b | 0,123 | 2,14 [1,19—3,83], 0,01 (0,04)c | 0,080 | 0,60 | 0,100 | 0,11 | 0,096 | 0,29 |
| 2,87 [1,38—5,93]d, 0,004 (0,02) | 0,43 | 2,23 [1,01—4,92]d, 0,04 (0,16) | 2,98 [1,26—7,04]d, 0,01 (0,04) | ||||||
Примечание. n — количество наблюдений; a — приведены только значимые результаты; b — наблюдаемая частота аллеля; c — значения P после статистической коррекции по Бонферрони (количество статистических тестов равно 4); d — результаты с учетом поправки на инфекции и курение в семье.
Обнаружено, что инфекции и курение в семье были значимыми факторами риска ВПР мочевыводящей системы (МВС) и множественных ВПР (МВПР) у плода. В то же время для ВПР сердечно-сосудистой системы (ССС) значимым фактором риска было курение в семье, но не инфекции, а для ВПР центральной нервной системы (ЦНС) — наоборот (см. табл. 3).
Была выявлена ассоциация материнского аллеля 110Ile rs12722477 HLA-G с риском ВПР ССС у плода (OR=2,14 [1,19—3,83], Pc=0,04), в том числе с учетом поправки на инфекции и курение в семье (OR=2,87 [1,38—5,93], Pc=0,02). Сами по себе ассоциации материнского полиморфизма rs12722477 HLA-G с риском у плода ВПР ЦНС, ВПР МВС и МВПР отсутствовали, но введение поправки на инфекции и курение в семье позволило выявить значимую ассоциацию аллеля 110Ile только с риском МВПР у плода (OR=2,98 [1,26—7,04], Pc=0,04).
Обсуждение
Как известно, на ранних этапах беременности высокий уровень метаболизма в клетках эмбриона служит идеальным условием для размножения внутриклеточных инфекционных агентов [15]. В настоящем исследовании выявлена связь между перинатальными инфекциями матери и предрасположенностью к ВПР у плода (OR=1,75 [1,31—2,34]). В зависимости от морфологического типа ВПР обнаружены ассоциации перинатальных инфекций матери с риском ВПР ЦНС (OR=2,18 [1,25—3,83]), ВПР МВС (OR=1,94 [1,11—3,40]) и МВПР (OR=2,57 [1,49—4,45]) у плода/новорожденного. Выявлено, что женщины с ВПР у плода во время беременности чаще имели вирусные, бактериальные и смешанные инфекции, чем женщины, вынашивающие плод без ВПР. Наибольший риск формирования ВПР у плода связан с вирусными инфекциями матери (OR=6,61 [4,02—10,87]).
Наши результаты согласуются с данными литературы. Имеется большое число работ, допускающих связь вирусных, бактериальных и паразитарных инфекций с ВПР у плода [16, 17], причем их возбудители могут проявлять тропизм к определенным органам и системам плода [15]. Не только первичные, но чаще реактивированные хронические урогенитальные инфекции матери способны проявлять тератогенные эффекты в отношении развивающегося зародыша [16].
Ворсинчатая поверхность трофобласта ограничивает прикрепление и внедрение бактерий и паразитов (например, Listeria monocytogenes и T. gondii) к эмбриону/плоду, однако вирусы способны проникать и размножаться в клетках ворсинок. Считается, что полимикробные инфекции стимулируют и облегчают проникновение вируса к плоду. Присутствие других патогенных бактерий также может активировать латентные хронические вирусные инфекции в децидуальной ткани во время беременности [15, 16].
Курение влияет на состав вагинальной микробиоты у женщин [18]. У курящих женщин чаще выявляется бактериальный вагиноз, и они подвержены большему риску сексуально-трансмиссивных инфекций, чем некурящие. Сигаретный дым может влиять на васкуляризацию децидуальной ткани и провоцировать хронический спазм сосудов фетоплацентарного комплекса и развитие гипоксии плода [19]. Сходство симптомов инфекционного токсикоза и дезадаптации, обусловленной гипоксией, затрудняет диагностику хронических инфекций матери на раннем этапе беременности [16].
Наше исследование показало, что курение в семье связано с риском формирования ВПР у плода (OR=2,15 [1,52—3,04], P<0,001), в особенности с ВПР ССС, ВПР МВС и МВПР. Как известно, сигаретный дым содержит продукты, способствующие канцерогенным и тератогенным эффектам у человека. Метаанализ (125 исследований, 8 870 837 участников) показал, что при активном курении матери риск врожденных дефектов сердца у детей увеличивался на 25%, при пассивном курении матери — на 124% и при активном курении отца — на 74% по сравнению с некурящими семьями [20]. Курение родителей рассматривается в качестве фактора риска развития пороков сердца (конотрункальные дефекты, дефекты межпредсердной перегородки, транспозиции магистральных сосудов и др.), расщелины губы и/или нёба, косолапости, гастрошизиса у плода [20]. Воздействие сигаретного дыма во время беременности может достигать своих эффектов посредством модуляции иммунного ответа матери. Имеются убедительные доказательства связи курения с воспалением, предшествующим патологии у людей [21].
Хронические воспалительные реакции на границе «мать — плод» могут привлекать и вызывать дифференцировку и активацию многих иммунных клеток из периферической крови матери. Они могут служить мишенями для вирусов и способствовать их репликации и распространению [22]. Состояние иммуносупрессии также используется многими вирусами, бактериями и паразитами [6]. За обеспечение механизмов иммуносупрессии в фетоплацентарном отделе отвечают молекулы HLA-G. Кроме того, они также участвуют в иммунных реакциях хозяина против патогенов [6, 10].
В настоящей работе мы изучали связь материнских полиморфных сайтов rs41551813, rs12722477, rs41557518 и rs66554220 гена HLA-G с риском ВПР у плода, в том числе с учетом инфекции и курения в семье. В нашем исследовании изучаемые материнские полиморфные сайты гена HLA-G самостоятельно не влияли на риск ВПР у плода. Однако при введении поправки на перинатальные инфекции и курение в семье выявлена единственная значимая ассоциация — SNP rs12722477 HLA-G с риском ВПР у плода (OR=1,86 [1,13—3,05], Pc=0,03). В то же время весьма неожиданной оказалась ассоциация материнского аллеля 110Ile HLA-G (HLA-G*01:04) с риском ВПР ССС у плода (OR=2,14 [1,19—3,83], Pc=0,04), повышающимся после введения поправки на инфекции и курение в семье (OR=2,87 [1,38—5,93], Pc=0,02).
Во время беременности функции HLA-G выходят за рамки типичной молекулы врожденного иммунитета [22]. Продукция молекул HLA-G требует соблюдения тонкого баланса между повышенными и пониженными концентрациями для обеспечения выживания фетоплацентарной единицы за счет подавления материнского иммунного ответа, но в то же время для привлечения достаточного количества иммунных клеток с целью защиты от патогенов [23]. В клинических исследованиях у беременных женщин отмечалось выраженное увеличение концентрации sHLA-G в сыворотке крови и амниотической жидкости при вирусных, бактериальных и паразитарных инфекциях [10]. Однако неизвестно, могут ли продукты сигаретного дыма влиять на образование sHLA-G в периферической крови женщин во время беременности.
У здоровых людей высокие и низкие концентрации sHLA-G в периферической крови связаны с определенными аллелями HLA-G [4, 24]. Отмечено, что у женщин аллели, коррелирующие с низкими уровнями sHLA-G в крови, имеют ассоциации с осложнениями беременности (такими как самопроизвольные выкидыши, преждевременные роды, преэкламсия) [12]. Вместе с тем оказалось, что «низкосекреторные» аллели часто встречаются в популяциях людей с высокой инфекционной нагрузкой. Предполагается, что у беременных женщин низкая продукция молекул HLA-G может быть связана с более устойчивым иммунным ответом на вторжение патогенов. Напротив, «высокосекреторные» аллели и гаплотипы HLA-G при беременности с внутриматочной инфекцией могут быть менее полезными для выживания эмбриона/плода [23].
Как показали исследования, аллель 110Ile HLA-G (rs12722477, HLA-G*01:04:01) относится к «высокосекреторным» аллелям и связана с более высокими концентрациями sHLA-G и sHLA-I в плазме крови европейских доноров [12, 24]. Позднее обнаружены ее корреляции с повышенной продукцией sHLA-G в слизистой оболочке цервикального канала у женщин [24]. Кроме того, в разных популяциях людей аллель HLA-G*01:04 неравновесно сцеплена с другим «высокосекреторным» супертипом — HLA-A*024 (A*023/A*024), который служит маркером тяжелых форм инфекции и рака [25]. Надо сказать, что ранее с помощью лимфоцитотоксического теста нами обнаружена связь гаплотипа HLA A24/B35 с ВПР у плода у обследуемых женщин [26].
По данным литературы, аллель 110Ile HLA-G (HLA-G*01:04) ассоциирована с чувствительностью к ВИЧ-1 и вирусам папилломы человека [4, 27]. Она также связана с вертикальной передачей вирусной инфекции от матери к ребенку [4, 13, 27] и раком мочевого пузыря высокой степени злокачественности у курящих людей [25].
В I триместре беременности молекулы HLA-G обеспечивают баланс активации/репрессии NK-клеток, на долю которых приходится примерно 70% лейкоцитов децидуальной ткани [5, 22]. In vitro обнаружено, что молекулы HLA-G*01:04 отличаются от HLA-G*01:01 и HLA-G*01:03 в представлении профиля якорной последовательности пептида NK-клеткам. Молекулы HLA-G*01:04 могут контролировать механизмы ограничения цитотоксических функций NK-клеток. На это указывают работы, в которых использовались клетки линии K652, трансдуцированные вариантами HLA-G*01:01, HLA-G*01:03 и HLA-G*01:04 в качестве мишеней, и NK-клетки в качестве эффекторов. Так, трансдуцированные HLA-G*01:04 клетки К652 имели максимальную защиту от NK-опосредованного лизиса, большую, чем клетки, трансдуцированные HLA-G*01:01 и HLA-G*01:03 [28]. В исследованиях с децидуальными NK-клетками (dNK) найдено, что они гораздо эффективнее взаимодействовали с sHLA-G*01:04, чем с sHLA-G*01:03 [29].
Недавно открыт новый молекулярный механизм, позволяющий сохранять баланс между HLA-G-индуцированной иммунной толерантностью и противовирусным ответом на границе «мать — плод» [22]. Обнаружено, что при взаимодействии dNK-клеток с HLA-G-презентирующими клетками трофобласта и/или другими иммунными клетками они могут приобретать молекулы HLA-G посредством трогоцитоза и терять свою цитотоксическую активность [22]. Многими вирусами используется стратегия представления молекул HLA-G на инфицированных клетках, в результате такие клетки способны уклоняться от NK-опосредованного цитолиза [6, 9]. Прерывание цикла «трогоцитоз — интернализация — поглощение» молекул HLA-G вирусными продуктами и/или цитокинами могло восстанавливать dNK-клеточный контроль над инфекцией [22]. В целом предполагается, что трогоцитоз обеспечивает локальный аварийный механизм иммуносупрессии, где in situ эффекторные клетки немедленно приобретают эффективную, но временную регуляторную функцию [8].
Вместе с тем рецессивные эффекты аллеля 110Ile HLA-G (HLA-G*01:04) при воспалении, вероятно, могут объяснять выявленную нами ассоциацию с ВПР ССС у плода. Обнаружены ассоциации аллеля HLA-G*01:04 с воспалением при болезни Крона и язвенном колите [4], с атопией [30], васкулопатией (синдром Кавасаки) [8] и низкой выживаемостью трансплантата легкого [30]. Нельзя исключить, что хроническое вялотекущее воспаление у женщины может усиливаться во время беременности, а его продукты (цитокины, хемокины, реактивные виды кислорода и т.д.) могут влиять на развитие ВПР ССС у плода.
Заключение
Таким образом, во время беременности перинатальные инфекции матери и курение в семье являются, согласно результатам проведенного нами исследования, основными факторами риска врожденных пороков развития у плода. Дополнительным фактором риска является материнский аллель 110Ile HLA-G (rs12722477, HLA-G*01:04). Аллель 110Ile HLA-G у беременных женщин не может быть маркером врожденных пороков развития у плода. Более вероятно, он может быть уязвимым фактором, который во время беременности отвечает за молекулярные механизмы ограничения иммунного ответа матери на патогены и создание иммуносупрессивной среды, благоприятной для поддержания инфекции и тератогенеза плода. Материнские полиморфные сайты rs41551813, rs41557518 и rs66554220 гена HLA-G значимо не влияют на риск ВПР у плода.
Проведенное нами исследование ограничено изучением полиморфизма гена HLA-G только у матери. Изучение полиморфизма гена HLA-G в парах «мать — ребенок», в том числе с учетом факторов инфекции и курения в семье, поможет сделать более обоснованные выводы относительно его связи с врожденными пороками развития, поэтому необходимо продолжить исследование. В целом наша работа может быть полезной в понимании молекулярных механизмов формирования патологии в системе «мать — плод».
Участие авторов:
Концепция и дизайн исследования — Гордеева Л.А., Воронина Е.Н.
Сбор и обработка материала — Гордеева Л.А., Мун С.А., Гареева Ю.В., Нерсесян С.Л.
Статистическая обработка — Гордеева Л.А., Соколова Е.А.
Написание текста — Гордеева Л.А., Поленок Е.Г., Воронина Е.Н.
Редактирование — Глушков А.Н.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.