Поиск способов избирательного воздействия на отдельные этапы развития иммунного ответа является одной из приоритетных задач биологии и фундаментальной медицины [1-4]. Перспективным подходом к решению данной проблемы может являться применение низкоинтенсивного лазерного излучения (НИЛИ) в качестве неспецифического физического фактора, стимулирующего функциональную активность нейтрофилов - клеток с широким функционалом и потенциалом по осуществлению иммунобиологического надзора в общей системе гомеостаза [5]. Активация нейтрофильных гранулоцитов (НГ) представляет собой специфический амплификационный и эффекторный компонент иммунного ответа [1-3]. Активация рецепторов нейтрофила запускает каскад киназ, действующих на транскрипционный фактор NF-kB, который транслоцируется в ядро и осуществляет транскрипцию около 120 генов, ответственных за активацию клетки [6]. На следующем этапе происходит активация каспаз, НАДФ-оксидазной системы, что вызывает образование активных форм кислорода. Активированный нейтрофил может осуществлять биоцидные функции, реализуя фагоцитарный потенциал, либо с помощью выделения наружу биологически активных продуктов, осуществляя процесс дегрануляции [3]. Регистрация изменений функционально-метаболического статуса нейтрофилов в результате воздействия НИЛИ может стать полезной при выборе параметров освечивания в исследовательских мероприятиях по изучению иммунотропных эффектов, проведение которых, в свою очередь, чрезвычайно перспективно в клиническом плане, поскольку полученные результаты дадут возможность оптимизировать методики лазерной терапии.

Известно, что нейтрофилы являются как активными участниками процесса фагоцитоза, так и секретирующими клетками, способными высвобождать широкий спектр микробоцидных компонентов (эндогенных антимикробных пептидов), синтезировать вазоактивные и хемотаксические липидные медиаторы [6]. Поглощение лазерного света приводит к изменению метаболических процессов и, как следствие, к функциональной активности [1, 2, 7]. Нейтрофил, активизируясь, мобилизует содержимое гранул, секретируя его в эндоцитозные вакуоли или наружу в окружающую среду, проявляя при этом свой бактерицидный потенциал. Секреторная дегрануляция активированных лазером нейтрофилов сопутствует практически всем формам его реактивности, в том числе и респираторному взрыву, при котором происходит резкое увеличение потребления кислорода [4, 8]. Одним из ключевых ферментов, участвующих в восстановлении молекулярного кислорода, является НАДФ-оксидаза, осуществляющая транспорт электронов к нему от НАДФ-цитозоля. НИЛИ, нормализуя функциональные дефекты системы НГ, вполне может служить физическим стимулятором активности НАДФ-оксидазы, сниженной при угнетении биоцидных возможностей нейтрофила. Кроме того, определенный уровень активности НАДФ-оксидазы необходим для образования супероксид-аниона, поддержания глутатионового цикла, образования оксида азота из аргинина при участии Са²⁺-зависимой NO-синтазы [1, 5]. Известны также и другие Са²⁺-зависимые внутриклеточные процессы, активируемые НИЛИ, в которых прямо или косвенно принимает участие НАДФ-оксидаза [9, 10].

Необходимо более детально разобраться в действии энергии лазерного света на дегрануляционные возможности и скорость НАДФН-оксидазной реакции нейтрофилов, выделенных из периферической крови здоровых доноров, что и определило цель настоящего исследования. Выбор донорских нейтрофилов как объекта исследования обусловлен, с одной стороны, их полифункциональной ролью в поддержании защитной реакции организма [5, 11], а с другой - определенной простотой, связанной с отработанной методикой выделения и исследования функций этих клеток.

Цель исследования - в эксперименте in vitro на примере сброса лизосомальных гранул изучить дегрануляционные возможности нейтрофилов и скорость их НАДФН-оксидазной реакции при воздействии лазерного света.

Для выделения нейтрофилов использовали кровь здоровых доноров в возрасте 20,0±5,0 года без тяжелой соматической и инфекционной патологии. От всех доноров-добровольцев было получено письменное информированное согласие на участие в исследовании в соответствии с основами законодательства РФ «Об охране здоровья граждан, правил проведения клинической практики в РФ», (приказ МЗ РФ № 266 от 19.07.2003; приказ Росздравнадзора № 2325-Пр/06 от 17.10.2006).

Для получения нейтрофилов использовали 15,0 мл гепаринизированной (10−15 ЕД/мл гепарина) периферической крови. Нейтрофилы выделяли из лейкоцитарной взвеси в двойном градиенте плотности стерильного раствора фиколла-верографина. Плотность верхнего слоя градиента составляла 1,075-1,077 г/мл, нижнего - 1,093-1,095 г/мл. Объем каждого градиента - 1,5 мл. Через 40 мин центрифугирования при 1500 об/мин на границе между градиентами образовывалось кольцо гранулоцитов с чистотой 98-100%. Кольцо нейтрофилов собирали, переносили в стерильные центрифужные пробирки, трижды отмывали от градиента стерильным физиологическим раствором хлорида натрия, центрифугировали при 1500 об/мин в течение 10 мин и доводили до концентрации 5×10⁶ клеток. Опытные и контрольные пробы, содержащие взвесь нейтрофилов, подвергали инкубации при температуре 37 °C для исключения влияния разницы температур на активность клеток. Количество проб, состоящих из взвеси нейтрофилов, - 60 (30 контрольных, состоящих их «неактивированных» нейтрофилов, и 30 опытных, состоящих из нейтрофилов, на которые воздействовали НИЛИ). При проведении эксперимента учитывали, что термин «неактивированные нейтрофилы» принимается условно, т. е. без лазерного освечивания, поскольку их инкубация происходила не в физиологических условиях, а in vitro.

Лазерное воздействие проводилось с помощью аппарата Лазмик (Россия). Параметры лазерного воздействия: длина волны 635 нм, непрерывный режим, плотность мощности 0,12 мВт/см², экспозиция 10, 30, 90, 120, 150 с в автоматическом режиме таймера и 100 с - при ручном выключении (особенности лазерного терапевтического аппарата). Световое поле для освечивания взвеси клеток конфигурировали таким образом, чтобы в любой точке значение отклонения плотности светового потока было не более чем на 10%, что обеспечивало практически одинаковые условия для равномерного освечивания всей суспензии нейтрофилов.

Подсчет лизосомальной активности проводили по методу И.С. Фрейдлин (1986). Для определения лизосомальной активности 0,2 мл взвеси нейтрофилов в физиологическом растворе (концентрация 5×10⁶ клеток в 1 мл) соединяли с 0,02 мл раствора акридинового оранжевого в концентрации 2 мкг/мл. Клетки инкубировали 30 мин при 37 °C, после этого пробы центрифугировали при 1500 об/мин в течение 5 мин. Каплю осадка помещали на предметное стекло, накрывали покровным стеклом и микроскопировали под масляной иммерсией в потоке сине-фиолетового света люминесцентного микроскопа МикМед (Санкт-Петербург, Россия). Определение активности фермента НАДФН-оксидазы в нейтрофилах осуществлялось с помощью спектрофотометра Shimadzu (Япония). В состав пробы входили K, Na-фосфатный буфер, взвесь нейтрофилов в концентрации 5×10⁶ нейтрофилов в 1 мл, субстрат НАДФН (0,5 нмоль/мл) (ЗАО «БиохимМак», Россия). Активность фермента определяется по скорости НАДФН-оксидазной реакции, которую рассчитывали по убыли поглощения субстрата НАДФН при 340 нм за счет его окисления по формуле:

v=(ΔD∙60∙1000)/(ε∙t∙α),

где v - скорость реакции (пмоль/мин∙10³ клеток); ΔD - измеренная убыль оптической плотности за период измерения; t - период измерения (с); ε - коэффициент миллимолярной экстинкции, равный 6,22 мМ; α - количество клеток в пробе; 60 - коэффициент пересчета секунд в минуты; 1000 - коэффициент пересчета на 1000 клеток. Результаты исследования представляли графически по методу Корниш-Боумена. Вместо обычной формы записи уравнения Михаэлиса-Ментен использовали преобразованную форму - зависимость V от Km:

V=v+v/s×Km,

где v - скорость реакции (пмоль/мин∙10³ клеток); s - концентрация НАДФН (нмоль/мл); Km - константа Михаэлиса (мкМ); V - максимальная скорость реакции (пмоль/мин∙10³ клеток). Для пары значений v и s строили график v (s), Km и V определяли графически.

Полученные результаты исследований были подвергнуты обработке методами вариационной статистики с помощью пакета прикладных программ Statistica for Windows (базисная версия). Результат считался достоверным при р<0,05.

В экспериментальной модели был изучен процесс дегрануляции лизосомальных гранул НГ и изменение содержания данными клетками фермента НАДФ-оксидазы под действием НИЛИ в непрерывном режиме за различные временные промежутки. За рабочую гипотезу принято предположение о том, что изменение дегрануляции лизосом лейкоцитов может быть связано с переменой концентрации фермента НАДФ-оксидазы, причем усиление дегрануляционных возможностей находится в пропорциональной зависимости от выработки этого фермента. Было показано, что максимальные активность лизосом и сброс лизосомальных гранул происходят при экспозиции 90-100 с при возникновении плато при экспозициях 120 и 150 с (р<0,05). При меньших экспозициях освечивания НИЛИ НГ (10 и 30 с) выраженного эффекта также не наблюдалось (р>0,05 и р=0,9 соответственно) (рис. 1).

Таким образом, НИЛИ красного спектра при определенных параметрах воздействия (длина волны 635 нм) является физическим стимулом, усиливающим экзоцитоз нейтрофилами лизосомальных гранул in vitro. Ответ нейтрофилов на лазерное воздействие, выражающееся в резком усилении их лизосомальной активности при оптимальной экспозиции 90-100 с позволяет предположить, что оно является триггером, стимулируя экзоцитоз гранул нейтрофилов, что в конечном итоге приводит к усилению метаболических процессов в них, в частности к усилению выработки фермента НАДФ-оксидазы. Этот результат косвенно подтверждает высказанное ранее предположение о ведущей роли ионов кальция, высвобождаемых из внутриклеточных депо [9, 10], которые, как известно, распространяются в виде волн с периодом 100 с (рис. 2) [12].

Для изучения активности фермента НАДФ-оксидазы в серии опытов в аналогичных условиях выделенные из крови доноров нейтрофилы подвергали лазерному освечиванию при температуре 37 °C, для чего в силиконизированную кювету со светоизолированными стенками вносился 1 мл раствора Хенкса, содержащего 5×10⁶ нейтрофилов в 1 мл. Параллельно проводили определение активности НАДФ-оксидазы интактных нейтрофилов. Анализ воздействия НИЛИ на нейтрофилы, выделенные из периферической крови доноров, показал его стимулирующее влияние. При освечивании суспензии нейтрофилов, выделенных из периферической крови доноров, отмечено достоверное изменение скорости НАДФН-оксидазной реакции более чем в 6 раз относительно неактивированных НИЛИ нейтрофилов и более чем в 2 раза относительно показателей НГ после 30-секундной экспозиции (см. таблицу). Максимальные значения НАДФ-оксидазной активности регистрировались при экспозиции 90 и 100 с и продолжали наблюдаться, хотя и в меньшей степени, при экспозиции 120-150 с. Показано, что при экспозиции лазерного воздействия 90-100 с создаются максимально эффективные и оптимальные условия усиления активности фермента, возможно, за счет максимальной концентрации Ca²⁺ в этот период времени. Вероятнее всего, увеличение скорости протекания НАДФН-оксидазной реакции у нейтрофилов происходит вследствие активации под действием НИЛИ биосинтеза нуклеиновых кислот и белков, окислительно-восстановительных реакций, действия ферментных систем, в том числе гексозомонофосфатного шунта и НАДФ-оксидазы, и, как известно, все эти процессы являются Са²⁺-зависимыми [10]. Полученные в результате исследования данные также подтверждают предположение, согласно которому освечивание НИЛИ приводит к лазериндуцированному усилению активности окислительно-восстановительных мессенджеров и, как следствие, к респираторному взрыву фагоцитов [7].

Дальнейшее увеличение экспозиции приводило к снижению скорости реакции НАДФН-оксидазы нейтрофилов, при этом не выявлено достоверных различий по скорости оксидазной реакции между активированными НИЛИ и «неактивированными» нейтрофилами (р=0,93 и р>0,005 соответственно). Полученные нами данные согласуются с результатами Е.Б. Меньшиковой и соавт. [6], обозначившими данную ситуацию как процесс, возможно, связанный с энергетическим перенасыщением акцепторных систем клетки.

1. Оптимальный временной интервал воздействия НИЛИ (длина волны 635 нм, непрерывный режим, плотность мощности 0,12 мВт/см²) на нейтрофилы периферической крови in vitro составляет 90-100 с, что приводит к достоверному усилению лизосомальной активности нейтрофильных и усилению процесса дегрануляции лизосомальных гранул.

2. Достоверные изменения показателей НАДФН-оксидазной активности НГ, выделенных из периферической крови доноров, зарегистрированы при оптимальной экспозиции 90-100 с.

3. В методиках лазерной терапии, по крайней мере, направленных на регулирование иммунной системы, необходимо задавать оптимальную экспозицию 90-100 с (1,5 мин), не более.

Конфликт интересов отсутствует.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования, сбор и обработка материала, написание текста, редактирование: О.Г., О.З., М.Ш., С.М.

Статистическая обработка данных: С.М.