КЛСМ — конфокальная лазерная сканирующая микроскопия

КЦ — кератиноциты

МН — микроносители

ОП540 — оптическая плотность при длине волны 540 нм

ФБ — фибробласты

Ф-МН — МН на основе фиброина

ФЖ-МН — МН на основе композитного материала, содержащего фиброин и 30% желатина

ФСБ — фосфатно-солевой буфер

GFP — зеленый флуоресцентный белок

TRITC — тетраметилродаминизотиоцианат

Заживление кожных ран — сложный, протекающий на различных структурных уровнях, процесс, в результате которого происходит устранение повреждения с полным или частичным восстановлением нормальной ткани. Нарушение процесса заживления кожных ран негативно влияет на функциональные характеристики, а также внешний вид кожи. Существующие методы восстановления кожного покрова совершенствуются с использованием клеточных технологий. Подобная клеточная терапия перспективна в лечении таких дефектов кожи, как ожоги, глубокие и длительно незаживающие раны, трофические язвы, а также для косметологической коррекции рубцов и исправления возрастных изменений кожи [1]. Одним из традиционных методов является введение компетентных для регенерации клеток (кератиноцитов — КЦ и фибробластов — ФБ) в области кожных повреждений [2]. С этой целью клетки наращивают в достаточном количестве in vitro, а затем вносят в травмированные участки кожи. Зачастую при снятии адгезивных культур с подложек культивирования, например при ферментативной обработке эпителиальных пластов, происходят выраженное повреждение КЦ и значительная контракция пласта. Одним из способов преодоления проблемы является культивирование клеток на биодеградируемых субстратах с последующим введением витализированных носителей в организм. В качестве материала для приготовления таких носителей предпочтение отдается изделиям на основе полимеров природного происхождения [3]. Одним из таких материалов, обладающих свойствами, необходимыми для культивирования клеток, является фиброин — основной компонент шелка тутового шелкопряда [4—7]. Работы по исследованию фиброина как субстрата для культивирования клеток, задействованных в регенерации кожных ран, показывают перспективность его использования: фиброин шелка эффективно поддерживает адгезию и пролиферацию клеток эпидермиса и ФБ [8—12].

Важной характеристикой субстрата является не только материал, но форма и размер носителя. Для развития методов клеточной терапии перспективно использование микроносителей (МН) — небольших частиц от 50 до 400 мкм [13]. Применение М.Н. для культивирования клеток, а также для доставки клеток в область повреждений обладает рядом преимуществ. МН создают благоприятные условия для развития клеток в трехмерном пространстве и приближают их к состоянию in vivo [14]. МН являются удобной формой для инъекционного введения, что позволяет исключить травматичные для клеток стадии снятия культуры с подложки.

Цель данной работы — оценка применимости МН, изготовленных из фиброина, для культивирования ФБ и КЦ. В дальнейшем будет исследован эффект интрадермального введения витализированных МН в модели полнослойной кожной раны.

Матриксы из фиброина и композитные матриксы на основе фиброина с 30% содержанием желатина получали по методике, описанной ранее [6]. Из матриксов путем криоизмельчения получены МН — соответственно на основе фиброина (Ф-МН) и на основе композитного материала, содержащего фиброин и 30% желатина (ФЖ-МН). Для исследования структуры матриксов и МН методом конфокальной микроскопии конъюгировали полимер с красителем тетраметилродаминизотиоцианат (TRITC). Для оценки распределения микрочастиц по размеру проводили гранулометрический анализ. Фракции микрочастиц получены после пропускания через сита лабораторные с отверстиями 100 и 250 мкм (ООО «Крафт», Российская Федерация). Размеры микрочастиц различных фракций определяли методами световой микроскопии. Затем определяли массу МН после высушивания на приборе HCP-2 criticalpointdryer («Hitachi Ltd», Япония). Для изучения пригодности МН на основе фиброина для культивирования клеток, участвующих в регенерации кожи, использовали мышиные ФБ линии 3Т3 и первичную культуру КЦ мыши. Первичную культуру мышиных КЦ, экспрессирующих зеленый флуоресцентный белок (GFP), получали из новорожденных GFP+ C57BL/6N мышей на 0—3-й день развития по методике [2]. Для получения GFP+ мышей-самок линии C57BL/6N скрещивали с самцом с убиквитарной экспрессией GFP. Фрагмент кожи обеззараживали антибиотиком/антимикотиком (Gibco) следующего состава: 100 ед/мл пенициллина, 100 ЕД/мл стептомицина и 0,25 мкг/мл амфотерицина в фосфатно-солевом буфере (ФСБ) в течение 5 мин. Далее в течение ночи при температуре 4 °C обрабатывали 0,025% раствором трипсин/ЭДТА. Затем дерму удаляли, а эпидермис измельчали и центрифугировали при 200 g в среде FAD следующего состава: DMEM/Ham’s F12 («Lonza», Швейцария) в соотношении 3,5:1,1 с добавлением 10% сыворотки плода коровы, 0,18 ммоль аденина, 0,5 мкг/мл гидрокортизона, 5 мкг/мл инсулина, 0,1 нмоль холерного токсина, 10 нг/мл EGF, 2 ммоль глутамина, 1 ммоль пирувата, с последующим ресуспендированием. Характеристику полученной из суспензии первичной культуры КЦ проводили путем выявления цитокератинов-5 и -14 на поверхности клеток посредством непрямой иммунофлуоресценции с использованием мышиных моноклональных антител к цитокератину-5 с поликлональными козьими антителами против иммуноглобулина G мыши, меченных CF™ 555, и кроличьих моноклональных антител к цитокератину-14 с поликлональными козьими антителами против иммуноглобулина G кролика, меченных CF™ 633. Использовали антитела производства «Sigma-Aldrich» (США). Оптимальная концентрация КЦ в инокулируемой суспензии подобрана на основе анализа роста клеток на МН методом конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (КЛСМ) на микроскопе Eclipse Ti-E с конфокальным модулем А1 («Nikon Corporation», Япония) по флуоресценции GFP, экспрессируемому клетками. Пролиферацию Ф.Б. линии 3Т3 и КЦ на МН оценивали методом МТТ-теста. Клетки на МН наносили следующим образом: в лунки 96-луночного планшета вносили по 50 мкл суспензии МН в среде культивирования, в концентрации 40 мг/мл, добавляли суспензию ФБ или КЦ по 20 тыс. и 40 тыс. клеток на лунку соответственно. Через 4 ч МН с прикрепившимися клетками переносили в лунки 24-луночного планшета, содержащие по 1 мл среды культивирования. Через 1, 3, 5 и 7 сут вносили по 200 мкл раствора МТТ (5 мг/мл в ФСБ) и инкубировали при температуре 37 °C в течение 4 ч. Среду с МН отбирали и центрифугировали при 14 500 g, осадок растворяли в ДМСО и проводили колориметрические измерения при 540 нм. В качестве отрицательного контроля использовали МН, инкубированные в среде культивирования. Самки мышей категории SPF (specific pathogen free) получены из питомника для лабораторных животных «Пущино», трансгенные самцы с убиквитарной экспрессией GFP предоставлены Н.Н. Логуновой (ЦНИИ туберкулеза РАМН).

Статистический анализ различий между группами осуществляли с использованием критерия t Стьюдента для зависимых (внутри одной группы) и независимых (между «Ф-МН» и «ФЖ-МН») выборок. Результаты считали статистически значимыми при р<0,05.

На основе матриксов из фиброина криоизмельчением получены Ф-МН. Тем же способом получены микроносители из композитных матриксов, содержащих 70% фиброина с добавлением 30% желатина (ФЖ-МН). Фиброиновые М.Н. как Ф-МН, так и ФЖ-МН сохраняют сходную с исходными матриксами пористую структуру (рис. 1) и имеют большую доступную для адгезии клеток поверхность, что продемонстрировано с использованием КЛСМ (см. рис. 1, в, г).

Количественный анализ распределения МН по размеру показал, что преобладают микрочастицы от 100 до 250 мкм (см. таблицу). Такой размер позволяет использовать микрочастицы в инъекционной форме. По соотношению количества частиц в каждой из исследованных фракций от 50 до 100 мкм, от 100 до 250 мкм, от 250 до 400 мкм не наблюдали статистически значимых различий между Ф-МН и ФЖ-МН.

Для изучения способности МН на основе фиброина поддерживать адгезию и пролиферацию клеток использовали мышиные ФБ линии 3Т3. Клетки вносили в количестве 20 тыс. с 2 мг МН на лунку 96-луночного планшета, инкубировали в течение 4 ч. МН с прикрепившимися клетками переносили в свежую культуральную среду и культивировали до 7 дней. В качестве метода оценки пролиферации клеток на МН, позволяющего оценить рост клеток на тотальной выборке МН от 50 до 400 мкм, использован МТТ-тест. Полученные данные представлены на рис. 2.

Характер роста ФБ на Ф-МН и ФЖ-МН (20 тыс. клеток на лунку с 2 мг Ф или с 2 мг ФЖ) существенно различался. На Ф-МН ФБ линии 3Т3 активно пролиферировали, начиная с 1-го дня культивирования (см. рис. 2) вплоть до 7-го дня. На носителях с желатином с 1-го по 3-й день оптическая плотность при длине волны 540 нм — ОП540 (коррелирующая с количеством живых 3Т3 клеток) существенно не изменялась. Для этих МН ОП540 увеличивалась к 5-му дню. На 5-й день ОП540 для ФЖ-МН не отличалась от ОП540 для Ф-МН (см. рис. 2). На 7-й день различий между Ф-МН и ФЖ-МН по ОП540 также не наблюдали.

В ходе работы также оценивали применимость МН для культивирования К.Ц. Выделенная первичная культура КЦ проверена на типичные маркеры КЦ базального слоя: цитокератин-5 и -14 [15]. Более 95% клеток содержали на своей поверхности данные маркеры (рис. 3). Первичные К.Ц. мыши культивировали на МН, используя различные плотности первоначально внесенных в лунку клеток: 40 тыс. и 20 тыс. клеток на лунку на 2 мг суспензии микрочастиц. Каждые 2 дня образцы фиксировали и исследовали методом конфокальной микроскопии по флуоресценции GFP, экспрессируемому клетками. При использовании плотности 20 тыс. клеток на лунку КЦ не делились (данные не представлены). При высокой плотности клеток, первоначально внесенных в лунку с микрочастицами (40 тыс. клеток), наблюдалось увеличение количества КЦ на МН в течение 7 дней (см. рис. 3; рис. 4). При этом наличие желатина не оказывало значительного влияния на пролиферацию клеток.

Получено два типа МН, пригодных для доставки клеточных популяций в область регенерации повреждений тканей. Основой для их создания выбран фиброин шелка, который является одним из наиболее перспективных материалов при разработке тканеинженерных конструкций и биодеградируемых систем доставки. Желатин использовали для введения в состав МН функциональной интегринраспознающей RGD-последовательности (сигнальной последовательности аргининглицинаспарагиновая кислота, содержащаяся в белках внеклеточного матрикса и являющаяся лигандом для интегринов), а также с целью повышения гидрофильности изделий [16]. Пористая структура МН обеспечивает свободный доступ питательных веществ и газообмен и создает благоприятные условия для культивирования клеток.

ФБ — важный клеточный компонент, участвующий в процессах регенерации тканей и органов. Клетки данного типа обеспечивает синтез компонентов внеклеточного матрикса, в том числе фибронектина, образующих субстрат для миграции клеточных элементов воспаления и формирования грануляционной ткани. Кроме того, ФБ секретируют различные факторы роста и протеазы, необходимые для заживления ран: фактор-2 роста ФБ (FGF2), фактор роста эндотелия сосудов (VEGF), фактор роста гепатоцитов (HGF) и другие факторы, стимулирующие миграцию и пролиферацию клеток различных типов, участвующих в процессах регенерации [10, 11]. Поэтому способность МН поддерживать адгезию и пролиферацию ФБ является важным показателем возможности их применения для клеточной терапии кожных ран.

Ранее при использовании более высокой первоначальной клеточной плотности (40 тыс. на лунку, на 2 мг МН) разницы в характере роста ФБ между двумя МН — Ф-МН и ФЖ-МН не обнаруживали [17]. В данной работе уменьшение первоначальной клеточной плотности (20 тыс. на лунку) позволило выявить некоторые особенности роста ФБ в зависимости от субстрата культивирования. Наблюдаемые отличия в характере роста клеток на разных носителях не связаны с размером микрочастиц, поскольку разницы в соотношении распределения частиц разного размера между Ф-МН и ФЖ-МН не отмечено (см. таблицу). При этом в другой работе нами показано, что введение желатина в состав макроносителей на основе фиброина в виде трехмерных пористых матриксов, таких как представлены на рис. 1, а, б, приводило к усилению пролиферативной активности ФБ линии клеток 3Т3 [6].

Таким образом, характер роста ФБ на макро- и микроносителях существенно различается. Скорее всего такие различия объясняются тем, что в матриксах при достижении высокой плотности клеток в одном слое существует возможность их миграции в более глубокие слои (см. рис. 1, б) и, таким образом, у клеток сохраняется высокий пролиферативный потенциал. Варьируя начальную концентрацию клеток, можно добиваться регулируемого роста ФБ на МН, что имеет большое практическое значение при применении МН для доставки ФБ в кожные раны. Излишне высокий пролиферативный потенциал ФБ может в ряде случаев приводить к аномальному ранозаживлению и фиброзу [18].

КЦ представляют основную массу клеток эпидермиса и являются одним из наиболее важных клеточных компонентов, участвующих в регенерации кожи [15]. Впервые культивирование КЦ осуществлено в 1975 г. с появлением методики Рейнвальда и Грина. Существуют сложности при культивировании КЦ in vitro, связанные с необходимостью ферментативной обработки клеток, которая дает значительный повреждающий эффект. Одним из возможных решений проблемы является использование биорезорбируемых МН для культивирования КЦ, которые позволяют непосредственно вводить частицы с сорбированными клетками в раневое ложе.

В ходе исследований получены два типа МН, способных поддерживать эффективный рост КЦ в культуре. Предлагаемые в данной работе МН на основе фиброина шелка являются биорезорбируемыми, поэтому могут выступать не только в качестве подложки культивирования, но и инструментом доставки КЦ в раневые участки без процедуры снятия клеток. Другая важная особенность полученных фиброиновых МН — способность поддерживать значительную часть КЦ в состоянии, когда они экспрессируют маркеры базального слоя. Известно, что в эпидермисе в ходе дифференцировки от плюрипотентной клетки базального слоя до КЦ ороговевающего слоя происходит смена синтеза цитокератинов [15]. КЦ базального слоя экспрессируют цитокератины-5 и -14, сохраняют мультипотентные свойства и способность дедифференцировки в клетки других типов при введении в область кожных повреждений. Известны примеры, когда репрограммирование КЦ в плюрипотентные клетки способствовало более активному ранозаживлению [19] и облегчало формирование кровеносных сосудов [20].

В целом проведенное исследование свидетельствует, что полученные Ф-МН и ФЖ-МН могут быть использованы для культивирования in vitro ФБ и КЦ — основных типов клеток, участвующих в регенерации кожи. Варьируя начальными концентрациями клеток и добавками, вносимыми в фиброин, можно добиться регулируемого роста ФБ, что очень важно при создании тканеинженерных композитных конструкций. В подобных аналогах кожи используются клетки нескольких типов, задействованных в регенерации, но неизменными компонентами в них являются КЦ и Ф.Б. Одна из существенных проблем при создании клеточных композитов — доминирующий рост ФБ, который преобладает по скорости над К.Ц. Использование фиброиновых носителей с добавлением желатина позволит сбалансировать пролиферацию ФБ и создать оптимальные условия для нормального развития КЦ. В дальнейшем на основе полученных результатов нами планируется использование фиброиновых МН для оптимизированного совместного роста первичных культур КЦ и ФБ с целью их последующей доставки в области полнослойных ран. Полученные М.Н. имеют широкие перспективы для использования в терапевтической практике.

Работа осуществляется при поддержке Минобрнауки Р.Ф. по Соглашению о предоставлении субсидии от 27 ноября 2014 г. № 14.604.21.0148 «Биорезорбируемые микроносители для доставки клеток в область заживления и регенерации ран», уникальный идентификатор соглашения RFMEFI60414X0148.

Работа выполнена с использованием оборудования, приобретенного за счет средств Программы развития Московского университета и на оборудовании ЦКП Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова при финансовой поддержке Министерства образования и науки РФ.

Конфликт интересов отсутствует.