Введение
Эндометриоз представляет собой гинекологическое заболевание, характеризующееся ростом эндометриоподобных тканей как внутри, так и снаружи полости малого таза [1]. Данное заболевание диагностируется примерно у 176—179 млн женщин во всем мире, что составляет около 10% всех женщин репродуктивного возраста [2, 3]. Среди кинических проявлений эндометриоза преобладают дисменорея, нарушение фертильности, хроническая тазовая боль, бесплодие, которые негативно сказываются на качестве жизни пациенток [4, 5]. Следует отметить, что частота выявления бесплодия среди женщин с эндометриозом составляет 35—50% [6, 7]. Важно, что лечение бесплодия, связанного с эндометриозом, остается сложной задачей, для решения которой необходим комплексный подход (консервативные и хирургические методы лечения) и требуются серьезные финансовые затраты [8].
На сегодняшний день молекулярные механизмы развития данного заболевания остаются весьма «загадочными» и в значительной степени неизвестными, несмотря на большое количество работ, посвященных изучению этиопатогенеза эндометриоза [9, 10]. Природа данного заболевания и его основных клинических проявлений (бесплодие и др.) является сложной (многофакторной), включающей большое количество гормональных, воспалительных, генетических, иммунологических факторов и факторов окружающей среды [3, 7, 11, 12].
Следует отметить, что с генетических позиций эндометриоз активно изучается (проведено 15 полногеномных исследований [13] и выполнено много работ по поиску ассоциаций генов-кандидатов с заболеванием [14—18]). Однако роль наследственных факторов в формировании отдельных наиболее важных клинических проявлений заболевания (бесплодие и др.) до настоящего времени изучена недостаточно [19—21], что не позволяет дать объективные оценки вклада генетических детерминант в развитие клинических особенностей эндометриоза. Следует отметить, что эти клинические особенности течения заболевания (развитие бесплодия) имеют не только важное медицинское (необходимо проводить лечебные мероприятия с целью нормализации репродуктивной функции женщины) [22], но и социальное (отсутствие детей в семье повышает риск расторжения данного брака и т.д.) [23] значение. Предупреждение возникновения бесплодия у женщин с эндометриозом на основе понимания генетической природы его возникновения позволит существенно улучшить качество жизни больных.
Цель исследования — оценить роль полиморфных локусов генов половых гормонов в формировании бесплодия у пациенток с эндометриозом.
Материал и методы
Выборка для исследования составила 395 женщин, из которых 132 больных эндометриозом с бесплодием и 263 пациентки — с эндометриозом без бесплодия. Группа исследования формировалась на базе гинекологического отделения ОГБУЗ «Белгородская областная клиническая больница Святителя Иоасафа» (Белгород) под контролем комиссии по этике НИУ «БелГУ»и включала уроженок Центрального Черноземья России русской национальности [24, 25], давших согласие на участие в исследовании.
Исследование выполнено в соответствии со стандартами надлежащей клинической практики (Good Clinical Practice) и принципами Хельсинкской декларации. Протокол исследования одобрен этическим комитетом медицинского института НИУ «БелГУ». До включения в исследование у всех участников получено письменное информированное добровольное согласие.
Анализируемые группы больных эндометриозом с бесплодием (39,75 года) и без него (40,73 года) сопоставимы по возрастному показателю (p>0,05).
Фенольно-хлороформным методом осуществлялось выделение ДНК из образцов крови [26]. Девять полиморфных локусов генов половых гормонов ZNF789 (rs148982377), ZKSCAN5 (rs34670419), FSHB (rs11031002, rs11031005), SLC22A10 (rs112295236), ANO2 (rs117585797), CHD9 (rs117145500), SHBG (rs727428), TP53 (rs1641549) были специально отобраны для настоящего исследования согласно их связи с уровнем половых гормонов у женщин в ранее проведенных полногеномных исследованиях [27, 28]. Согласно данным биоинформатического ресурса HaploReg [29], все анализируемые локусы демонстрируют выраженное регуляторное значение и влияют на экспрессию генов. Генотипирование исследуемых полиморфных локусов генов половых гормонов выполнялось с помощью ПЦР (метод TaqMan зондов, использовались наборы реагентов, синтезированные ООО «ТестГен», Ульяновск).
При сравнительном анализе частот аллелей и генотипов между больными эндометриозом с бесплодием и без него использованы критерий χ2 [30] и программное обеспечение Statistica. Изучение вовлеченности полиморфных локусов генов половых гормонов в формирование бесплодия при эндометриозе осуществлялось с помощью программы gPLINK [31]. Нами применен метод логистического регрессионного анализа (тестирована аддитивная генетическая модель) [32]. Оценка характера установленных ассоциаций однонуклеотидного полиморфизма с бесплодием при эндометриозе основывалась на показателях отношения шансов (OR) и 95% доверительного интервала (OR 95% ДИ) [33]. Проводилась коррекция на множественные сравнения [34] с вычислением показателя pperm (статистически значимым считали pperm<0,05 [35]).
Оценка функциональных эффектов полиморфизма генов половых гормонов, вовлеченных в развитие бесплодия при эндометриозе, осуществлялась с использованием общедоступных биоинформатических ресурсов [36]: HaploReg (анализ эпигенетических эффектов) [29] и GTExportal (изучена связь с транксрипцией генов) [37], а также ранее опубликованных методик [38, 39].
Результаты и обсуждение
Установлено, что в группе пациенток с эндометриозом без бесплодия распределение молекулярно-генетического маркера rs1641549 отклоняется от равновесия Харди—Вайнберга (p=0,001) (см. таблицу). В связи с этим полиморфный локус rs1641549 исключен из дальнейшего анализа ассоциаций.
Сравнительный анализ частот аллелей и генотипов полиморфных локусов генов половых гормонов у больных эндометриозом с наличием или отсутствием бесплодия
| Локусы | Аллели, генотипы | Больные эндометриозом с бесплодием (n=132) | Больные эндометриозом без бесплодия (n=263) | OR (95% CI) | p |
| n (%) | |||||
| rs148982377 | T | 252 (96,18) | 474 (93,31) | 1,81 (0,84—3,98) | 0,14 |
| C | 10 (3,82) | 34 (6,69) | 0,55 (0,25—1,19) | ||
| T/T | 121 (92,37) | 221 (87,01) | 1,81 (0,82—4,07) | 0,16 | |
| T/C | 10 (7,63) | 32 (12,60) | 0,57 (0,25—1,27) | 0,19 | |
| C/C | 0 (0,00) | 1 (0,39) | 1,00 (0,99—34,40) | 1,00 | |
| Ho/He (PHWE) | 0,076/0,073 (0,100) | 0,126/0,125 (0,100) | — | — | |
| T/T vs. T/C vs. C/C (аддитивная модель, аллель эффекта C) | — | — | 0,45 (0,20—0,99) | 0,05 | |
| rs34670419 | G | 252 (96,18) | 482 (95,26) | 1,25 (0,56—2,86) | 0,68 |
| T | 10 (3,82) | 24 (4,74) | 0,80 (0,35—1,78) | ||
| G/G | 121 (92,37) | 230 (90,90) | 1,21 (0,53—2,82) | 0,77 | |
| G/T | 10 (7,63) | 22 (8,70) | 0,87 (0,37—2,00) | 0,87 | |
| T/T | 0 (0,00) | 1 (0,40) | 0,00 (1,00—34,27) | 1,00 | |
| Ho/He (PHWE) | 0,076/0,073 (0,100) | 0,087/0,090 (0,436) | — | — | |
| G/G vs. G/T vs. T/T (аддитивная модель, аллель эффекта T) | — | — | 0,70 (0,29—1,66) | 0,42 | |
| rs11031002 | T | 229 (89,45) | 454 (90,80) | 0,86 (0,51—1,46) | 0,64 |
| A | 27 (10,55) | 46 (9,20) | 1,16 (0,68—1,97) | ||
| T/T | 102 (79,69) | 207 (82,80) | 0,82 (0,46—1,45) | 0,55 | |
| T/A | 25 (19,53) | 40 (16,00) | 1,27 (0,71—2,29) | 0,47 | |
| A/A | 1 (0,78) | 3 (1,20) | 0,65 (0,03—7,05) | 1,00 | |
| Ho/He (PHWE) | 0,195/0,189 (1,000) | 0,456/0,438 (0,205) | — | — | |
| T/T vs. T/A vs. A/A (аддитивная модель, аллель эффекта A) | — | — | 1,24 (0,71—2,16) | 0,45 | |
| rs11031005 | T | 232 (88,55) | 462 (91,67) | 0,70 (0,42—1,19) | 0,20 |
| C | 30 (11,45) | 42 (8,33) | 1,42 (0,84—2,40) | ||
| T/T | 102 (77,86) | 211 (83,73) | 0,68 (0,39—1,20) | 0,20 | |
| T/C | 28 (21,38) | 40 (15,87) | 1,44 (0,81—2,55) | 0,23 | |
| C/C | 1 (0,76) | 1 (0,40) | 1,93 (0,05—70,74) | 1,00 | |
| Ho/He (PHWE) | 0,214/0,203 (0,100) | 0,159/0,153 (0,100) | — | — | |
| T/T vs. T/C vs. C/C (аддитивная модель, аллель эффекта C) | — | — | 1,49 (0,84—2,64) | 0,18 | |
| rs112295236 | C | 250 (95,42) | 469 (92,69) | 1,64 (0,81—3,40) | 0,19 |
| G | 12 (4,58) | 37 (7,31) | 0,61 (0,29—1,24) | ||
| C/C | 119 (90,84) | 218 (86,17) | 1,59 (0,76—3,38) | 0,25 | |
| C/G | 12 (9,16) | 33 (13,04) | 0,67 (0,32—1,41) | 0,34 | |
| G/G | 0 (0,00) | 2 (0,79) | 0,01 (0,00—7,87) | 0,79 | |
| Ho/He (PHWE) | 0,092/0,087 (0,100) | 0,130/0,136 (0,629) | — | — | |
| C/C vs. C/G vs. G/G (аддитивная модель, аллель эффекта G) | — | — | 0,54 (0,25—1,16) | 0,12 | |
| rs117585797 | C | 255 (97,33) | 486 (97,98) | 0,75 (0,26—2,21) | 0,75 |
| A | 7 (2,67) | 10 (2,02) | 1,33 (0,45—3,85) | ||
| C/C | 124 (94,66) | 238 (95,97) | 0,74 (0,25—2,23) | 0,75 | |
| C/A | 7 (5,34) | 10 (4,03) | 1,34 (0,45—3,94) | 0,75 | |
| A/A | 0 (0,00) | 0 (0,00) | * | * | |
| Ho/He (PHWE) | 0,053/0,052 (0,100) | 0,040/0,039 (0,100) | — | — | |
| C/C vs. C/A vs. A/A| (аддитивная модель, аллель эффекта A) | — | — | 1,11 (0,34—3,60) | 0,86 | |
| rs117145500 | A | 235 (89,69) | 439 (88,15) | 1,17 (0,71—1,95) | 0,60 |
| С | 27 (10,31) | 59 (11,85) | 0,86 (0,51—1,42) | ||
| A/A | 105 (80,15) | 194 (77,91) | 1,15 (0,66—2,00) | 0,71 | |
| A/C | 25 (19,09) | 51 (20,48) | 0,92 (0,52—1,61) | 0,85 | |
| C/C | 1 (0,76) | 4 (1,61) | 0,47 (0,02—4,52) | 0,83 | |
| Ho/He (PHWE) | 0,191/0,185 (0,100) | 0,205/0,209 (0,100) | — | — | |
| A/A vs. A/C vs. C/C (аддитивная модель, аллель эффекта С) | — | — | 0,74 (0,43—1,29) | 0,29 | |
| rs727428 | С | 160 (62,00) | 317 (63,15) | 0,95 (0,69—1,32) | 0,82 |
| T | 98 (37,98) | 185 (36,85) | 1,05 (0,76—1,45) | ||
| C/C | 52 (40,31) | 99 (39,44) | 1,04 (0,66—1,64) | 0,96 | |
| C/T | 56 (43,41) | 119 (47,41) | 0,85 (0,54—1,33) | 0,53 | |
| T/T | 21 (16,28) | 33 (13,15) | 1,29 (0,68—2,42) | 0,50 | |
| Ho/He (PHWE) | 0,434/0,471 (0,356) | 0,474/0,465 (0,892) | — | — | |
| C/C vs. C/T vs. T/T (аддитивная модель, аллель эффекта Т) | — | — | 0,97 (0,61—1,38) | 0,86 | |
| rs1641549 | C | 206 (78,63) | 390 (77,69) | ** | ** |
| T | 56 (21,37) | 112 (22,31) | ** | ** | |
| C/C | 79 (60,31) | 161 (64,14) | ** | ** | |
| C/T | 48 (36,64) | 68 (27,09) | ** | ** | |
| T/T | 4 (3,05) | 22 (8,77) | ** | ** | |
| Ho/He (PHWE) | 0,366/0,336 (0,436) | 0,271/0,347 (0,001) | — | — | |
Примечание. OR — показатель отношения шансов; 95% ДИ — 95% доверительный интервал отношения щансов; p — уровень значимости; Ho — наблюдаемая гетерозиготность; He — ожидаемая гетерозиготность; PHWE — уровень значимости отклонения от закона Харди—Вайнберга; * — не определяется, ** — показатели не рассчитывались в связи с тем, что данный локус исключен из анализа вследствие несоответствия закону Харди—Вайнберга.
При сравнении генетических характеристик 2 групп пациенток с эндометриозом и бесплодием и без него между собой (см. таблицу) выявлено, что аллель C rs148982377 является протективным фактором формирования бесплодия при эндометриозе (pperm=0,05, p=0,05, OR=0,45, 95% ДИ 0,20—0,99).
Согласно данным биоинформатической базы HaploReg, этот однонуклеотидный полиморфизм локализуется в области гистонов, маркирующих энхансеры/промоторы в клетках крови (первичные натуральные киллеры, T-клетки, B-клетки), различных отделах головного мозга (гиппокамп, черная субстанция, хвостатое ядро, кортикальная часть лимбической системы и др.), жировых клетках (ядра), скелетной мускулатуре женщин, ДНКаза-гиперчувствительном сайте в крови, в TF-связывающем домене для 2 факторов транскрипции: TF3 и Bach1. Различия между аллелями C (alt) и T (ref) rs148982377 в LOD scores для указанных факторов транскрипции составляют 2,8 и –1,7 соответственно. Следовательно, генетический вариант C rs148982377, который является протективным фактором формирования бесплодия при эндометриозе (OR=0,45), способствует повышению чувствительности регуляторного участка ДНК к транскрипционному фактору TF3 и снижению аффинности к фактору транскрипции Bach1.
С использованием базы данных GTExportal установлены ассоциации этого молекулярно-генетического маркера с экспрессией генов GS1-259H13.2, ZKSCAN5, CYP3A7. Так, аллель C rs148982377 гена ZNF789, связан с пониженной экспрессией гена GS1-259H13.2 в щитовидной железе (β= –0,53, p=3,9×10–6, pFDR≤0,05) и гена ZKSCAN5 в крови (β= –0,43, p=1,6×10–9, pFDR≤0,05), а также с повышенной транскрипцией гена CYP3A7 в подкожно-жировой клетчатке (β=0,74, p=1,7×10–7, pFDR≤0,05) и надпочечниках (β=1,03, p=6,6×10–9, pFDR≤0,05). Кроме того, выявлено, что аллель C rs148982377 гена ZNF789 ассоциирован с пониженным уровнем альтернативного сплайсинга гена GPC2 (интрон ID 100171925:100172087:clu_20960) в черной субстанции головного мозга (β= –2,10, p=2,4×10–6, pFDR≤0,05).
По материалам K.S. Ruth и соавт. (2016), генетический вариант C rs148982377 гена ZNF789 ассоциирован с низким уровнем дегидроэпиандростерона (ДГЭА) в сыворотке крови женщин (β= –0,53) [27]. ДГЭА является одним из главных предшественников половых стероидов, который секретируется в основном корой надпочечников и клетками фолликула яичников [40]. Считается, что данный гормон, взаимодействуя с рецепторами андрогенов на антральном фолликуле, стимулирует пролиферацию клеток фолликулярной мембраны и клеток гранулезы, что приводит к снижению апоптоза яйцеклеток, уменьшению атрезии фолликулов и способствует сохранению овариального резерва [41]. Следует отметить, что данный гормон оказывает влияние на качество и зрелость ооцитов, способствует восстановлению ДНК в ооцитах [41—44]. Таким образом, ДГЭА характеризуется положительным влиянием на развитие эмбрионов [45]. В литературе есть данные о том, что ДГЭА может снижать частоту выкидышей у бесплодных женщин (36—40 лет) при ЭКО [46].
Исследование на животных показало, что ДГЭА может способствовать пролиферации гранулезных клеток, что приводит к инициированию примордиальных фолликулов и развитию гонадотропин-чувствительных преантральных и ранних антральных фолликулов [47]. Кроме того, установлено, что ДГЭА повышает концентрацию инсулиноподобного фактора роста 1-го типа в сыворотке крови, который оказывает благотворное влияние на развитие фолликулов и качество ооцитов [48]. Имеются данные о связи ДГЭА с возрастными изменениями в метаболизме и функциях нейронов, а также с изменениями в сердечно-сосудистой системе [40].
По данным K.S. Ruth и соавт. (2016), ДГЭА положительно коррелирует с тестостероном (β=0,55), индексом свободного тестостерона (FAI) (β=0,52) и имеет отрицательную корреляцию с глобулином, связывающим половые гормоны (SHBG) (β= –0,15) [27]. Следует отметить, что эти половые гормоны играют важную роль в формировании эндометриоза [10]. В обзорной статье N.L. Dinsdale и соавт. (2021) указывается на связь уровней тестостерона, SHBG и FAI с риском развития эндометриоза. Следует отметить, что ДГЭА влияет на экспрессию рецепторов к фолликулостимулирующему гормону, который также имеет значение в патофизиологии эндометриоза [10]. Имеются данные литературы о связи повышенного уровня фолликулостимулирующего гормона с более высоким риском развития эндометриоза [10].
Заключение
В работе установлена связь GWAS-значимого полиморфизма rs148982377 гена ZNF789 с формированием бесплодия у больных эндометриозом. Аллель C rs148982377 гена ZNF789 является протективным фактором развития бесплодия при эндометриозе (pperm=0,05, OR=0,45). Полиморфный маркер rs148982377 гена ZNF789 демонстрирует выраженные эпигенетические эффекты (расположен в области гистонов, маркирующих энхансеры/промоторы, ДНКаза-гиперчувствительном сайте), ассоциирован с экспрессией генов GS1-259H13.2, ZKSCAN5, CYP3A7 в органах и тканях (в щитовидной железе, крови, подкожно-жировой клетчатке и надпочечниках), вовлеченных в патофизиологию заболевания, а также связан с уровнем альтернативного сплайсинга гена GPC2.
Участие авторов:
Концепция и дизайн исследования — Головченко И.О., Пономаренко И.В., Чурносов М.И.
Сбор и обработка материала — Головченко И.О., Орлова В.С.
Статистическая обработка — Головченко И.О., Батлуцкая И.В., Ефремова О.А.
Написание текста — Головченко И.О.
Редактирование — Чурносов М.И., Пономаренко И.В.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.