Введение

Болезнь ассоциирована с множеством белков, клеток, органов и систем организма с измененными функциями, молекулярные механизмы возникновения которых остаются неясными, несмотря на прогресс в биотехнологии и накопление знаний о болезнях. В силу функциональной взаимозависимости молекулярных субстанций болезнь редко является следствием аномалии отдельного гена, белка или клетки, но отражает сложную совокупность их взаимодействий [1]. Открытие новых биомаркеров основано на выявлении статистических или механистических ассоциаций между измеренными биологическими субстанциями и полученной клинической информацией. В отличие от биологических данных клинические данные, такие как жалобы пациентов, анамнез, методы лечения, клинические симптомы, данные осмотра, биохимического анализа, профили визуализации и другие измерения, часто носят описательный характер и в значительной мере не структурированы. Проблемы с цифровизацией результатов приводят к потере ценной информации, что свидетельствует о необходимости создания новых стратегий для успешного объединения больших разнородных наборов данных и выявления новых специфичных для заболеваний биомаркеров. Совокупность ассоциированных с клиническим событием биомаркеров помогает лучше понять молекулярный механизм заболеваний, особенно при интеграции специфичных для заболевания молекул в белковые профили, где взаимодействия между субстанциями часто указывают на функциональные сигнальные каскады, метаболические пути или молекулярные комплексы, ответственные за фенотипы заболевания и/или вносящие вклад в них. Такой подход более надежен с точки зрения механистического осмысления гипотез о причинах болезней.

Микрочипы на основе антител — эффективный инструмент для анализа белкового профиля. Разработка первых белковых микрочипов началась еще в середине 80-х годов XX века, до открытия ДНК-микрочипов [2]. Однако в силу того, что процесс совершенствования метода растянулся на длительное время, это отсрочило активное внедрение данной высокотехнологичной методики в лабораторно-исследовательскую практику. Микрочипы на основе антител представляют собой аналитические матрицы для обнаружения белка в широком диапазоне концентраций в сложных биологических системах, в том числе в сыворотке/плазме. Микрочипы на основе антител имеют несколько явных преимуществ по сравнению с традиционными иммунологическими методами. К таким преимуществам можно отнести единовременный скрининг множества белковых субстанций, быстрое считывание ответа и минимальный расход биологического образца (сыворотки, плазмы, клеточного экстракта). Эти преимущества выдвигают микрочиповую технологию в разряд незаменимых инструментов для биомедицинских исследований, поскольку с ее помощью можно идентифицировать новые биомаркеры различных заболеваний и оценивать сигнальные пути, вовлеченные в их развитие [1].

Цель настоящего обзора состоит в обобщении мирового и собственного опыта применения микрочиповой технологии на основе антител, в оценке возможности ее использования для проведения протеомного анализа и изучения биомаркеров белковой природы в клинических исследованиях.

Циркулирующие белковые маркеры

Как правило, белки и их посттрансляционные модификации являются теми конечными субстанциями, по которым можно в определенной степени оценивать состояние организма и приблизиться к пониманию механизма заболевания. Динамика представления биомаркеров к валидации в Управлении по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (Food and Drug Administration — FDA) нелинейна во времени. Так, из 109 белковых маркеров, одобренных FDA до 2010 г., 80% были внедрены до 1993 г. и лишь 20% — за период с 1993 по 2010 г. [3]. Протоколы валидации биомаркеров в FDA рассмотрены ранее [4]. Средний темп одобрения FDA новых белковых маркеров в настоящее время составляет около 1,5 новых тестов в год (медиана 1 новый тест в год), и этот показатель, по-видимому, остается практически неизменным на сегодняшний день. Таким образом, современные темпы внедрения биомаркеров парадоксально снизились по сравнению с периодом до 1993 г., когда в период расцвета иммуноанализа с моноклональными антителами, с 1977 по 1993 г., внедрялось в среднем около 5 новых тестов в год (87 белковых маркеров за 16 лет) [3].

Белковые маркеры — составная часть протеома

Протеом представляет собой полный набор белков, продуцируемых клеточным геномом в любой момент времени. В отличие от генома, который одинаков для большинства клеток, протеом очень динамичен. Отдельные наборы белков продуцируются в разных типах клеток и на разных стадиях их развития. Кроме того, на протеом влияют окружающая среда и события, происходящие внутри клетки, например клеточное деление. Изменения в протеоме отражают различные паттерны экспрессии рибонуклеиновой кислоты (РНК) и посттрансляционной модификации белков [5]. Белковые маркеры являются частью протеома, суммирующего информацию об экспрессии белков, их посттрансляционных модификациях, превращениях и обмене. Одна из задач протеомики состоит в исследовании белкового профиля, характерного для определенного состояния или заболевания, с целью разработки новых подходов к диагностике, прогнозу и возможности терапевтической коррекции. В силу того, что биохимические маркеры подлежат измерению в биологических жидкостях, из которых кровь и моча являются наиболее доступным и репрезентативным материалом, протеом сыворотки крови занимает лидирующие позиции в разработке новых биомаркеров, и белки плазмы/сыворотки крови являются наиболее перспективной мишенью исследований. Протеом сыворотки крови человека состоит из тысяч различных белков. На сегодняшний день идентифицировано около 10 тыс. белков в плазме крови [6]. Так, общий атлас пептидов плазмы человека 2021-07, включает 4395 канонических и 1482 дополнительных неповторяющихся белков человека, обнаруженных в 240 экспериментах на основе масс-спектрометрии. Кроме того, дополнительный атлас пептидов включает белки внеклеточных везикул человека 2021-06 с учетом 2757 канонических белков, циркулирующих в крови, из которых 74% (2047) пересекаются с данными общего атласа пептидов плазмы [7].

Протеомный анализ позволяет выявлять новые биомаркеры, ассоциированные с тем или иным состоянием и динамикой его развития [8]. Так, в последние десятилетия протеомный анализ внес существенный вклад в изучение природы сердечно-сосудистых и онкозаболеваний, благодаря чему диагностический арсенал пополнился новыми валидированными маркерами [3, 9]. С помощью протеомного анализа изучались такие заболевания, как сердечная недостаточность [10, 11], порок митрального клапана [12], острый коронарный синдром [13], неклапанная форма трепетания предсердий [14], инфаркт миокарда [15, 16]. В результате этих работ обнаружены такие биомаркеры, как натрийуретический пептид B-типа (BNP), который применяется для диагностики сердечной недостаточности и острого коронарного синдрома [9], тропонин Т (TnT), который применяется для диагностики острого инфаркта миокарда [17], и другие [3, 9].

Методы исследования протеома

Исследование протеома сыворотки представляет собой весьма непростую задачу. Трудности связны с широтой диапазона концентрации разнообразных белков в сыворотке. Так, сыворотка содержит как минорные фракции, измеряемые в фемтомолях, так и мажорные фракции, измеряемые в миллимолях, к которым относятся, например, сывороточный альбумин и иммуноглобулины, составляющие около 99% от общего количества белка в плазме [18]. Кроме того, белки плазмы крови вариабельны ввиду посттрансляционных модификаций, что осложняет задачу их верификации.

Важным моментом является выбор метода протеомного анализа, который минимизировал бы трудности, связанные с широтой диапазона концентраций белка плазмы/сыворотки, с наличием посттрансляционных модификаций, а также с технической составляющей, связанной с эксплуатацией и обслуживанием сложного оборудования.

В мировой практике для исследования протеома сыворотки/плазмы наиболее широко применяются аналитические платформы, включающие газовую и жидкостную хроматографию высокого разрешения, совмещенную с масс-спектрометрией, капиллярный электрофорез, совмещенный с масс-спектрометрией, либо индивидуальное использование масс-спектрометрии [19]. Применение этих методов осложнено необходимостью приобретения и обслуживания габаритного и дорогостоящего оборудования, особыми условиями его эксплуатации, наличием специалистов в данной области. При этом надежность исследования с помощью указанных методов не лишена определенных ограничений [20]. Подробности метода масс-спектрометрии выходят за рамки рассмотрения настоящего обзора. Альтернативным решением проблем, связанных с изучением биомаркеров белковой природы, представляется использование компактной и экономичной высокотехнологичной методики с применением микрочипов на основе антител, относящейся к разряду мультиплексных технологий, базирующихся на взаимодействии «антиген — антитело» [5]. Метод применения микрочипов успешно используется для исследования протеомного профиля плазмы крови и поиска новых маркеров некоторых заболеваний [21—23].

Современные стратегии исследования биомаркеров белковой природы

Традиционный подход в изучении биохимических маркеров в отечественных клинических исследованиях, как правило, сводится к выбору биохимического маркера на основании анализа источников литературы [24, 25] (рис. 1). Этот подход неизбежно приводит в первую очередь к потере новизны исследования, поскольку он основан на выборе из уже в большей или меньшей степени изученных биохимических маркеров, которые можно определить с помощью готовых коммерческих наборов. Кроме того, к недостаткам данного подхода следует отнести высокие шансы различного вида потерь, например связанных с тем, что определение каждого избранного биомаркера в количестве образцов, обеспечивающем необходимую статистическую мощность с помощью готовых наборов, будет нерезультативным в связи с несовпадением чувствительности набора с концентрацией вещества в биологическом образце [25]. Нельзя также исключить, что избранный биомаркер не обнаружит взаимосвязей с исследуемым событием или состоянием в силу того, что при изучении литературы пропущены подробности, касающиеся условий определения биомаркера (среды определения, метода и т.п.).

Рис. 1. Методология анализа биохимических маркеров в клиническом исследовании.

Оставляя за скобками методы тандемной масс-спектрометрии, о которых кратко упомянуто выше, в настоящем обзоре мы ставим цель привлечь внимание к анализу белков с помощью высокотехнологичной микрочиповой методики на основе матрицы, содержащей до 1356 различных антител (см. рис. 1).

Детали микрочиповой технологии на основе матрицы антител

Микрочиповая технология на основе матрицы антител представляет собой разновидность мультиплексного анализа, основанного на взаимодействии «антиген — антитело». Микрочип представляет собой массив антител, иммобилизованных на твердом носителе, в частности на стеклянном слайде. В комплект входит 2 слайда. Ассортимент микрочипов на основе антител, предназначенных для анализа протеома сыворотки/плазмы, достаточно ограничен. Виды протестированных нами микрочипов были описаны ранее [26]. Максимальное количество иммобилизованных уникальных антител на слайде, представленное в двух копиях, содержит микрочип Signaling Explorer Antibody Microarray («Full Moon Biosystems», США). С его помощью можно провести определение 1358 белков в сыворотке/плазме. Следом за ним по количеству иммобилизованных антител идет микрочип Explorer Antibody Microarray, содержащий 656 уникальных антител в двух копиях. Вид проявленного микрочипа и часть таблицы с расшифровкой имиджа с помощью специального программного обеспечения представлены на рис. 2 на цв. вклейке.

Рис. 2. Вид микрочипа на основе антител с 656 иммобилизованными антителами в двух копиях («Full Moon Biosystems», США) (слева), часть идентифицированных белков с помощью программного обеспечения для расшифровки имиджа (справа).

Существуют также микрочипы с меньшим количеством антител, но в 6 копиях каждого белка (рис. 3 на цв. вклейке), которые позволяют не только идентифицировать новые белковые маркеры, но и картировать белок-белковые взаимодействия, а также белковые модификации, например фосфорилирование, важные для установления механизмов сигнальной передачи.

Рис. 3. AKT/PKB Phospho Antibody Array содержит 216 высокоспецифичных антител в 6 копиях, ассоциированных с сигнальным путем AKT/PKB.

Массив предназначен для профилирования фосфорилированных белков в образцах клеток и тканей человека, мыши и крысы.

Существенной составляющей успешного эксперимента с применением микрочипов является оптимизация условий процессинга микрочипа. Это важно для получения читаемого имиджа, пример которого представлен на рис. 3 на цв. вклейке. Оптимальные условия процессинга подобраны экспериментально и описаны ранее [27].

Схематически процессинг микрочипов состоит из нескольких этапов (рис. 4 на цв. вклейке). Сыворотку крови разводят до концентрации 1 мкг/мкл. Современные приборы позволяют измерять белок в микрообъеме образца, например с помощью спектрофотометра NanoDrop («Thermo Fisher Scientific Inc.», США). Белки сыворотки метят флуоресцентным красителем. Несвязавшуюся метку отделяют методом гель-фильтрации на мини-колонках путем центрифугирования при 750 g 2 мин при комнатной температуре. Меченые белки сыворотки в количестве 500 нг наносят на предварительно активированный микрочип. После серии промывок микрочип высушивают и сканируют с помощью лазерного сканера InnoScan Microarray Scanner 900 («Innopsys», Франция). Обработку изображения проводят с помощью программы Mapix с GAL-файлом для идентификации белков.

Рис. 4. Этапы процессинга микрочипов.

Суть оптимизации условий процессинга микрочипов сводилась к подбору количества наносимого на чип меченого белка для получения пригодного для анализа имиджа. В случае перегрузки микрочипа меченым белком при сканировании изображение выглядит как негатив. Это означает, что избыток меченого белка засветил микрочип и анализ его не представляется возможным. Установлено экспериментально, что оптимальное количество нанесения на микрочип по белку составляет 500 нг. Такое количество меченого белка, наносимого на чип, позволяет обнаружить максимально широкий спектр белков и избежать засветки имиджа за счет избыточного количества связанного с меткой белка [27]. За исключением лазерного сканера с программным обеспечением, для микрочиповой технологии не требуется специальное оборудование. Остальное лабораторное оборудование, необходимое для процессинга, относится к разряду стандартного и включает различного вида шейкеры, центрифуги с ротором для микроцентрифужных пробирок, автоматические пипетки в микролитровом диапазоне.

Хранение проявленного микрочипа

К важным аспектам, повышающим потенциал применения микрочиповой технологии, относится возможность хранения проявленных микрочипов на основе антител в течение многих лет в темноте, а также возможность их повторного и даже многократного сканирования без ущерба для яркости флуоресценции пятен. Это позволяет в случае отсутствия специального оборудования для сканирования и считывания данных, а именно лазерного микрочипового сканера со специальным программным обеспечением, проводить микрочиповый анализ. При этом процессинг может быть проведен в одном научном учреждении, а сканирование микрочипов — в другом, располагающем необходимой базой. Подвергшиеся процессингу высушенные микрочипы (или микрочип) могут быть упакованы в тот же контейнер, в котором они были закуплены, и, согласно договоренностям, отправлены в лабораторию, обеспеченную необходимым оборудованием для считывания результата. В результате сканирования микрочипа исследователь получает данные протеомного анализа о количественном содержании белков в образце, выраженные в пикселях, представленные в виде таблицы Excel.

Характеристики пятна, которые можно получить с помощью программного обеспечения, прилагаемого к анализу микрочипов на основе антител

Микрочипы сканируют на лазерном сканере Laser Scanners, InnoScan 900 Series. Затем полученное изображение анализируют после загрузки соответствующего данному виду микрочипа GAL-файла [27]. GAL-файл содержит информацию обо всех антителах к белкам, представленных на микрочипе, и позволяет идентифицировать пятна как белки согласно перечню, представленному в GAL-файлах. Ознакомиться с перечнем антител к белкам можно по ссылке [28], войдя в раздел «Target List». Количественную оценку содержания белка по уровню флуоресцентного свечения соответствующего пятна проводят с помощью программы MAPIX V7.0.0 (Франция), которая предоставляет до 25 разнообразных характеристик, в том числе за вычетом фона. Среди наиболее востребованных количественных характеристик можно выделить среднюю интенсивность флуоресценции пятна, выраженную в пикселях, за вычетом фона при указанной длине волны и медианную интенсивность свечения пятна, выраженную в пикселях, за вычетом фона при указанной длине волны. Эти характеристики дают полуколичественную оценку содержание белка в образце. Помимо наиболее востребованных характеристик программа позволяет вычислить множество дополнительных параметров, например стандартное отклонение фонового шума, выраженное в пикселях, на эталонной длине волны, отношение среднего/медианы, коэффициент вариации фонового шума на указанной длине волны, который соответствует отношению стандартного отклонения фона к среднему значению и т.п. Все многообразие вычисляемых параметров позволяет с большей тщательностью осуществить выбор белков-кандидатов (рис. 5 на цв. вклейке).

Рис. 5. Вид отдельного пятна, отражающего количество белка, представленного в двух параллелях, выбранного из группы «случай» (а) и из группы «контроль» (б).

Валидация белка-кандидата

При выборе дизайна исследования с применением микрочипов необходимо рассматривать дальнейшее подтверждение, или валидацию, избранных белков-кандидатов любым альтернативным методом во всей когорте или (при наличии бюджетных ограничений) в больших группах, выбранных из той же когорты. Подтверждение данных протеомного анализа с помощью альтернативного метода повышает надежность полученных результатов. Для валидации белков-кандидатов мы использовали метод Home ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay), или метод ELISA, приготовленный в «домашних условиях», т.е. собственными силами исследователей, с использованием моноклональных или поликлональных антител к исследуемому белку (первичных антител) и антител к первичным антителам (вторичных антител). Этот метод использовался в тех случаях, когда готовые коммерческие наборы для определения избранного белка были недоступны. В этом разделе более подробно остановимся на деталях Home ELISA, поскольку условия определения конкретного белка приходится подбирать в зависимости от характеристик первичных и вторичных антител.

ELISA — это метод твердофазного иммуноферментного анализа. Разновидности метода ELISA подразделяют на четыре основные категории: прямой (direct), непрямой (indirect), многослойный (sandwich) и конкурентный (competitive). Три самых распространенных модификации схематически представлены на рис. 6.

Рис. 6. Виды метода ELISA.

АТ — антитела.

В ходе испытаний разных модификаций метода ELISA для подтверждения белков-кандидатов оптимальным признан непрямой метод ELISA, когда первым шагом в эксперименте является иммобилизация антигена на поверхности лунок полистирольного микропланшета (рис. 7). В качестве антигена была иммобилизована (за счет прямой адсорбции) сыворотка, выравненная во всех пробах по концентрации белка. Затем к ней добавляли детектирующее антитело, которое специфически связывалось с адсорбированным антигеном (одним из белков сыворотки), тем самым приводя к образованию комплекса «антиген — антитело». После серии отмывок добавляли вторичные антитела, конъюгированные с ферментом — пероксидазой хрена. Для развития окраски добавляли TMB (tetramethylbenzidine), инкубировали и останавливали реакцию STOP-раствором (H₂SO₄, 2М). Подробное описание методики опубликовано ранее [29].

Рис. 7. Схема непрямого метода ELISA для валидации белка-кандидата, выбранного с помощью метода микрочиповой технологии.

А/Т — антитела; ТМБ — тетраметилбензидин-3,3,5,5; БСА — бычий сывороточный альбумин.

Дизайн клинического исследования с применением микрочипов на основе антител для выбора циркулирующего маркера белковой природы

Следует тщательно подходить к выбору дизайна исследования с применением микрочиповой технологии на основе антител для изучения циркулирующих биомаркеров белковой природы (см. рис. 1). Как правило, в клинические исследования с анализом биомаркера(-ов) включают 100 и более участников. Несомненно, чем масштабнее клиническое исследование, тем точнее результаты сопутствующего статистического анализа. Мы рассматриваем подход к выбору биомаркера, основанный на результатах предварительного протеомного анализа с применением микрочипов на основе антител. В любом случае часто бюджетные ограничения вносят свои коррективы в дизайн, диктуя снижение как количества участников, так и количества тестируемых параметров. В случае предпочтения подхода с применением микрочипов в условиях ограниченного бюджета цель протеомного анализа фокусируется на выборе маркеров-кандидатов в малых группах (субгруппах). Для этого протеомное профилирование проводят в субгруппах, выбранных из когорты по принципу «случай — контроль» (рис. 8).

Рис. 8. Возможный дизайн клинического исследования с применением микрочиповой технологии.

В собственных исследованиях мы ориентировались на трехэтапный дизайн клинического исследования с выбором белкового маркера-кандидата на основе микрочипов (см. рис. 8).

Первый этап включает формирование малых групп «случай — контроль», которые выбирали из основной группы (когорты) участников в соответствии с поставленной целью. Малые группы выбирали таким образом, чтобы минимизировать влияние пола, возраста и других факторов возможного влияния на уровень циркулирующего маркера, выходящих за рамки цели исследования. Второй этап включает проведение протеомного анализа на основе матрицы антител в избранных малых группах «случай — контроль». Сравнительное протеомное профилирование, проведенное в группах «случай — контроль», позволяет выбрать оригинальные маркеры и перейти к третьему этапу исследования. Третий этап включает подтверждение (валидацию) маркеров-кандидатов с помощью альтернативного аналитического метода во всей когорте или в больших группах, выбранных из когорты. В случае выбора больших групп следует придерживаться того же принципа, что и для формирования малых групп, — «случай — контроль». Для подтверждения белков-кандидатов использовали метод твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) с помощью готовых наборов (при наличии) или с помощью самостоятельно разработанного метода Home ELISA (см. раздел выше), опирающегося на общий методологический каркас, предлагаемый производителем реагентов для ELISA [30].

Количество образцов сыворотки/плазмы для протеомного профилирования в малых группах может варьировать в соответствии с бюджетными ограничениями. Нет необходимости повторять, что чем многочисленнее группы для протеомного анализа, тем точнее выбор целевых маркеров. Возникает вопрос, сколько микрочипов может быть достаточно для выбора белков-кандидатов в малых группах «случай — контроль» при проведении протеомного профилирования. С учетом опыта собственных исследований в группу для проведения протеомного анализа мы рекомендуем включать не менее трех индивидов. Так, в нашем исследовании [31] контрольная группа для проведения протеомного профилирования была составлена из 3 человек. Группа с патологией (в данном случае с фибрилляцией предсердий — ФП), выбранная в качестве «случая», составила 7 человек. В ходе протеомного анализа с применением микрочипов на основе антител отмечено, что выбранные группы статистически значимо различались по капсидному белку аденовируса (Adenovirus Fiber), количество которого было выше у лиц группы с ФП. Это наблюдение свидетельствует о перенесенной ранее аденовирусной инфекции. Для подтверждения выдвинутой гипотезы сопоставили уровень IgG к аденовирусу в большой группе с ФП (n=91), выбранной случайным образом из когортного исследования по ФП (всего 197 участников), и подобранной к ней по полу и возрасту группе здорового контроля (n=94), выбранного из другого исследования с участием 208 добровольцев. Результаты статистического анализа показали, что доля лиц с положительной пробой на IgG к аденовирусу была в 3 раза выше в группе с ФП по сравнению с группой здоровых добровольцев. В результате проведения многофакторного анализа показано, что положительная проба на IgG к аденовирусу независимо связана с ФП, что может указывать на значимую роль аденовирусной инфекции в этиологии ФП [31].

В другом исследовании, в котором изучали белковые маркеры коронарного стеноза [29], численность малых групп «случай» и «контроль» для проведения протеомного анализа составляла по 9 человек в каждой группе. В группу «случай» включены пациенты со стенозом коронарных артерий (КА), а группу «контроль» — пациенты без стеноза КА по данным коронароангиографического обследования. Кроме того, протеомный анализ проводили в группе сравнения, составленной из 13 здоровых добровольцев. По результатам сравнительного протеомного анализа выбрано 4 белка-кандидата, неспецифичных в отношении пола, которые различались в группах «случай» и «контроль» в 4—23 раза. Наибольшие различия (более чем в 23 раза) показаны для белка межклеточной адгезии — кадгерина-Р, наименьшие различия (в 4 раза) — для белка nNOS (нейрональной NO-синтазы). Внутренняя валидация результата с помощью метода Home ELISA проведена в тех же малых группах (n=9), в которых проведен протеомный анализ. Внешняя валидация проведена также методом Home ELISA с той лишь разницей, что кадгерин-Р и nNOS определяли в больших группах пациентов со стенозом / без стеноза КА, выбранных из когорты пациентов (n=213), которым выполнена коронароангиография [29]. Количество пациентов в больших группах для внешней валидации составило 30 человек с коронарным стенозом и 31 человек без коронарного стеноза. По результатам Home ELISA, нормализованная оптическая плотность в среднем была статистически значимо выше во всех группах со стенозом КА по сравнению с группами без стеноза КА. Таким образом, внутренняя (в тех же группах, в которых проводили микрочиповый анализ) и внешняя (в больших группах) валидация с помощью метода Home ELISA, в котором использованы моноклональные антитела к указанным белкам, альтернативные по отношению к антителам, иммобилизованным на микрочиповой матрице, подтвердила статистически значимые различия для обоих белков-кандидатов — кадгерина-Р и nNOS [29].

Эффективность выбора белков-кандидатов с помощью микрочипов на основе антител

Прежде чем обратиться к подходу выбора маркера белковой природы с помощью микрочипов, у исследователя может возникнуть вопрос, каков процент успешного подтверждения белков-кандидатов. Мы не нашли других, помимо собственного опыта, источников для оценки эффективности микрочипов на основе антител. Для проведения такого анализа мы взяли за основу два недавно проведенных исследования: одно — с привлечением когорты пациентов, которым выполнена ангиография коронарных сосудов [29], второе — с привлечением когорты пациентов с ФП [31]. Частично эти исследования описаны в разделах выше. Добавим к этому ранее не представленные результаты, касающиеся сравнительного протеомного анализа в когорте пациентов с ФП (n=208), получивших лечение с применением катетерных технологий. По результатам годового наблюдения, из получивших лечение пациентов выделены группы с резистентной ФП (n=23) и компенсированной ФП (n=143). Для установления причин резистентности ФП провели сравнительный протеомный анализ в малых группах: численностью 3 человека для группы с резистентной ФП и численностью 4 человека для группы с компенсированной ФП. Необходимо отметить, что из-за отсутствия выраженных различий в белковых профилях при сравнении этих групп выбраны белки-кандидаты, содержание которых между группами различалось крайне незначительно (в диапазоне от 2 до 4 раз) по результатам микрочипового анализа. Из 6 протестированных белков-кандидатов 2 белка не прошли валидацию с помощью метода Home-ELISA в больших группах с компенсированной ФП (n=143) и резистентной ФП (n=23). Различия в содержании остальных 4 белков-кандидатов подтверждены либо с помощью готовых коммерческих наборов для анализа данных белков, либо методом Home ELISA, если готовые наборы для определения выбранного белка были недоступны. При обобщении результатов, полученных при исследовании когорт пациентов 1) со стенозом / без стеноза КА [29], 2) с ФП по сравнению с когортой здоровых добровольцев [31], 3) с резистентной/компенсированной ФП, всего из 9 протестированных белков-кандидатов подтверждено 7 белков.

На основании результатов исследований можно сделать следующие практические выводы: 1) численность группы для протеомного анализа может составлять не менее 3 человек; 2) четырехкратное различие в количестве белка между группами сравнения, установленное по результатам протеомного анализа, может быть достаточным для рассмотрения данного белка в качестве кандидата для дальнейшей успешной его валидации альтернативным методом (например, ELISA) в больших группах или во всей когорте; 3) эффективность выбора белков-кандидатов составляет не менее 80% при условии выбора белка-кандидата, имеющего незначительные количественные различия между группами сравнения, и 100% при условии выбора белка-кандидата, имеющего выраженные количественные различия между группами сравнения.

Сопоставление результатов, полученных с помощью микрочиповой технологии и ELISA

В литературе не сообщалось о проверке результатов, полученных с использованием микрочипов на основе антител с помощью альтернативного метода, в частности ELISA.

В ходе серии экспериментов мы подтвердили, что содержание белка, измеряемое с помощью микрочиповой технологии, коррелировало с содержанием белка в тех же пробах, полученным методом ELISA с использованием антител, альтернативных по отношению к антителам, использованным при изготовлении микрочипа [32]. Коэффициент ранговой корреляции Спирмена был относительно высоким (r=0,53, p<0,05). Протеомное профилирование с помощью микрочипов обеспечивает надежное полуколичественное определение белка.

Заключение

На сегодняшний день широта применения протеомного анализа для изучения биологических систем практически не знает границ, поэтому в настоящем обзоре обобщена лишь малая часть мирового опыта в области протеомного анализа, а также технологий, предназначенных для изучения протеома. Особое внимание уделено экономичной технологии микрочипового анализа протеома. Показано, что данная технология может служить инструментом для выявления новых биомаркеров различных заболеваний, указывающих на молекулярные механизмы патологического процесса. В настоящем обзоре суммирован собственный многолетний опыт исследований биомаркеров сыворотки крови с помощью микрочиповой технологии на основе антител, касающийся специфики дизайна клинического исследования, выбора маркеров для валидации и других практических аспектов. Автор надеется, что настоящий обзор может оказаться полезным для специалистов, вовлеченных в изучение механизмов различных заболеваний и способов их малоинвазивной диагностики.

Автор заявляет об отсутствии конфликта интересов.