Интравитреальные инъекции (ИВИ) на текущем этапе развития офтальмологии легли в основу терапии многих заболеваний глаз, включая диабетическую ретинопатию, окклюзию вен сетчатки и дегенерацию желтого пятна. Разработка и широкое применение интравитреальных ингибиторов эндотелиального фактора роста сосудов (анти-VEGF-препараты) изменили подходы к лечению неоваскулярной возрастной макулярной дегенерации (ВМД), сократив число случаев неустранимого слабовидения на 50% за последнее десятилетие [1].

В США в 2012 г. проведено более 2,3 млн ИВИ, а в 2016 г. их число превысило 6 млн [2]. В Российской Федерации количество ИВИ также неуклонно растет. Увеличение распространенности вышеупомянутых заболеваний в текущем десятилетии отражает демографические изменения стареющего населения, а также доступность высокочувствительного медицинского оборудования, изучающего задний отрезок глазного яблока.

Перспективы развития и применения ИВИ достаточно широки. В обзорах литературы широко представлено использование различных лекарственных средств, вводимых интравитреально (антибактериальные, противогрибковые, противовирусные препараты, нестероидные противовоспалительные средства, иммуномодуляторы, антинеопластические средства, ферменты), однако в России эти разработки применяются off-lable [3—11].

Несмотря на расширяющийся перечень нозологий, в лечении которых успешно используется введение анти-VEGF-препаратов, к настоящему моменту накоплен ряд данных о негативном опыте их использования и возможных побочных эффектах. В литературе начиная с 2005 г. описываются случаи наличия капель силиконового масла (КСМ) в витреальной полости после ИВИ; авторы связывают это с фрагментами остатков силиконового масла с игл инсулиновых шприцев [12—15]. Существует множество работ, в которых описаны изменения гидродинамики глаза с повышением внутриглазного давления после ИВИ и последующей его нормализацией, в том числе с применением местных гипотензивных препаратов [16]. В PubMed и Google Scholar встречается ряд статей, в которых описаны изменения задней капсулы хрусталика, в том числе при нарушении технологии проведения ИВИ. По данным зарубежных авторов, многократные ИВИ являются фактором риска разрыва задней капсулы при проведении факоэмульсификации катаракты [17, 18]. Частота прогрессирования катаракты при анти-VEGF-терапии в публикациях разных авторов варьирует от 0,01 до 9,9% [10, 19], однако данные в основном носят наблюдательный характер.

E. Mannermaa и соавторы подробно изучили движение внутриглазной жидкости из стекловидного тела, где существует два пути выведения: передний, при котором элиминация веществ осуществляется с током внутриглазной жидкости через дренажную систему глаза, и задний — трансретино-хориоидальный путь, при котором препараты проходят через сетчатую оболочку глаза путем диффузии и выводятся через сосудистый тракт в системный кровоток [20]. На основании этого авторы пришли к выводу, что само лекарственное вещество, вводимое в стекловидное тело, также оказывает влияние на хрусталик.

Аналогичные данные представлены в работе Д.В. Липатова и соавторов, в которой проведено математическое моделирование движения жидкостей внутри глазного яблока при ИВИ, в том числе с влиянием на заднюю капсулу хрусталика [21]. Опубликована работа Ю.С. Андреевой и соавторов в которой у пациентов с нативным хрусталиком наблюдались изменения иридохрусталиковой диафрагмы [22]. Все это говорит о том, что ИВИ, в том числе и анти-VEGF-препаратов, оказывают воздействие на хрусталик, а относительно быстрый период выведения лекарств из стекловидного тела требует регулярных повторных инъекций для поддержания терапевтического эффекта. При этом их воздействие на другие отделы глазного яблока до конца не изучено.

Несмотря на бурное развитие методов оценки состояния различных структур глазного яблока, способов исследования хрусталика не так уж и много. Известна методика классификации помутнений хрусталика LOCS III [23]. C.T. Holló и соавторы осуществляли пространственное моделирование катаракты, и данный метод оказался высокочувствительным при начальных стадиях заболевния [24]. Swept source оптическая когерентная томография (SS-ОКТ) позволяет выявить in vivo тонкие помутнения в катарактном хрусталике, оценивая его положение и размер в трех измерениях [25]. Исследования на приборе IOL Master 700 при начальных хрусталиковых помутнениях определили индекс OSI, который оказался также специфичным и высокочувствительным [26].

Большие потенциальные возможности исследования хрусталика имеют флуоресцентные методы. Основанием для использования флуоресцентного анализа является наличие собственной флуоресценции клеток и тканей при их облучении ультрафиолетовым (УФ) и видимым светом.

По данным литературы, содержание восстановленных пиридиновых нуклеотидов (НАДН) в хрусталике млекопитающих имеет следующие величины: кролик — 337 нмоль/г, морские свинки — 500 нмоль/г, крысы — 23 нмоль/г [27]. По данным исследований, содержание восстановленных пиридиновых нуклеотидов в коре хрусталика взрослого человека составляет 87 нмоль/г, тогда как при катаракте различного типа оно может варьировать в пределах от 14 до 77 нмоль/г (для сравнения: ядро хрусталика содержит в 10 раз меньшее количество НАДН) [28].

Необходимо отметить, что при возбуждении флуоресценции тканей вблизи полосы поглощения первого синглетного уровня S1 НАДН (340 нм, а в нашей работе мы используем 375 нм) основной вклад во флуоресценцию большинства тканей млекопитающих вносит именно НАДН, что и служит основой флуоресцентных методов контроля их состояния. При этом флуоресценция белков, а именно — триптофана, не влияет на результаты анализа, поскольку для ее возбуждения требуется более короткая длина волны: пик поглощения — на 280 нм, край полосы поглощения — 310 нм. Сравнение концентрации пиридиновых нуклеотидов в других тканях млекопитающих и человека указывает на сопоставимые с тканью хрусталика концентрации. Данные метаанализа [29] указывают на сопоставимые значения концентрации НАДН в тканях, лежащие в пределах 20—200 нмоль/г. Таким образом, флуоресценция НАДН в хрусталике должна вносить существенный вклад в общий сигнал. Среди нетриптофановых флуорофоров, которые могут быть возбуждены УФ-А-излучением и присутствуют в ткани хрусталика, можно указать глюкозид гидроксикинурена (3-HGK) с длиной волны возбуждения 520 нм и испусканием 550 нм. Исследователи также указывают еще на ряд флуоресцирющих продуктов метаболизма триптофана, присутствующих в хрусталике глаза, таких как кинуренин, 3-гидроксикинуренин (концентрации последних — на уровне 15—50 нмоль/г) [30].

Роль рассеяния в изменении спектров флуоресценции хрусталика при развитии катаракты уже обсуждалась нами [31]. Изменения в спектре за счет рассеяния действительно должны иметь место, более того, вывод, который мы сделали в указанной работе, говорит о том, что основные изменения в спектре при развитии катаракты могут быть целиком описаны за счет изменения показателей рассеяния в принятой нами модели, основанной на параметрах, полученных другими авторами.

Нами предложена методика оценки хрусталика на молекулярном уровне с использованием данных спектрофлуориметрии [32].

Цель исследования — оценить изменения параметров спектрофлуориметрии хрусталика после ИВИ бролуцизумаба у пациентов с нативным хрусталиком.

Материал и методы

Исследование проведено на базе КГБУЗ «ККОКБ им. проф. П.Г. Макарова», совместно с кафедрой офтальмологии им. проф. М.А. Дмитриева с курсом ПО ФГБОУ ВО «КрасГМУ им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого» Минздрава России и кафедрой лазерных микро-нано и биотехнологий Национального исследовательского ядерного университета «МИФИ» в период с января по июль 2023 г. В исследуемую группу были включены пациенты старше 40 лет с неоваскулярной ВМД с изменениями центральной толщины сетчатки в макулярной области свыше 300 мкм по данным ОКТ.

Критериями исключения являлись: артифакия, помутнения хрусталика, препятствующие проведению ОКТ, сахарный диабет, лазеркоагуляция в анамнезе, ранее проводимые ИВИ, хирургические вмешательства на стекловидном теле, наличие глаукомы, увеита.

В исследовании принимали участие 13 человек. Всем пациентам интравитреально в условиях операционной был введен препарат бролуцизумаб в объеме 0,05 мл, после чего назначена медикаментозная терапия согласно федеральным клиническим рекомендациям («Макулярная дегенерация возрастная»). Регистрация спектров УФ-индуцированной аутофлуоресценции производилась с хрусталиков глаз пациентов перед инъекцией и через 1 мес после нее. Спектры хрусталиков в глазах, где проводились инъекции, были отнесены к клинической группе «ИВИ»; спектры хрусталиков интактных глаз составили группу «Контроль»; данные, полученные до инъекции, обозначались «До инъекции», через 1 мес после лечения — «Через 1 мес».

Регистрация спектров аутофлуоресценции производилось с помощью малогабаритного спектрофлуориметра на базе спектрометра STS VIS (Ocean Optics) при возбуждении УФ-светодиодом с пиком на длине волны 375 нм. Мощность возбуждения составила 0,5 мВт.

Принцип работы прибора основан на возбуждении флуорофоров УФ-светодиодом и регистрации флуоресценции хрусталика спектрометром 340 нм, с дальнейшей интерпретацией результатов при помощи специально разработанного программного обеспечения [33]. Была доказана безопасность данного исследования для сетчатки [34]. На рис. 1, а изображена оптическая схема офтальмологического спектрофлуориметра. Схема содержит следующие узлы и детали: 1 — видеокамера; 2 — малогабаритный спектрометр STS VIS Ocean Optic с конденсором (5) и светодиодами. Видеокамера и спектрометр располагаются оптическими осями в одной горизонтальной плоскости, и в ней же располагается главная оптическая ось прибора. Оптическая схема спектрометра с конденсором и светодиодами приведена на рис. 1, в, где светодиоды располагаются под острым углом по отношению к оси спектрометра и фиксируются в желобках конденсорной гильзы (6). При этом инфракрасный (ИК) светодиод (3), предназначенный для подсветки, располагается в центральном желобке, а УФ-светодиоды (4) — в боковых желобках. На рис. 1, б изображен конденсор, который включает в себя гильзу (6) и конденсорную микролинзу (7).

Рис. 1. Схема малогабаритного спектрофлуориметра.

Объяснение в тексте.

Принцип работы спектрофлуориметра следующий. Излучение УФ-светодиодов, попадая на различные диагностические зоны глаза, вызывает возбуждение люминесценции. При этом расстояние до объекта контролируется визуально по совмещению пятен от светодиодов на объекте (хрусталике). Белый ИК-светодиод используется для подсветки аналитической зоны и во время непосредственных измерений может выключаться. Излучение флуоресценции попадает на входной торец оптического конденсора малогабаритного спектрометра и анализируется им. Видеокамера предназначена для визуального контроля установки спектрофлуориметра.

Расстояние от глаза пациента (диагностической плоскости) до конденсора выбирается таким образом, чтобы обеспечить комфортную процедуру измерения, а именно — происходит вынос диагностической плоскости глаза за пределы корпуса прибора. Расстояние от диагностической плоскости до УФ-светодиодов выбирается таким образом, чтобы обеспечить необходимый диаметр светового пятна в диагностической плоскости 4 мм. Диаметр пятна от ИК-светодиода подсветки не регламентируется. На рис. 2 изображены сам спектрофлуориметр, установленный на штатив щелевой лампы, и аутофлуоресценция хрусталика.

Рис. 2. Малогабаритный спектрофлуориметр для исследований в офтальмологии.

Данную методику мы применили для исследования изменений в хрусталике после проведения ИВИ анти-VEGF-препаратов. Спектры анализировались в диапазоне длин волн 412—698 нм. Указанный участок спектра был представлен 148 значениями с шагом около 1,9 нм. Первичные спектры нормировались на среднее значение сигнала в указанном диапазоне. Затем производилось сглаживание спектров скользящим средним с окном 8 нм. Далее был вычислен средний спектр для глаз в группе «ИВИ — До инъекции» — F(λ) и для каждого спектра Fi(λ) вычислялись коэффициенты линейной регрессии a_i, b_i методом наименьших квадратов, так чтобы после последующей перенормировки указанные спектры были максимально приближены к среднему:

.

Затем проводилась перенормировка спектров с учетом найденных коэффициентов:

.

Результатом применения перенормировки является уменьшение стандартного отклонения для спектров во всех группах. На рис. 3 представлен спектр со стандартным отклонением для группы «Контроль — До инъекции» до перенормировки (рис. 3, а) и соответственно после перенормировки (рис. 3, б).

Рис. 3. Уменьшение стандартного отклонения в спектрах контрольной группы в результате перенормировки (а, б).

Статистический анализ результатов проведен на персональном компьютере с использованием Microsoft Office Excel 2010 и пакета прикладных программ Statistica v.13.0 (StatSoft Inc., США). Полученные данные проанализированы с применением методов непараметрической статистики, критерия Манна—Уитни. Для пациентов с выполненными повторными измерениями также оценивалась значимость различий с использованием двухвыборочного критерия Уилкоксона.

Результаты

В настоящей работе мы применяем иной способ нормировки, дающий значительно меньшее стандартное отклонение, что позволяет регистрировать более тонкие эффекты, которые имеют более четкую привязку к длинам волн различных флуорофоров, а не рассредоточены по всему исследуемому диапазону спектра. Наш вывод в работе основан на предположении малости изменений, связанных со структурными преобразованиями в теле хрусталика, например за счет осмолярных эффектов при выполнении ИВИ.

На рис. 4 представлен типичный спектр, получаемый со спектрометра: он представляет собой сумму спектров светодиода возбуждения в первом и во втором порядке дифракции (узкие пики) и широкий спектр аутофлуоресценции хрусталика (представлен после нормировки на максимальное значение на длине волны 470 нм). Для сравнения приведен спектр флуоресценции основного тканевого флуорофора НАДН. Таким образом, флуоресценция NADH в хрусталике должна вносить существенный вклад в общий сигнал [35].

Рис. 4. Сумма спектров светодиода возбуждения в первом и во втором порядке дифракции и широкий спектр аутофлуоресценции хрусталика.

Для выявления областей спектра, наиболее значимо изменяющихся в результате проведения инъекции, мы построили разностный спектр для групп «ИВИ — Через 1 мес» и «ИВИ — До инъекции», отображенный на рис. 5. Там же приведен график t-параметра. Пороговое значение значимых различий в спектре для t-параметра равно 2. Как следует из приведенного графика, наибольшие отличия в спектре наблюдаются на длинах волн 440 нм (инъекция приводит к повышению сигнала аутофлуоресценции) и 515 нм (инъекция приводит к снижению сигнала аутофлуоресценции). В качестве спектрального параметра, характеризующего изменения в хрусталике, нами было выбрано отношение интенсивностей флуоресценции на указанных длинах волн. Данные длины волн — 440 и 515 нм — говорят о содержании в живых тканях молекул НАДН и флавопептидов, соотношение этих флуорофоров изменяется в процессе развития патологических процессов в живых тканях:

.

Рис. 5. Разностный спектр флуоресценции и спектр t-критерия между группами «ИВИ — Через 1 мес» и «ИВИ — До инъекции».

Расчетные усредненные по шести спектрам значения спектрального критерия h использовались нами для оценки метаболических изменений в хрусталике в результате инъекции, а также мониторинга изменений в группе контроля.

Сравнение амплитуды перенормированного спектра с разностным на пороге статистической значимости изображенного на рис. 5 демонстрирует отношение на уровне 2/0,025=80. Указанное отношение сигналов уверенно регистрируется спектрометром, поскольку для максимального уровня сигнала спектрометра динамический диапазон, заявляемый производителем, составляет 4500. Соответственно пороговое значение отношения сигналов 80 будет достигнуто при сигнале флуоресценции более 14 000×80/4500=250 единиц. В наших исследованиях амплитуда спектра флуоресценции превышала 1000 единиц.

Данные описательной статистики для спектрального критерия h в группе «Контроль» и группе «ИВИ» представлены в таблице.

Показатель метаболизма h в группе «Контроль» и группе «ИВИ»

В контрольной группе значимость отличий по критерию Вилкоксона составила p=0,069. В клинической группе «ИВИ» значимость отличий по критерию Вилкоксона составила p=0,049.

Обсуждение

Данные сравнительного анализа спектров хрусталиков в двух клинических группах на старте и финише исследования, с инъекцией анти-VEGF-препарата и группы «Контроль» отображены на рис. 6. Показаны статистически значимые показатели увеличения метаболического сдвига в группе, где проводилась инъекция анти-VEGF-препарата бролуцизумаб. Также отображено отсутствие выраженных изменений у пациентов в группе «Контроль», что говорит о высокой чувствительности и специфичности методики спектрофлуориметрии в отношении хрусталика. Изменения, а именно — увеличение флуоресценции (группа «Контроль») в фиолетовой области спектра, сходны с изменениями при развитии катаракты, описанными нами ранее [31].

Рис. 6. Показатели метаболического сдвига в клинических группах в начале и в конце исследования.

Однако утверждать, что указанные перемены в дальнейшем непосредственно приведут к формированию катаракты, преждевременно.

Заключение

Описанный метод может быть полезен для выявления ранних метаболических сдвигов в хрусталике, в том числе и старта катарактогенеза, после различных ИВИ. Он может быть перспективным при внедрении новых молекул для интравитреального введения, оценки их безопасности со стороны нативного хрусталика, а также разработки подробных инструкций применения лекарственных препаратов с клинически обоснованными побочными эффектами в виде развития катаракты. Интравитреальное введение препарата бролуцизумаб оказывает незначительное влияние на метаболические сдвиги в хрусталике, однако потребность в системных подходах к применению анти-VEGF-терапии увеличивает риски развития начальных изменений в хрусталике.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования: В.В.Г., В.В.С.

Сбор и обработка материала: Д.К., В.С.Г., П.Б.

Статистическая обработка данных: В.В.С.

Написание текста: В.В.Г., П.Б.

Редактирование: П.Б.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.