Современное состояние физиотерапии характеризуется развитием новых реабилитационных технологий, расширяющих возможности применения ее методов для профилактики и лечения многих заболеваний. В частности, на стыке таких разделов восстановительной медицины, как электро-, магнито- и рефлексотерапия разработан метод воздействия на физиологические системы человеческого организма, названный эутерапией [1, 2]. Метод предназначен для проведения одновременного или отдельного неинвазивного воздействия низкочастотными импульсными электрическим током и магнитным полем на кожные зоны прямой проекции дискомфорта и болей, рефлекторные активные зоны и точки, а также триггерные зоны; реализуется с помощью физиотерапевтического аппарата Тилайн-ЭМ (ООО «Производственные системы», Екатеринбург, Россия) [3].

Аппарат Тилайн-ЭМ генерирует два лечебных фактора, которые можно комбинировать в разных сочетаниях. Первый из них — электрический нейроподобный сигнал (ЭНС) с частотой следования импульсов электростимуляции 60±10 Гц, амплитудными импульсными значениями электрического тока от –30 В первой фазы и до +125 В второй фазы импульса при силе тока 1,0—9,0 мА. Вторым лечебным фактором аппарата служит импульсное магнитное поле (ИМП) c индукцией не менее 10—200 мТл и частотой следования импульсов 10±3 Гц. Последняя соответствует возможным вариациям основной частоты резонанса Шумана [4], а также диапазону альфа-, тета-волн и сонных веретен ритмической электрической активности коры больших полушарий [5]. Автоматическое изменение формы импульсов происходит в зависимости от изменения полного электрического сопротивления тканей пациента (импеданса).

Результаты клинических исследований показали положительные профилактические и лечебные эффекты при применении аппарата, например, у пациентов с патологией опорно-двигательной системы [6].

Однако для дальнейшего практического использования аппарата необходимо понимать, что может происходить при подобном воздействии на клеточном уровне. В экспериментальных исследованиях показано, что электрические и магнитные излучения оказывают разнонаправленное влияние на клетки млекопитающих: изменяют функциональное состояние клеточной мембраны, модифицируют процесс прохождении нервного импульса по изолированному нервному волокну, метаболические процессы в клетках, клеточный цикл и адгезивные свойства клетки [7, 8]. Электрические и магнитные воздействия могут усиливать внутриклеточные регенеративные процессы [9], а также запускать в клетках механизмы апоптоза [10]. Эффект гибели клеток различается для трансформированных и нетрансформированных линий, кроме того, для каждого вида клеток нужна своя частота, запускающая апоптоз [11, 12]. Эти данные свидетельствует об изменении функциональной активности клеток под влиянием электрических и магнитных сигналов. Механизм этого влияния весьма разнообразен и зависит от многих факторов, в том числе от параметров электромагнитных полей, типа клеток и их функционального состояния.

Таким образом, исследование воздействия низкочастотного импульсного электрического тока и магнитного поля на функциональное состояние клеток млекопитающих является важной и актуальной задачей как с точки зрения понимания механизмов биологического действия, так и с точки зрения оценки этого фактора для здоровья человека.

Цель работы — основываясь на ранее полученных данных [13, 14], провести исследование специфического и комплексного влияния низкочастотных импульсов электрического тока и магнитного поля, генерируемых автономным физиотерапевтическим аппаратом Тилайн-ЭМ, на жизнеспособность, пролиферативную активность и морфофункциональные особенности клеточных культур нормальных и трансформированных фибробластов.

Исследование проводили на клеточных культурах трансформированных фибробластов крысы линии К-22, полученных из Российской коллекции клеточных культур Института цитологии РАН (Санкт-Петербург), и нормальных фибробластов крысы, выделенных из биоптата кожи [15]. Для выделения фибробластов биоптат кожи крысы в условиях ламинарного бокса 2—3 раза промывали в растворе Хэнкса с антибиотиками (пенициллин — 2000 Ед/мл, гентамицин — 250 мкг/мл) и помещали в 0,25% раствор трипсина на 16—20 ч при температуре +4 °С, после чего отделяли дерму от эпидермиса. Полученные кусочки дермы измельчали на фрагменты 3×3 мм, помещали между покровными стеклами в культуральные чашки Петри с питательной средой ДМЕМ (Биолот, Россия) с добавлением 10% сыворотки крови плодов коровы (Биолот, Россия) и гентамицина в дозе 50 мкг/мл. Чашки выдерживали в инкубаторе при температуре 37 °С в атмосфере с 5% СО2 6—8 сут, в течение которых происходила эксплантация фибробластов на поверхность чашки. Культивирование клеток продолжали 3—4 нед до момента формирования монослоя на чашках Петри.

Трансформированные и нормальные клетки в концентрации 1,5—2,0∙10⁵ в 1 мл стандартной питательной среды для фибробластов инкубировали в пластиковых планшетах при температуре 37 °C в атмосфере с 5% СО2 в течение 24 ч до образования 70—80% монослоя. Культуры клеток подвергались воздействию ИМП низкой частоты и низкочастотного электрического импульсного тока (с зависимостью формы импульсов от значений импеданса в подэлектродном участке) с использованием физиотерапевтического автономного аппарата Тилайн-ЭМ производства ООО «Производственные системы» (Екатеринбург, Россия). Воздействие оказывалось бесконтактным способом, путем установки электродов аппарата на поверхность планшета с культурой клеток.

Индукция магнитного поля в эксперименте составляла не менее 10 мТл, частота следования импульсов — 10±3 Гц, амплитудные импульсные значения электрического тока составляли от –30 В первой фазы и до +125 В второй фазы импульса при частоте импульсов 60±10 Гц. Исследовали три режима воздействия на клеточные культуры: магнитный сигнал, электрический сигнал и их сочетание. Время воздействия составляло 10 мин для каждого режима. Биологические эффекты влияния электрического и магнитного сигналов оценивали на 3-и сутки после воздействия. В качестве контроля использовалась культура клеток, не подвергавшаяся воздействию.

Индекс пролиферации рассчитывали как отношение числа выросших клеток к числу посеянных. Долю жизнеспособных клеток оценивали согласно международному стандарту ISO 10993−5 при подсчете живых и мертвых клеток после их дезагрегации и окрашивания 0,4% раствором трипанового синего.

Для морфологического исследования клетки инкубировали на предметных стеклах, фиксировали и окрашивали по Романовскому—Гимзе. Морфофункциональное состояние культур фибробластов оценивали с помощью светового микроскопа Leica DM5000B при увеличении в 400 раз.

Статистическую обработку результатов проводили, используя компьютерные программы Microsoft Excel и Statistica. Вычислялось среднее значение и стандартное отклонение. Для оценки значимости различий между группами использовали критерий Манна—Уитни. При вероятности ошибки (p) <0,05 различия между средними значениями считались достоверными.

Специфическое и комплексное влияние электрического и магнитного сигналов проявляется увеличением индекса жизнеспособности трансформированных фибробластов. Для нормальных фибробластов подобный эффект достоверно проявляется только при действии электрического сигнала (рис. 1). Комплексное воздействие, напротив, снижает индекс жизнеспособности нетрансформированных фибробластов в культуре.

В эксперименте выявилось разнонаправленное влияние сочетанного электрического и магнитного сигналов на пролиферативную активность клеток в культуре. Эффект усиления пролиферации наблюдался исключительно в линиях трансформированных клеток, в то время как пролиферативная активность нормальных фибробластов, напротив, снижалась (рис. 2).

Биологическое действие низкочастотных импульсов электрического тока и магнитного поля проявляется изменением морфофункционального состояния клеток в культуре. В цитограмме трансформированных фибробластов контрольной группы определяются полиморфные клетки разной степени дифференцировки без деструктивных изменений (рис. 3, а). При воздействии ИМП наблюдается повышенная (по сравнению с контролем) целлюлярность, определяются двухъядерные и многоядерные клетки с отчетливым ядерным полиморфизмом, расположенные группами и диффузно (см. рис. 3, б). После воздействия электрических импульсов на фоне высокой клеточности цитограммы выявляются более мономорфные клетки, расположенные группами (см. рис. 3, в). Для комплексного воздействия характерно расположение клеток группами, а также полиморфизм и усиление синтетической активности фибробластов (см. рис. 3, г).

В цитограммах нетрансформированных фибробластов в контроле и при всех режимах воздействия определяется фибробластический дифферон, однако степень дифференцировки зависит от вида воздействия. В контроле определяются дифференцированные клетки отростчатой формы с признаками функциональной и синтетической активности (рис. 4, а). При магнитном режиме воздействия наблюдается более ранняя степень дифференцировки клеток (см. рис. 4, б), а при электрическом, напротив, определяются более дифференцированные клетки, встречаются единичные клетки с признаками деструкции (см. рис. 4, в). Комплексное воздействие сопровождается появлением еще более зрелых клеток, в цитограмме встречаются единичные фиброциты, высокодифференцированные клетки, не способные к делению и участвующие в синтезе волокнистых структур дермы (см. рис. 4, г).

Таким образом, исследование специфического и комплексного воздействия низкочастотных импульсов электрического тока и магнитного поля автономного физиотерапевтического аппарата Тилайн-ЭМ на жизнеспособность, пролиферативную активность и морфофункциональные характеристики клеток установило разнонаправленные биологические эффекты их влияния в отношении нормальных и трансформированных фибробластов в культуре. Под влиянием магнитного поля увеличивается жизнеспособность трансформированных фибробластов в культуре, при этом сохраняется полиморфизм, характерный для структурно-функциональной организации спонтанно трансформированных клеток. Данный режим воздействия практически не оказывает влияния на жизнеспособность и пролиферацию нетрансформированных фибробластов.

Низкочастотные импульсы электрического тока значительно увеличивают жизнеспособность и стимулируют процессы дифференцировки как трансформированных, так и нормальных фибробластов. Эффект электрического воздействия, скорее всего, связан с изменением распределения зарядов на поверхности мембран, повышением их резистентности к внешним воздействиям, улучшением проницаемости для биологически активных веществ и, как следствие, модуляцией роста, деления и функциональной активности клеток.

Сочетанное действие магнитного поля и низкочастотных импульсов электрического тока проявляется в изменении жизнеспособности и пролиферативной активности обоих типов клеточных культур. Однако направленность комплексного воздействия на трансформированные и нетрансформированные фибробласты прямо противоположна.

В культуре трансформированных фибробластов повышается жизнеспособность, пролиферативная и синтетическая активность клеток. Культура нетрансформированных фибробластов показала ускорение клеточной дифференцировки на фоне снижения пролиферативного потенциала и жизнеспособности.

В результате проведенного исследования установлено, что биологические эффекты низкочастотных импульсных электрических и магнитных сигналов физиотерапевтического аппарата Тилайн-ЭМ варьируют в зависимости от типа клеточной культуры и режима воздействия. В целом трансформированные фибробласты более чувствительны к специфическому и комплексному воздействию электрических и магнитных импульсов. Стимулирующее действие на жизнеспособность, пролиферативную и биосинтетическую активность трансформированных клеток, вероятно, связано с особенностью их метаболизма и клеточного цикла [16, 17]. Трансформированные клетки обладают более высоким пролиферативным потенциалом, что связано с повышенной проницаемостью их мембран для веществ, изменяющих метаболические и синтетические процессы, и пониженной потребностью в факторах роста.

При применении физиотерапевтического аппарата Тилайн-ЭМ вызывает интерес эффект стимуляции дифференцировки нормальных фибробластов, обработанных в режиме комплексного воздействия электрических и магнитных сигналов. Дифференцированные фибробласты, способные к синтезу коллагена, являются центральным звеном фибробластического дифферона [18]. В организме процессы пролиферации и дифференцировки фибробластов уравновешены, однако в ограниченных условиях культуры клеток по мере дифференцировки фибробластов их пролиферативный потенциал и жизнеспособность снижаются, вероятно, в результате дефицита необходимых веществ.

Разнообразие биологических эффектов, огромная сложность молекулярных механизмов, лежащих в основе клеточного ответа на воздействия низкочастотных импульсных электрических и магнитных сигналов физиотерапевтического аппарата Тилайн-ЭМ, неучтенные отдаленные последствия такого воздействия для клеток требуют проведения дальнейших исследований. Актуальным является изучение возможностей управления пролиферативно-дифференцировочным потенциалом фибробластов. Для понимания механизмов биологического действия низкочастотных импульсных электрических и магнитных сигналов и оценки их влияния на здоровье человека необходимо изучение ультраструктурных изменений, возникающих в клетках при воздействии различных режимов физиотерапевтического аппарата.

Конфликт интересов отсутствует.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования: В.М.

Сбор и обработка материала: С.М., М.У.

Анализ результатов: С.М.

Написание текста: В.М., М.У.