До сих пор актуальна проблема лабораторной диагностики острых и смертельных отравлений чемерицей. Особое место такие отравления занимают в России, поскольку чемерицу используют в качестве средства народной медицины для лечения больных алкоголизмом в домашних условиях [1, 2]. В большинстве случаев родственники и больной пытаются скрыть факт употребления чемерицы, что усложняет постановку точного диагноза и препятствует своевременному оказанию медицинской помощи. Кроме того, отравления возможны при ошибочном приеме препаратов чемерицы внутрь, а также при употреблении различных видов растения в пищу [2, 3—6].
В настоящее время в химико-токсикологических лабораториях и бюро судебно-медицинской экспертизы отсутствует единый подход к диагностике таких отравлений, а постановка диагноза чаще всего основывается только на данных анамнеза. В современной отечественной литературе нет публикаций о статистическом анализе отравлений чемерицей, а приведенное в некоторых исследованиях число пострадавших не позволяет судить о масштабе проблемы [7, 8]. В связи с этим представляется необходимой разработка юридически значимой методики определения алкалоидов чемерицы в биологических образцах для проведения высокоточной лабораторной диагностики отравлений ею.
Цель исследования — анализ существующих методик идентификации алкалоидов чемерицы в биологических объектах.
Характеристика представителей рода чемерица
Род чемерица (Veratrum) относится к семейству лилейных (Liliaceae) и насчитывает от 17 до 45 видов, из которых на территории Российской Федерации встречается 7 видов [9]. В фармацевтической практике разрешено использовать только чемерицу Лобеля (Veratrum Lobelianum Bernh., кукольник) [10].
Из корневища с корнями чемерицы Лобеля в РФ производят чемеричную воду [11] — настойку чемерицы, разбавленную водой в соотношении 1:1. Ее используют наружно в качестве противопаразитарного средства при педикулезе. Чемерица Лобеля произрастает почти на всей территории РФ, за исключением южных районов европейской части. Также в РФ широко распространены другие виды чемерицы: белая (Veratrum album L.) и черная (Veratrum nigrum L.); встречаются зеленая (Veratrum viride Ait), Маака (Veratrum maackii Regel) и даурская [Veratrum dahuricum (Turcz.) Loes. fil.].
Все части растения у представителей рода чемерица ядовиты, так как содержат токсичные алкалоиды. Всего в растениях этого вида обнаружено более 200 алкалоидов, большинство из которых относится к группе циклопентанпергидрофенантрена [1, 12]. В стероидных алкалоидах чемерицы принято выделять 2 группы: соединения с типичным скелетом циклопентан-пергидрофенантрена (пасленовые алкалоиды — Solanum alkaloids) и соединения с нор-гомо-трансформацией колец С и D (C-нор-D-гомо-[14(13→12)-abeo] стероиды, или вератровые алкалоиды — Veratrum alkaloids) [1]. Помимо алкалоидов, в различных видах чемерицы содержатся дубильные и смолистые вещества, органические кислоты, сахара, крахмал [13].
Состав алкалоидов различных представителей чемерицы отличается, однако основные алкалоиды характерны для большинства видов растения [14]. Так, алкалоиды псевдоиервин и неогермитрин найдены в 5 видах чемерицы; верамарин, зигацин и рубииервин — в четырех; вератрамин и вератроилзигаденин — в шести; протовератрин А (проА), протовератрин В (проВ), вератрозин, 11-деоксоиервин, изорубииервин, гермин, верамин — в двух, а иервин выделен почти из всех видов чемерицы [15].
Токсикология алкалоидов черемицы
Чемерица Лобеля является ядовитым сырьем, для приема внутрь лекарственные препараты из корневищ с корнями не используют. Согласно Инструкции по медицинскому применению чемеричной воды (РУ №ЛП-003627), «при случайном приеме внутрь более 100 мл препарата возможен летальный исход». При употреблении внутрь «1 г свежего растения» также возможен летальный исход [13].
Алкалоиды чемерицы оказывают кардиотоксичное действие [7, 16]. Они воздействует на хемо- и механорецепторы сердца, вызывая нарушения ритма и проводимости сердца [7]. Кроме того, алкалоиды чемерицы увеличивают проницаемость натриевых каналов клеток, вызывая тем самым деполяризацию мембран нейронов и кардиомиоцитов [2]. Провератрин и вератрамин оказывают гипотензивное действие, а также вызывают брадикардию путем увеличения тонуса блуждающего нерва [1, 17]. Повышение тонуса блуждающего нерва в свою очередь вызывает триаду реакций, называемых рефлексом Бецольда — Яриша. К ним относят гипотензию, брадикардию и апноэ [1, 2]. Показано, что алкалоиды чемерицы черной обладают острой и хронической гепатотоксичностью, что значительно ограничивает применение этого растения в традиционной китайской медицине [18].
Токсическое действие алкалоидов чемерицы проявляется практически сразу (через 30 мин — 2 ч) после приема внутрь, так как они в основном всасываются в полости рта, пищеводе и желудке [2]. Действие алкалоидов продолжается 4—6 ч [19].
Клиническая картина острого перорального отравления чемерицей включает различные симптомы. Первые признаки отравления — жжение во рту, тошнота, многократная рвота с абдоминальной болью, мышечная слабость, головная боль, головокружение, слюнотечение, нарушение зрения, парестезия, диарея. Затем появляются симптомы, характерные для сердечно-сосудистых нарушений: брадикардия, гипотензия, аритмии, нарушение сердечной проводимости. Тяжелые отравления приводят к клонико-тоническим судорогам с развитием коллапса и к смертельному исходу [1, 12, 20].
Без лечения клинические симптомы могут наблюдаться от 5 до 10 дней, а в случае тяжелых отравлений привести к летальному исходу [21, 22]. При своевременном лечении клинические проявления отравления регрессируют уже через 24 ч [23].
Методы обнаружения алкалоидов чемерицы в биологических объектах
В зарубежной литературе описаны методики обнаружения алкалоидов чемерицы в биологических объектах с помощью инструментальных методов анализа. Большинство из них посвящены идентификации и определению основных алкалоидов чемерицы и их метаболитов в образцах, полученных при проведении доклинических исследований [24—27]. В настоящее время активно изучается фармакологическое и патофизиологическое действие алкалоидов чемерицы черной, широко применяемой в традиционной китайской медицине [24—26]. В доступной зарубежной литературе методики определения алкалоидов чемерицы в биологических объектах человека при остром или смертельном отравлении приведены в трех публикациях [19, 22, 23]. В большинстве методик используется высокоэффективная жидкостная хроматография с масс-селективным детектированием (ВЭЖХ-МС), так как данный метод позволяет обнаружить вещества со свойствами, характерными для алкалоидов чемерицы (большая молекулярная масса, высокие термическая лабильность и полярность).
В 2001 г. Y. Gaillard и соавт. [19] опубликовали отчет о двух случаях смертельного отравления чемерицей белой. В цельной крови трупов мужчин, найденных через 1 мес после их смерти, обнаружили 0,17 и 0,4 нг/мл вератридина и 0,32 и 0,48 нг/мл цевадина. Вератридин и цевадин выявили также в желудочном соке и семенах чемерицы, найденных в желудках умерших. Предварительную идентификацию алкалоидов проводили с помощью ВЭЖХ с фотодиодным детектированием, а для подтверждения результатов и количественной оценки разработали методику ВЭЖХ-МС.
T. Groboch и соавт. [22] описали случай острого отравления чемерицей белой после употребления алкогольного напитка домашнего производства. В сыворотке крови пострадавшего обнаружили 1162 нг/л проА и 402 нг/л проВ. Вератридин, цевадин и иервин не нашли. В образце выпитого напитка установили только наличие проА и проВ. Определение проводили методом ВЭЖХ-МС/МС.
В 2018 г. M. Anwar и соавт. [23] сообщили о случае острого отравления семейной пары североамериканским видом чемерицы мелкоцветковой (Veratrum parviflorum), которую они ошибочно приняли за дикий лук (Allium tricoccum). Использование ВЭЖХ в сочетании с масс-спектрометрией высокого разрешения позволило обнаружить в плазме крови пострадавших веразин, вератрамин, вератридин и циклопамин.
В зарубежной литературе приводится также способ идентификации чемерицы в случае острого отравления с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени [28]. Метод занимает всего 30—60 мин. Предел обнаружения составляет 10 пг ДНК растения, что позволяет применять данный метод для высокоточного экспресс-анализа промывных вод желудка. К сожалению, такой подход помогает установить причину отравления только в тех случаях, когда человек употребляет внутрь само растение, а не вытяжки (экстракты) из него.
В СССР проводили исследования по изолированию вератрина из трупного материала [29]. В качестве стандартного образца использовали «вератрин» — смесь алкалоидов, выделенных из семян сабадиллы (Schoenocaulon officinale). Наличие вератрина в биологических образцах подтверждалось хроматографией в тонком слое сорбента (ТСХ), на основе реакций окрашивания (с концентрированными хлористоводородной и серной кислотами) и УФ-спектрофотометрии в диапазоне длин волн 220—320 нм. Для проведения ТСХ применяли хроматографические пластинки с закрепленным слоем силикагеля КСК или ЛС, а также последовательно две системы растворителей — бензол-ацетон (8:2) и бензол-диоксан-25% раствор аммония гидроксида (7:2:1). Детектирующим реагентом служил реактив Драгендорфа по Шталю. Наличие вератрина при проведении УФ-спектрофотомет- рии подтверждалось в случае двух максимумов абсорб- ции: при λ=261—263 нм и λ=291—293 нм (при растворе- нии образца в этаноле) или при λ=264 нм и λ=294 нм (при растворении образца в 1% растворе этанола в хлороформе).
В современной отечественной литературе приведен один случай острого отравления чемерицей Лобеля с инструментальной диагностикой токсиканта [30]. В крови пострадавшего обнаружили алкалоиды иервин и протовератрины А и В с помощью ЖХ-МС. Данные алкалоиды выбрали для целевого поиска в крови после анализа препарата «Чемеричная вода» в тех же условиях ВЭЖХ-МС/МС. Эта методика позволяет проводить только качественный анализ, без количественного определения аналитов. В таблице представлен обзор основных характеристик методик определения алкалоидов чемерицы в биологических объектах.
Таблица. Сравнительный анализ методик определения алкалоидов чемерицы в биологических объектах
Table. Comparative analysis of methods for Veratrum alkaloids determination in biological samples
| Метод; детектор; объект определения; биообъект | Пробоподготовка | Хроматографические колонки; температура термостата колонки; состав подвижной фазы | нПКО |
| ВЭЖХ-МС/МС; QTrap; вератрамин; плазма крови [24] | Осаждение белков: 60 мкл плазмы + 6 мкл ВС (иервин) + 264 мкл ацетонитрила с 0,1% муравьиной кислотой; выпаривание 270 мкл супернатанта; реконструирование в 20 мкл ацетонитрила с 0,1% муравьиной кислотой | Waters Symmetry C18 (150×2,1 мм; 3,5 мкм); 25 °C; А: 0,1% муравьиная кислота, В: ацетонитрил | 1 нг/мл |
| ВЭЖХ-МС/МС; QQQ; псевдоиервин, вератрозин, иервин, вератрамин, верамарин, вератроилзигаденин; плазма крови [27] | Осаждение белков и жидкость-жидкостная экстракция: 100 мкл плазмы + 300 мкл смеси н-бутанол/ацетонитрил/ацетат аммония (25:70:5, v/v/v) + 20 мкл ВС (дигоксин); выпаривание супернатанта; реконструирование в 100 мкл ацетонитрила | Chrom Matrix HP amide (100×3,0 мм; 5 мкм); 35 °C; А: 0,01 мМ муравьиная кислота, B: ацетонитрил | 5 нг/мл для вератрозина и вератрамина; 1 нг/мл для остальных алкалоидов |
| ВЭЖХ-МС; Q; цевадин, вератридин; трупная кровь [19] | Жидкость-жидкостная экстракция в экстракционных пробирках Toxi-Lab Tubes A: 2 мл цельной крови + 2 мл деионизированной воды + 10 мкл ВС (лидокаин); выпаривание органической фазы; реконструирование в 30 мкл смеси ацетонитрил/вода (50:50, v/v) | Waters Symmetry C8 (150×2,1 мм; 5 мкм); 25 °C; А: 2 мМ аммония формиата (pH 3,0), В: метанол | 0,15 нг/мл для вератридина; 0,25 нг/мл для цевадина |
| ВЭЖХ-МС/МС; QQQ; проА, проВ, вератридин, цевадин, иервин; сыворотка крови [22] | Жидкость-жидкостная экстракция: 1 мл сыворотки крови + 0,4 мл экстракционной смеси [50 мкл ВС (фентанил-d5) в 50 мл дихлорметана]; выпаривание 0,3 мл органической фазы; реконструирование в 100 мкл метанола | Varian Pursuit 5 PFP (150×3,0 мм; 5 мкм); 60 °C; А: метанол/0,1% уксусная кислота с 10 мМ аммония ацетатом (97:3), B: 0,1% уксусная кислота с 5 мМ аммония ацетатом/метанол (90:10) | 0,1 нг/мл |
| ВЭЖХ-МС; QToF; плазма крови [23] | Жидкость-жидкостная экстракция в концентрирующих патронах: 1 мл плазмы крови + 1 мл деионизированной воды + 10 мл хлороформа; выпаривание; реконструирование в 200 мкл этанола | Thermo Acclaim 120 C18 (150×2,1 мм; 3 мкм); 25 °C; А: 0,1% муравьиная кислота/ацетонитрил (95:5), B: ацетонитрил с 0,1% муравьиной кислотой | Только качественное определение |
| ВЭЖХ-МС; QToF; ITrap; иервин, проА, проВ; кровь [30] | Жидкость-жидкостная экстракция смесью 1-хлорбутан/изоамиловый спирт (99:1, v/v) в присутствии избытка натрия гидрокарбоната; выпаривание; реконструирование в смеси ацетонитрил/вода (1:1, v/v) | Zorbax Eclipse Plus C18 (100×2,1 мм; 3,5 мкм); Acclaim RSLC 120 C18 (100 ×2,1 мм; 2,2 мкм) | То же |
Примечание. QQQ — тройной квадрупольный детектор; Q — одноквадрупольный детектор; QTrap — гибридная система тройной квадруполь — линейная ионная ловушка; ITrap — ионная ловушка; QToF — времяпролетный детектор; ВЭЖХ-МС/МС — высокоэффективная жидкостная хроматография с тандемным масс-селективным детектированием; ВС — внутренний стандарт; нПКО — нижний предел количественного обнаружения.
Note. QQQ — Triple Quadrupole Detector; Q — single quadrupole detector; QTrap — hybrid system of triple quadrupole — linear ion trap; ITrap — ion trap; QToF — time-of-flight detector; HPLC-MS/MS — high performance liquid chromatography with tandem mass selective detection; BC — internal standard; nPCO — lower limit of quantitative detection.
Вывод
1. В настоящее время в практике химико-токсикологических лабораторий и бюро судебно-медицинской экспертизы отсутствует единый аналитический подход к лабораторной диагностике отравлений чемерицей.
2. Чемерица как растительное сырье представлено несколькими видами с не всегда стандартным и одинаковым набором алкалоидов, что создает трудности при установлении причины отравления.
3. Актуальны разработка и валидация методики определения алкалоидов чемерицы в различных биологических объектах с помощью высокочувствительных и высокоспецифичных инструментальных методов анализа.
4. В качестве метода анализа целесообразно использовать ВЭЖХ-МС/МС как наиболее чувствительный и специфичный инструментальный метод, соответствующий характеристикам алкалоидов чемерицы.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
The authors declare no conflicts of interest.