АЛПГ — атипично локализованные предшественники гранулоцитопоэза

ВОЗ — Всемирная организация здравоохранения

ГНЦ — Гематологический научный центр

ДГ — дисплазия гранулоцитарного ряда

ДИ — доверительный интервал

ДМ — дисплазия мегакариоцитарного ряда

ДЭ — дисплазия эритроидного ряда

КМ — костный мозг

КР — костномозговая ремиссия

МДС — миелодиспластический синдром

ОМЛ — острый миелоидный лейкоз

ПР — полная ремиссия

РАИБ-1 — рефрактерная анемия с избытком бластов 1

РАИБ-2 — рефрактерная анемия с избытком бластов 2

РЦМД — рефрактерная цитопения с мультилинейной дисплазией

ЭР — эритроидный росток

IPSS — International Prognostic Scoring System

IWG — International Working Group

Патогенез миелодиспластического синдрома (МДС) характеризуется парадоксальным сочетанием двух процессов: повышенной пролиферативной активностью кроветворных клеток (как, например, при острых миелоидных лейкозах — ОМЛ) и повышенным апоптозом клеток [1, 2]. У большинства больных с МДС апоптозу подвержено более 75% гемопоэтических клеток во всех клеточных линиях (включая клетки стромы) [3]. Наличие большого числа клеток, находящихся одновременно в синтетической фазе митоза и процессе апоптоза, является специфическим признаком МДС, связанным с неэффективностью кроветворения, в результате чего возникают одно-, двух- и трехростковые цитопении [4].

Появление признаков дисплазии кроветворных клеток служит морфологическим отражением неэффективности гемопоэза при МДС, а характер этой дисплазии (одна-, двух- и трехлинейная) определяет вариант МДС [5, 6].

Разнообразные характеристики миелодисплазии на фоне специфической терапии играют важную роль для оценки эффективности лечения больных с МДС. Положительный результат лечения (особенно достижение полной ремиссии) должен характеризоваться редукцией миелодиспластических проявлений, а именно: исчезновением псевдопельгеровской аномалии нейтрофилов, выраженной дисплазии мегакариоцитов, кольцевых сидеробластов. Отметим, что слабый мегалобластоидный оттенок в клетках эритроидного ряда не рассматривается как дисплазия, поскольку может появляться под воздействием лечения [7].

Применение гипометилирующих препаратов, таких как децитабин и азацитидин, способствует восстановлению дифференцировки клеток и, следовательно, восстановлению эффективности кроветворения [8].

Во время лечения децитабином важна оценка как количественных, так и качественных изменений клеток кроветворной ткани. Обнаружение диспластичных клеток в мазках пунктата костного мозга (КМ) может быть весьма затруднено у больных с гипоплазией КМ, которая встречается в дебюте заболевания примерно у каждого пятого больного [9], а также может появиться в результате терапевтического воздействия. Важно отметить, что гипометилирующие препараты, используемые при лечении больных с МДС, тоже могут приводить к выраженному миелосупрессивному эффекту [10—12].

Общий ответ на лечение децитабином больных с МДС в группах промежуточного и высокого риска по Международной прогностической шкале (International Prognostic Scoring System — IPSS) составляет 30—73%, а частота достижения полной ремиссии (ПР) — 9—34% [8, 10, 11].

Целью настоящей работы является изучение характера миелодиспластических проявлений в различных линиях гемопоэза у больных с МДС на разных этапах лечения децитабином, проводимого в Гематологическом научном центре МЗ РФ (ГНЦ) [13]. Данное исследование проведено в отделении химиотерапии гемобластозов, депрессий кроветворения и трансплантации костного мозга ГНЦ [14—16]. Исследование охватывает период с 2007 по 2010 г. и является проспективным. В изучаемую группу вошли все больные, при лечении которых использован децитабин: 11 больных с первичным МДС (доля бластных клеток в КМ составляла 1,2—12,5%) и 2 больных с рецидивом ОМЛ, развившегося из МДС (доля бластных клеток в КМ составляла 8,4—14,2%); 5 (39%) мужчин и 8 (61%) женщин. Медиана возраста пациентов составила 47 лет (от 24 до 76 лет). Средний период от момента диагностики МДС до начала лечения децитабином составил 6,5 мес (от 1 до 39 мес). До назначения децитабина специфическая терапия по поводу заболевания 9 больным не выполнялась, 3 пациентам проводилось лечение малыми дозами цитарабина, одной больной (с рецидивом ОМЛ) проводили лечение по программе «7+3» с идарубицином и малыми дозами цитарабина; 2 больным выполнена спленэктомия.

Диагноз МДС установлен в соответствии с классификацией Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) от 2001 г. [5]. Поскольку основным нежелательным эффектом децитабина является миелосупрессия, обнаружение признаков дисплазии кроветворных клеток проводилось при совокупном анализе данных миелограммы и трепанобиоптата пациента.

Распределение больных по нозологическим формам непосредственно перед применением децитабина было следующим: рефрактерная цитопения с мультилинейной дисплазией (РЦМД) была у 1 больного, рефрактерная анемия с избытком бластов 1 (РАИБ-1) — у 3, рефрактерная анемия с избытком бластов 2 (РАИБ-2) — у 7, рецидив ОМЛ (развившийся из МДС неклассифицируемого) — у 1, РАИБ 2 с трансформацией в ОМЛ — у 1.

Изменения кариотипа выявлены у 9 пациентов: аномалия 3-й хромосомы у 1, аномалия 7-й хромосомы у 1, аномалия 8-й хромосомы у 1, две хромосомные аномалии (включая 7-ю и 8-ю хромосомы) у 3, множественные хромосомные нарушения у 2 больных. У 4 пациентов кариотип был нормальным.

Распределение больных по группам риска (по IPSS) [17] было следующим: у 2 больных промежуточный риск 1-й группы, у 5 — промежуточный риск 2-й группы, еще у 5 высокая группа риска. У 1 больного группа риска не определялась.

Всем пациентам выполняли цитологическое и гистологическое исследования КМ и клинический анализ крови как до назначения децитабина, так и во время лечения (через 2, 4 и 8 курсов). Все исследования проведены 13 больным после 2 курсов, 7 больным — после 4 курсов и 4 больным — после 8 курсов. Всего проанализировано 75 пунктатов и 67 трепанобиоптатов КМ. После 4 курсов децитабина (выполнены у 7 из 13 больных) проведена оценка эффективности терапии в соответствии с принятыми критериями, включающая морфологические и цитологические исследования кроветворной ткани. Для оценки признаков миелодисплазии исследовали мазки пунктата КМ и гистологические препараты трепанобиоптатов (из правого и левого крыла подвздошной кости в дебюте заболевания и из одного крыла — в дальнейшем).

Цитологическое исследование пунктата КМ включало подсчет 500 клеток. Оценку дисплазии элементов КМ проводили в соответствии с критериями, предложенными J. Goasquen и соавт. [18] и принятыми в качестве стандарта в классификации ВОЗ (2001 г.). Дисплазия эритроидного (ДЭ), гранулоцитарного (ДГ) и мегакариоцитарного (ДМ) рядов устанавливалась при наличии более 10% измененных форм [19].

В гранулоцитарном и эритроидном ростках анализировали не менее 100 клеток, в мегакариоцитарном — не менее 20 клеток. Для оценки дисплазии в эритрокариоцитах подсчитывали количество клеток с мегалобластоидными признаками, с 2 ядрами и более, с уродливой формой ядра, базофильными включениями в цитоплазме, а также клетки в состоянии кариорексиса. В гранулоцитарном ряду определяли количество клеток с гипогрануляцией цитоплазмы, с гипосегментированным ядром (пельгероидные формы), а также с гиперсегментированным ядром (более 5 сегментов). Дисплазию в мегакариоцитах оценивали при подсчете количества микроформ, клеток с множественными раздельно расположенными сегментами ядра, а также с одно- и двуядерными формами. Случаи со сниженной клеточностью различных ростков гемопоэза (при которых подсчитать количество клеток с признаками дисплазии не представлялось возможным) рассматривали как не имеющие дисплазии [18].

Децитабин вводили (в течение часа) всем больным в дозе 20 мг/м² внутривенно один раз в сутки курсом 5 дней. Курсы проводили каждые 4 нед. Число курсов составило от 1 до 22. Оценку эффективности терапии проводили после 4-го курса. При прогрессировании заболевания или развитии тяжелых инфекционных осложнений, связанных с миелосупрессией, терапию децитабином прекращали.

Результаты ответа на терапию оценивали в соответствии с критериями интернациональной рабочей группы International Working Group (IWG) для МДС [20].

ПР констатировали при нормализации клеточного состава КМ и периферической крови: содержание бластных клеток в КМ не более 5%, концентрация гемоглобина (Hb) не менее 100 г/л, количество гранулоцитов 10⁹/л и более, количество тромбоцитов 100·10⁹/л и более. Учитывали только устойчивые показатели, т.е. сохранявшиеся в течение не менее 4 нед. Наличие дисплазии при доказанной ПР допускалось [7].

КР (снижение количества бластных клеток до 5% и менее) констатировали независимо от нормализации состава периферической крови. Продолжительность ответа принимали равной интервалу времени от первого подтверждения наличия ответа до прогрессирования заболевания.

Статистический анализ. При статистической обработке данных для оценки различия групп использовали двусторонний двух- и одновыборочный (парный) варианты критерия Стьюдента (для случая непрерывных показателей) и метод таблиц сопряженности с применением точного критерия Фишера (для случая номинальных показателей); при оценке согласия двух различных методов измерения дисплазии клеток использовали индекс каппа Коэна. Эмпирические распределения показателей представлены преимущественно в виде медиан и размаха наблюдений в выборке (минимальное — максимальное значения). Порог статистической значимости (р) принят равным 0,05.

Длительность наблюдения пациентов, получавших децитабин, составила от 80 до 120 дней. ПР достигнута у 6 пациентов: у 1 — после 1 курса децитабина, у 4 — после 4 курсов (у одного из них после 2 курсов достигнута КР) и у 1 пациента — после 8 курсов (после 3 курсов у него достигнута КР). У 3 пациентов из 6 имелся диагноз РАИБ-2, у других 3 — один из следующих диагнозов: РАИБ-1, РАИБ-2 с трансформацией в ОМЛ и рецидив ОМЛ, развившийся из МДС. В дальнейшем у 4 из 6 больных заболевание прогрессировало: после 6, 8, 8, 6 курсов через 7,6, 12,4, 12,7 и 29 мес от начала лечения соответственно. У 2 больных сохраняется ПР: у одного продолжительностью 14 мес, у другого — 17 мес. Медиана продолжительности ремиссии у больных составила 12,8 мес (от 2,7 до 24 мес).

Лечение прервано у 5 пациентов (у 1 после первого курса, у 4 после 2 курсов): у 2 развились тяжелые инфекционные осложнения, еще у 2 наблюдалось прогрессирование заболевания в ОМЛ, одна больная скончалась от инфекционных осложнений. Резистентность к проводимой терапии констатирована у 2 больных: у одного после 3 курсов, у другого после 4.

Диспластические изменения (показатель, на котором основана цитологическая классификация МДС) в клетках различных линий гемопоэза обнаруживались при исследовании как пунктатов, так и трепанобиоптатов. Для клеток эритроидного ряда цитологический и гистологический методы исследования оценивали частоту дисплазий с высокой степенью согласия (каппа Коэна 0,81 при 95% доверительном интервале — ДИ от 0,74 до 0,89; р=0,05). Диспластические изменения до начала терапии выявлены во всех трех ростках кроветворения. У 2 пациентов из-за резкого сужения эритроидного ростка (ЭР) кроветворения оценить проявления дисплазии было невозможно (табл. 1).

Отметим, что признаки ДГ по данным миелограмм наблюдались в 1,5 раза чаще (р=0,05), чем по данным трепанобиоптатов. В результате лечения децитабином число больных с признаками миелодисплазии (включая сочетанную двух- и трехлинейную дисплазию) уменьшалось по данным обоих видов исследования. Снижение дисплазии коррелирует с ответом на лечение децитабином. Относительное количество кроветворных клеток с диспластическими изменениями оценивали по пунктату КМ (морфометрические измерения в трепанобиоптатах не проводили). При малой выраженности миелодисплазии в аспиратах КМ признаки дисплазии в трепанобиоптатах выявлялись примерно в 2 раза реже (р=0,05). В 2 случаях гистологическая картина в трепанобиоптатах из правой и левой подвздошной ости отличалась по клеточности КМ и степени выраженности миелодиспластических изменений. Данные по количеству клеток с признаками миелодисплазии в пунктатах КМ приведены в табл. 2.

До лечения уровень дисплазии в мегакариоцитарном ростке кроветворения был выше, чем в гранулоцитарном ростке и ЭР (33±10, 21±8 и 24±8% соответственно). В случае, если эффект на терапию получен, у больных на всех этапах лечения наблюдалось уменьшение (р=0,05) количества клеток с признаками дисплазии (во всех клеточных линиях). У больных с резистентной к лечению формой заболевания или с дальнейшим его прогрессированием количество диспластичных форм увеличивалось статистически значимо (p=0,05).

Каждая из линий гемопоэза тщательно проанализирована. При сравнении групп больных с нормальным или суженным (сумма всех эритроидных клеток КМ меньше 27%) ЭР с группой больных с расширенным (больше 27%) ЭР выявлено, что эти группы статистически значимо различаются по выраженности (оцениваемого по доле диспластичных клеток эритроидного ростка кроветворения) дизэритропоэза: 13 (0—32) против 31 (20—52); р=0,05. В то же время концентрация гемоглобина в этих двух группах статистически значимо не различалась (табл. 3).

Таким образом, оказалось, что эритропоэз у больных с МДС одинаково неэффективен как при нормальном или суженном, так и при расширенном ЭР.

Мы также изучали вопрос о том, какие именно проявления дисплазии наиболее часто обнаруживались в различных клеточных линиях. Частота обнаружения отдельных признаков дизэритропоэза на основании изучения морфологии эритрокариоцитов по данным миелограмм на разных этапах лечения приведена в табл. 4.

В клетках эритроидного ряда до лечения обнаруживались мегалобластоидный оттенок, базофильные включения в цитоплазме и несколько реже кариорексис и многоядерные формы. После 2 курсов терапии более чем в 1,5 раза (р=0,05) сократилось количество многоядерных эритрокариоцитов; после 4 курсов уменьшились (р=0,04) все проявления дизэритропоэза. Отмечено, что 8 курсов децитабина проведено только 4 больным, отдельные проявления дизэритропоэза наблюдались у 2 больных. Положительная динамика отмечалась как в уменьшении числа больных с проявлениями дизэритропоэза, так и в снижении относительного количества диспластичных форм. Таким образом, большинство клеток с признаками дизэритропоэза характеризовалось мегалобластоидным оттенком (табл. 5).

В результате лечения, по данным двух видов исследования, картина ДЭ становилась менее выраженной и проявлялась обнаружением отдельных мегалобластоидных форм и единичных двуядерных форм, что объясняется уменьшением количества клеток патологического клона в эритроидном ряду кроветворения. Надо отметить, что такая положительная динамика имелась лишь у тех больных, у которых гипометилирующая терапия оказалась эффективной.

Морфологическое исследование признаков дисплазии гранулоцитов проводилось перед началом терапии и в процессе лечения. Данные о выявлении различных признаков ДГ представлены в табл. 6.

У больных с МДС достоверно чаще выявляли гипо- и агранулярные формы нейтрофилов, особенно миелоцитов и метамиелоцитов (у 9) и обнаруживали клетки с гипосегментацией ядра, т.е. с псевдопельгеровской аномалией (у 10). Гиперсегментация ядра имелась у 4 больных. Выявлялись лишь единичные формы гиперсегментированных нейтрофилов. По мере лечения число больных, у которых обнаруживались клетки с признаками ДГ, значительно сократилось. Доля диспластичных клеток в общей популяции клеток гранулоцитарного ряда в зависимости от стадии терапии представлены в табл. 7.

Максимальная доля гипогранулярных форм до лечения составляла примерно 65%, а форм с гипосегментацией ядра — 32%. Выраженность дисплазии клеток гранулоцитарного ряда у больных, у которых лечение было эффективным, после 4 курсов уменьшилось на 5—10% (р=0,05; см. табл. 7). Гиперсегментация ядра выявлялась в небольшом количестве клеток. У больных с резистентной формой МДС отмечалось увеличение (р=0,05) количества диспластичных форм среди клеток гранулоцитарного ряда. Нужно отметить, что оценка выраженности дисплазии в клетках гранулоцитопоэза по трепанобиоптатам возможна лишь по таким параметрам, как степень их дифференцировки и изменение типичной локализации в костномозговых полостях. В трепанобиоптатах выявлялись атипично локализованные предшественники гранулоцитопоэза (АЛПГ), т.е. клетки гранулоцитопоэза с признаками нарушения дифференцировки и расположенные вне зон эндооста (до лечения эти особенности выявлялись у 6 из 13 больных). Ремиссия несколько чаще наблюдалась у больных, у которых АЛПГ не определялись. Так, ПР получена у 2 из 6 больных с выявленными АЛПГ и у 4 из 7 больных, у которых АЛПГ отсутствовали. В результате терапии децитабином признаки ДГ у большинства больных в аспиратах не обнаруживались или были слабовыражены. В трепанобиоптатах после лечения единичные АЛПГ выявлялись у 2 больных перед трансформацией в ОМЛ, у 1 больного мелкие единичные группы АЛПГ в течение ремиссии периодически определялись после 13, 19 и 21-го курсов терапии. Эти данные позволяют предположить, что восстановление нормального гранулоцитопоэза происходит преимущественно у больных, достигших ремиссии заболевания.

Характеристика диспластических изменений в мегариоцитарном ряду по данным пунктата КМ затруднительна, поскольку при лечении децитабином у большинства больных мегакариоциты в пунктате не определялись; результаты исследований у всех больных (с учетом пациентов, у которых отсутствовали мегакариоциты и которые рассматривались как не имеющие дисплазии) приведены в табл. 8.

До лечения децитабином ДМ отмечена у 9 больных, у 4 количество мегакариоцитов в пунктате КМ было недостаточным для анализа (поэтому они условно приняты в число больных без признаков ДМ). До лечения дисмегакариоцитопоэз характеризовался микроформами мегакариоцитов, клетками с гиполобуляцией ядра и реже клетками с множественно сепарированным ядром. Диспластические изменения в клетках мегакариоцитарного ряда чаще определяли при анализе трепанобиоптатов (после лечения в пунктатах КМ у многих больных количество мегакариоцитов было снижено или они отсутствовали). Так, после проведения 2 курсов терапии децитабином у 9 пациентов в аспиратах КМ мегакариоциты либо отсутствовали, либо определялись в очень небольшом количестве (после 4 курсов мегакариоциты оценены у 2 из 7 пациентов, а после 8 курсов — у 2 из 4). В результате лечения количество мегакариоцитов (при совокупном анализе пунктатов и трепанобиоптатов КМ) с признаками дисплазии уменьшилось. До терапии диспластичные формы мегакариоцитов определялись у 10 из 13 больных, после 2 курсов дисмегакариоцитопоэз сохранялся у 8 больных, после 4 курса — у 1 из 7 больных, у 2 определялись немногочисленные диспластичные формы. После 8 курсов терапии у 1 больного сохранялось преобладание микроформ, у 2 выявлялись единичные микроформы мегакариоцитов, еще у 1 больного мегакариоцитарный росток был нормальным. Лечение децитабином привело как к уменьшению числа больных с признаками ДМ, так и к снижению (р=0,05) количества мегакариоцитов с признаками дисплазии, что указывает на частичное восстановление мегакариоцитарного ростка.

Впервые проведен динамический анализ (по данным пунктатов и трепанобиоптатов КМ) морфологических изменений клеток кроветворной ткани у больных с МДС при лечении препаратом с гипометилирующим действием децитабином. Терапевтическая эффективность (общий ответ: ПР+КР) этого препарата составила 46%. Выраженное уменьшение признаков дисплазии наблюдалось во всех линиях клеток, особенно в эритроидном ряду, где имелась значительная редукция диспластических изменений вплоть до полного их исчезновения. В ремиссии заболевания обнаруживались лишь единичные формы эритрокариоцитов с мегалобластоидным оттенком, несмотря на сохраняющееся расширение ЭР. В гранулоцитарном ряду в результате лечения децитабином нормальный гранулоцитопоэз восстановился практически у всех больных, достигших ремиссии. Признаки ДГ в аспиратах у большинства больных не обнаруживались или были слабовыражены, в трепанобиоптатах же выявлялись лишь единичные АЛПГ. Значительное уменьшение доли диспластичных форм отмечено и в мегакариоцитарном ряду.

Таким образом, применение децитабина у большинства больных, у которых была констатирована ремиссия заболевания, приводило к дифференцирующему эффекту с выраженным снижением проявлений дисмиелопоэза во всех линиях клеток, что косвенно указывает на снижение активности патологического клона.