Церебролизин, действующим началом которого является пептидный экстракт мозга молодых свиней, используется для восстановления неврологических функций у пациентов с инсультом, травмой мозга, деменцией. В его состав входят пептиды с низкой молекулярной массой — более 95% — молекулы с массой менее 6000 Да и менее 5% — с массой 6000—10000 Да [1]. Такие пептиды способны преодолевать гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) и поступать в нейроны. Применение церебролизина при инсульте и черепно-мозговой травме достоверно уменьшает неврологический дефицит [2], улучшает когнитивные способности [3], восстанавливает биоэлектрическую активность мозга [4], снижает объем зоны инфаркта [5]. Церебролизин оказывает нейрорегенеративное воздействие [6], уменьшая нарушения структуры нейронов [7], снижает когнитивную дисфункцию на моделях диабета, снижая уровень провоспалительного фактора некроза опухоли (ФНО-α) и повышая — инсулиноподобного гормона роста IGF-1, серотонина, а также оказывает антиоксидантное действие [8].

Нами изучались различные свойства церебролизина, включая состояние мембранной фракции [9], витаминную активность [10], аминокислотный [1], микроэлементный [11] и пептидный составы [12]. Анализ препарата позволил установить наличие активных пептидных фрагментов фактора роста нервов (ФРН) и ряда нейротрофических пептидов, стимулирующих регенерацию нейронов, рост аксонов и другие аспекты функционирования нейронов. Показано, что в его состав входят нейропептиды, являющиеся биологически активными фрагментами ростовых факторов нервной ткани. В состав легкой пептидной фракции церебролизина (до 1500 Да) входят активные фрагменты ФРН, энкефалинов, тиролиберина, орексина и галанина. Анализ их молекулярно-фармакологического действия показал перспективность исследований синергичных эффектов между нейроактивными пептидами церебролизина и нейроактивными микронутриентами [12]. Установленное в эксперименте повышение активности сигнального каскада Shh под воздействием церебролизина связано с потенцированием пептидными фрагментами ФРН действия витамин-А-зависимых рецепторов ретиноидов, стимулируюших долговременный рост нейритов.

Литий способствует повышению скорости роста нейронов и обеспечению устойчивости к окислительному стрессу [13], улучшению пространственной памяти, предотвращению негативного влияния хронического стресса [14]. Назначение лития вызывает увеличение объема серого вещества [15]. Хотя в большинстве экспериментов использовались концентрации 0,2—0,5 мМ, нейропротективный эффект может наблюдаться при гораздо меньших концентрациях (0,01—0,1 мМ) [16]. Нейротрофические эффекты возникают за счет увеличения экспрессии нейротрофических факторов [17].

Проведенные нами ранее экспериментальные исследования показали существование синергизма между литием и активными нейропептидами церебролизина [18]. Следует отметить, что через ГЭБ в первую очередь проникают молекулы с меньшей молекулярной массой (несколько тысяч Да). Поэтому для адекватного моделирования терапевтического процесса в экспериментах in vitro и in vivo мы использовали экстракт легких пептидных фракций церебролизина (до 1500 Да), в состав которого и входят фрагменты ФРН, энкефалинов, орексина и галанина. Цель исследования — изучение синергизма церебролизина и нейроактивного микроэлемента лития.

Работа выполнена на 60 взрослых белых крысах-самцах массой 200—300 г, которые содержались в пластиковых клетках изолированно друг от друга при естественном освещении, температуре воздуха около 20—22 °С, свободном доступе к пище и воде. Критериями отбора животных, наряду с массой тела и полом, являлись их общее состояние, активное поведение, гладкая блестящая шерсть и чистый кожный покров, отсутствие внешних признаков заболеваний. Экспериментальные животные были рандомизированы на шесть групп (по 10 животных в каждой группе): 1-я группа — интактный контроль, 2-я группа — интактные животные, получавшие церебролизин внутрибрюшинно; 3-я группа — интактные животные, получавшие церебролизин интраназально; 4-я группа — животные с моделью хронической двусторонней окклюзии общих сонных артерий, получавшие плацебо; 5-я группа — животные с моделью хронической двусторонней окклюзии общих сонных артерий, получавшие церебролизин внутрибрюшинно; 6-я группа — животные с моделью хронической двусторонней окклюзии общих сонных артерий, получавшие цитрат лития перорально (30 мкг/кг). Всем экспериментальным животным было проведено неврологическое тестирование.

Животным 2-й, 3-й и 5-й групп церебролизин вводили внутрибрюшинно (215 мг/кг/сут), 3-й группы— интраназально в течение 14 сут, а животные 6-й группы получали цитрат лития в течение 30 сут. Затем вновь выполнялось неврологическое тестирование, после которого у животных 4-й и 5-й групп воспроизводили модель хронической двусторонней окклюзии общих сонных артерий. Через 14 дней выполнялось заключительное неврологическое тестирование, затем крысы подвергались эвтаназии посредством хлоралгидрата (700 мг/кг) для проведения патогистологического исследования и анализа содержания микроэлементов в ткани головного мозга. Оценку сложного двигательного поведения проводили по методике D. Combs и L. D’Alecy [19], включающей тесты с наклонной проволочной платформой, удержания равновесия на горизонтальном стержне, подвешивания на горизонтально натянутой проволоке.

В данной модели наблюдалось снижение кровотока лишь до 30% от исходного; выживаемость составляла 75—80% [20]. У большинства выживших животных в остром периоде отмечался небольшой неврологический дефицит, так что модель применима для оценки начальных дегенеративных изменений головного мозга. Животным под наркозом (хлоралгидрат, 300 мг/кг внутрибрюшинно) проводился разрез мягких тканей передней поверхности шеи, после чего с обеих сторон выделялись и перевязывались общие сонные артерии и раны послойно ушивали. Операция занимала 4—6 мин.

После декапитации выполнялось исследование полости черепа и выделение головного мозга на уровне ствола. В течение 2 сут головной мозг фиксировался в 10% растворе забуференного формалина, затем рассекался на пластины толщиной 3 мм во фронтальной плоскости с выделением зоны операционного повреждения. После обезвоживания в этиловом спирте и ксилоле изготавливались парафиновые блоки. Патогистологическое исследование проводилось на серийных срезах толщиной 5—6 мкм, которые окрашивались гематоксилином и эозином, реактивом Шиффа (ШИК-реакция). Микрофотографии были получены с помощью исследовательского микроскопа «Micros» на анализаторе изображений BioVision (Австрия).

Использовались 7—8-суточные культуры, полученные методом ферментно-механической диссоциации клеток мозжечка 7-дневных крыс. Через 5 мин после наступления смерти крысы стерилизовались 70% спиртом, быстро вскрывался череп, извлекался мозжечок и помещался в пластиковую чашку Петри, заполненную фосфатным буфером, лишенным ионов кальция и магния. Фрагменты ткани инкубировали 15 мин при 37 ^оС в фосфатном буфере, содержащем 0,05% трипсина, 0,02% ЭДТА и 0,8% глюкозы. После инкубации ткань промывали в двух сменах фосфатного буфера и один раз средой культивирования и подвергали механической диссоциации в питательной среде для культивирования, в состав которой входят 90% среды Игла, 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мМ глутамина, 5 мМ KCl и 10 мМ буфера НЕРЕS, pH 7,2—7,4.

Суспензию клеток центрифугировали 1 мин при 1000 об/мин, супернатант удаляли, а осадок ресуспендировали в питательной среде. Культивирование производили в 96-луночных пластиковых планшетах, покрытых полиэтиленимином или полилизином, в питательной среде с уровнем KCl 25 мМ. В каждую ячейку планшета добавляли по 0,1 мл суспензии клеток. Культивирование производили 7—8 суток в инкубаторе, заполненном газовой смесью (95% воздуха + 5% СО2), при температуре 35,5 ^оС и относительной влажности 98%. К этому сроку культивированные зернистые нейроны (КЗН) достигают своей морфологической и нейрохимической зрелости. Состояние культур контролировали ежедневно и на каждом этапе эксперимента путем визуального просмотра в инвертированном микроскопе при фазовом контрасте. Вещества добавляли в среду культивирования на 2-е сут на весь срок культивирования (до 7 сут). Исходя из концентрации вещества в пробирке (10 мМ), его минимально возможное разведение для добавления к культурам 1:10, чтобы сохранить необходимые свойства питательной среды, т. е. 1 мМ. Для анализа были выбраны следующие концентрации: 0,1; 0,2; 0,5; 1,0 мМ. Количественную оценку выживаемости клеток производили с помощью прямого подсчета живых нейронов. Клетки-зерна идентифицировались как небольшие, 7—10 мкм в диаметре, округлые или овальные нейроны. При окраске фиксированных культур трипановым синим хорошо видны ядра КЗН, занимающие бо́льшую часть тел нейронов, и окруженные тонким ободком цитоплазмы (рис. 1).

Для каждого вещества было выполнено как минимум 3 эксперимента, на каждую точку брали по 3 культуры, в каждой из которых фотографировали и просчитывали по 5 последовательных полей зрения (как минимум 45 полей зрения из 9 культур трех независимых экспериментов). Количество нейронов с неизмененной морфологией в контрольных культурах принимали за 100% выживаемости. Для статистического анализа использовали тест ANOVA с поправками Бонферрони—Даннетта. Отличия между группами считались достоверными при p<0,05. Результаты выражали как среднее ± стандартное отклонение.

Было выполнено моделирование повреждения культур нейронов глутаматом («Sigma», США, N.G-1626), который оказывал дозозависимый токсический эффект. Выбор концентрации (из 3 использованных) проводили в каждом опыте таким образом, чтобы выживаемость КЗН составляла 30—80% от контроля. Именно такая выживаемость позволяет выявлять действие различных веществ на процесс гибели клеток. При выживаемости менее 30 или более 80% нейропротективные эффекты могут не проявиться. В дальнейших исследованиях использовали подсчет клеток при действии предполагаемых нейропротекторов, добавляя в среду токсические концентрации глутамата (100—500 мкМ).

Проводились очистка препарата, затем хроматографическое выделение легкой пептидной фракции. Очистка состояла в отделении липидной фракции и обессоливании. Для этого использовался модифицированный метод Брокерхоффа—Даусона—Хюбшера [21]. Сначала проводили мягкое щелочное дезацилирование фосфолипидов. Методику отрабатывали на смеси 1 мл протеолипосом из 1—20 мг фосфатидилхолина и 0,05—0,2 мг бацитрацина или грамицидина А; 1 мл образца очищенного церебролизина-1 лиофилизировали, доливали гексан, метанол (1:1) и разводили в 2 раза 0,25 М NaOH в метаноле. 45 мин инкубировали при встряхивании при комнатной температуре, включая 15 мин — при 75 °C. Последовательно приливали метанол, гексан и воду (1:4:4), перемешивали и центрифугировали 1 мин при 1000 g. Фракцию с гексаном отсасывали, водно-метанольную — нейтрализовали HCl до pH 4—6. К нейтрализованной водно-метанольной фракции добавляли гексан, перемешивали, центрифугировали 1 мин при 1000 g, осторожно отсасывали фракцию с гексаном, не затрагивая осадок на границе раздела фаз. Повторяли процедуру 4 раза. Водно-метанольную фракцию объединяли, лиофилизировали, осадок ресуспендировали сначала в смеси метанол: вода (1:1), супернатант сливали, затем в смеси хлороформ: метанол (1:1), 0,2% ТФУ, супернатанты объединяли, высушивали и обессоливали.

Обессоливание пептидов проводили на мини-колонке 0,75×4,5 см («Raining Instrument», США) при помощи центрифугирования [22]. В колонку наливали 2 мл сефадекса G-10 («Pharmacia», Швеция), декантированного в смеси метанол: вода (85:15), каплями наливали 160 мкл того же раствора и уравновешивали на центрифуге 1 мин при 1000 g. Процедуру повторяли до тех пор, пока на выходе не оставалось 150 мкл раствора. 160 мкл образца каплями наносили на гель и центрифугировали, как описано выше. Гель после однократного использования заменяли. После процедуры обессоливания потери белка составляли не более 35%. Хроматографическое разделение пептидной фракции проводилось с использованием ВЭЖХ хроматографа AGILENT на колонке Диасорб С16Т («Элсико», Россия) [23]. Скорость потока составила 0,8 мл/мин, объем образца: 50—1000 мкл при температуре 20 °C. Детекция фракций проводилась посредством УФ-детектора на частоте волны 214 нм, отбирались фракции с молекулярными массами до 1500 Да.

Масс-спектры получали на приборе Reflex IV («Bruker», Германия) MALDI-TOF в рефлекторном режиме, используя азотный лазер с длиной волны 337 нм и частотой импульса 9 Г.в режиме положительных ионов. Время задержки анализатора — 200 нс, напряжения на электроде ускорителя — 20,0 кВ, накапливающем электроде — 16,5 кВ, фокусирующей линзе — 9,5 кВ, рефлекторе — 23,0 кВ. Полученные масс-спектры пептидов дополнительно калибровали по внутренним стандартам по известным массам [24]. Каждый масс-спектр получали усреднением 300 накоплений с разных точек образца при мощности лазерного излучения на уровне порогового значения. Для всех образцов использовали в качестве матрицы 65 мМ раствор 2,5-дигидроксибензойной кислоты («Fluka», Германия) в 20% ацетонитриле с добавлением 0,1% трифторуксусной кислоты («Merck», Германия). Лиофилизированные пептиды растворяли в 10 мкл 50% ацетонитрила с добавлением 0,1% трифторуксусной кислоты; 0,3 мкл образца наносили на мишень («Bruker Daltonic», Германия), добавляли 0,3 мкл раствора матрицы и высушивали на воздухе. Для рекристаллизации добавляли 1—2 раза по 0,3 мкл раствора матрицы с промежуточной просушкой на воздухе до получения видимых при 10-кратном увеличении кристаллов. Все использованные растворители, включая воду («Merck», Германия), были только аналитической чистоты или специальные (для масс-спектрометрии).

Элементный анализ церебролизина проводился методом масс-спектрометрии. Образцы разбавляли бидистиллированной водой в соотношении 1:3 по объему. В качестве внутреннего стандарта в растворы вводили индий в концентрации 25 мкг/л. Калибровочные растворы были приготовлены из стандартных растворов фирмы «Merck» с известным содержанием в диапазоне от 5—1000 мгк/л (7—10%). Полученные растворы анализировались на масс-спектрометре с ионизацией в индуктивно-связанной плазме «VG Plasma Quad PQ2 Turbo» (Англия), рабочая мощность СВЧ-генератора 1,3 кВт, расход плазмообразующего газа (аргон) 14 л/мин, расход транспортирующего газа 0,89 мл/мин, для определения щелочных металлов расход — 1,05 мл/мин. Проводилось 3 экспозиции каждого образца, время интегрирования сигнала 60 с. Результаты анализа «холостой пробы» автоматически вычитались в анализе. Единицы измерения — мкг/кг (ppb).

С помощью одноразовых пластиковых минипинцетов и скальпелей («Perkin Elmer») забирались образцы из 5 областей мозга животных: лобной, височной, теменной долей, мозжечка и промежуточного мозга. Образцы сохранялись в промаркированных пакетах в жидком азоте до момента проведения масс-спектрометрического исследования. Затем полученные образцы высушивались при температуре 105 °C в сушильном шкафу в течение 6 ч. После этого они взвешивались на аналитических весах AD-6 Autobalance («Perkin Elmer») с точностью до 0,1 мг. Навески материала переносились в автоклав и к ним добавлялся 1 мл 70% HNO3. Затем автоклав помещался в микроволновую систему подготовки проб MD-2000 («CEM», США), которая устойчиво обеспечивала достаточно высокое давление и температуру кипения HNO3. После охлаждения образца в течение 10 мин в автоклав добавляли 1 мл Н2О2 (24%) особого чистого вещества (ОСЧ). После охлаждения в течение 60 мин полученных растворов от них в пластиковые сосуды отбирались образцы в объеме 1 мл, которые разбавлялись в 5 раз бидистиллированной и деионизированной водой. Для контроля чистоты анализа отдельно был приготовлен раствор «холостой пробы» с содержанием HNO3, H2O2, H2O в пропорциях, идентичных их содержанию в исследуемых образцах. Описанная выше методика подготовки с использованием СВЧ-нагрева в тефлоновых «бомбах» позволяет проводить быстрое вскрытие биопробы, избежать потерь летучих элементов (As, Se и др.), с высокой эффективностью разложить биологическую матрицу, влияющую на результаты анализа. Полученные растворы анализировались на масс-спектрометре с ионизацией в индуктивно-связанной плазме VG Plasma Quad PQ2 Turbo (Англия). В качестве внутреннего стандарта в растворы вводили индий в концентрации 25 мкг/л. Калибровочные растворы были приготовлены из стандартных растворов производства VTRC с известным содержанием в диапазоне от 5—1000 мгк/л. Рабочая мощность СВЧ-генератора была 1,3 кВт. Расход плазмообразующего газа (аргон) — 14 л/мин, расход транспортирующего газа — 0,89 мл/мин. Проводилось 3 экспозиции каждого образца, время интегрирования сигнала 60 с.

Масс-спектрограмма пептидной фракции показала, что в препарате не содержится пептидов с молекулярной массой более 10 000 Да, а 95% пептидов имеют массу до 6000 Да [1, 9]. Принимая во внимание, что площадь масс-спектра соответствует 15% сухого остатка, масс-спектрограмма позволяет оценить содержание в его составе активных пептидов GEFSV (607 Да) и NSYCTTT (820 Да) ФРН, энкефалин-эндорфиновых пептидов YGGFL (588 Да), GGFLR (582 Да), YGGFM (606 Да), активных пептидов орексина CCRQK (670 Да) и галанина WWLNSAGY (1024 Да) [9, 12].

Проведенный анализ показал, что изучаемые нейропептиды присутствуют в составе препарата в наномолярных концентрациях. При назначении церебролизина по 10 мл/сут, с учетом объема крови человека (4—6 л), их концентрации в крови будут в 1,5—2 выше.

Через 2 нед после воспроизведения модели ишемического повреждения головного мозга в 4-й и 5-й группах было выявлено снижение показателей сложного двигательного поведения, определяемых как сумма баллов по шкале Combs и D’Alecy в отдельных тестах. Общая сумма баллов была значимо выше в 5-й группе по сравнению с контролем: в 5-й группе — 8,2±0,6; в 4-й группе — 5,0±1,6 (p<0,008). В контрольной группе отмечено также значимое ухудшение выполнения животными тестов с наклонной проволочной платформой (p<0,05) и удержания на горизонтальном стержне (p<0,01). В 5-й группе, несмотря на снижение общей суммы баллов, достоверно ухудшилось лишь выполнение теста подтягивания (p<0,05). Тест удержания на наклонной платформе животные данной группы также выполняли значительно лучше, чем в контроле (p<0,002). Таким образом, результаты тестирования указывают на снижение неврологического дефицита у животных при применении церебролизина.

Эксперименты на КЗН мозжечка показали, что в 7-суточных культурах, не обработанных глутаматом, при действии церебролизина выживаемость нейронов не изменяется по сравнению с контролем, где вместо исследуемого вещества вносили фосфатный буфер.

При действии церебролизина на нейроцитотоксичность глутамата выявлен достоверный защитный эффект. Выживаемость нейронов при воздействии глутамата составила 45,1±2,1%, а глутамата с церебролизином при разведении в 5000—10 000 раз (0,1—0,2 мл церебролизина на 1 л дистиллированной воды) выживаемость составила 53,0±2,8 и 51,5±2,8% соответственно (рис. 2, 3). Таким образом, церебролизин достоверно повышает выживаемость нейронов, в среднем, на 8±3% (p<0,05) в условиях избытка глутама (200 мкмоль/л).

Существование нейропротективного эффекта было подтверждено и при добавлении церебролизина на 6-е сутки культивирования, т. е. всего за 24 ч до токсического воздействия глутамата. И в этом случае был выявлен защитный эффект при разведении церебролизина в 10 000 раз (0,1 мл/л) (рис. 4). Полученные нами данные согласуются с in vitro исследованиями B.Hutter-Paier et at., в которых Церебролизин предотвращал опосредованное L-глутаматом повреждение нейронов [35].

Результаты неврологического тестирования и исследования выживания нейронов в культуре подтверждаются гистологическим анализом образцов ткани мозга животных 4-й и 5-й групп. Гистоморфологические исследования показали, что в контроле (4-я группа) в краях разреза головного мозга наблюдается повсеместное повреждение нейроцитов, среди которых преобладали «темные» (пикноморфные) формы (рис. 5, а). Макрофагальная реакция хорошо выражена, с образованием «зернистых шаров», заметно образование микрокист. Зона некроза обильно инфильтрирована лимфоцитами, инфильтрат в основном состоял из плазматических клеток (см. рис. 5, б). В 5-й группе в большинстве наблюдений отмечается частичная гибель нейронов на фоне таких признаков необратимых изменений, как гиперхроматоз ядра, хроматолиз и вакуолизация цитоплазмы. Выявлялось значительное количество нейронов с признаками обратимости ишемических изменений (побледнение ядерной мембраны и помутнение нуклеоплазмы, см. рис. 5, в). Лимфоцитарная провоспалительная инфильтрация имела очаговый характер (см. рис. 5, г).

Таким образом, при исследовании головного мозга крыс, получавших церебролизин, выявлена повышенная устойчивость нейронов к повреждению. Характер гибели нервных клеток с преобладанием «светлых» форм свидетельствует о задержке развития необратимой стадии некроза.

Анализ содержания микроэлементов в легкой пептидной фракции церебролизина подтвердил, что процесс фракционирования не нарушил степень очистки препарата и не привнес в состав экстракта новых микроэлементов. Суммарное содержание токсических и условно-токсических элементов в легкой пептидной фракции составило менее 0,35 мкг/кг, а в церебролизине — 0,44 мкг/кг, причем в составе экстракта не было обнаружено токсических Cd, Tl, Pb, Bi, Th, U, Be, Ti, Ni [26]. Анализ содержания лития, магния, селена подтвердил, что в экстракте пептидной фракции эти элементы содержатся в очень малых количествах (суммарно, менее 100 мкг/кг). Содержание лития составило всего 5,6±2,2 мкг/кг, что не является достаточным для проявления его нейропротекторных свойств. Этот результат также подтверждает, что оказываемый церебролизином эффект на накопление лития в коре мозга обусловлен именно пептидным/аминокислотным составом препарата. Анализ содержания лития в коре головного мозга показал, что внутрибрюшинное и, в особенности, интраназальное введение церебролизина приводило к достоверному повышению его содержания в коре мозга (рис. 6). Во 2-й группе концентрация лития в коре повышалась на 42±22 мкг/кг (p=0,0058), а в 3-й — на 59±20 мкг/кг по сравнению с контролем (р=0,0014). Различия между 2-й и 3-й группами не носили достоверного характера (р=0,08).

В соответствии с результатами анализа микроэлементного состава церебролизина, содержащееся в нем количество лития недостаточно для столь выраженного увеличения его концентрации в головном мозге. Вероятно, нейропептиды церебролизина стимулируют перераспределение лития в организме в пользу нервной ткани. Можно также предположить, что происходит более эффективное усвоение лития, поступающего в организм с пищей и с водой. Кроме биологически активных нейропептидов в церебролизине в значительном количестве присутствуют аминокислоты (75%), обладающие нейропротективным и нейротрофическим действием (регуляция уровня глутамата, модуляция NMDA-рецепторов и ингибирование эксайтотоксичности, антиоксидантные эффекты и др.) [1]. Помимо этого, аминокислоты также являются транспортерами катионов внутрь клеток. Можно предположить, что присутствие аминокислот в составе церебролизина способствует более активному транспорту лития из крови в цереброспинальную жидкость (ЦСЖ), а из ЦСЖ — внутрь нейронов.

Для количественной оценки неврологического дефицита в модели хронической двусторонней окклюзии общих сонных артерий (4-я и 6-я группы) проводилось исследование сложного двигательного поведения в тесте Combs и D’Alecy. До создания ишемии средняя оценка по тесту не отличалась между 4-й и 6-й группами. Показатели отдельных тестов (наклонная платформа, горизонтальный стержень, подтягивание на проволоке) также не имели значимых различий между изучаемыми группами. На 7-й день ишемии в обеих группах было выявлено снижение средних значения теста. Во всех группах снизился интегральный показатель сложного двигательного поведения, определяемый как сумма баллов в отдельных тестах. В большей степени ухудшилось выполнение животными теста подтягивания на горизонтально натянутой проволоке. В 4-й группе значения снизились до 5,0±1,6, а в 6-й группе — до 8,3±1,0 балла (р=0,007; t-тест). В контроле отмечено значимое ухудшение выполнения животными тестов с наклонной проволочной платформой и удержания на горизонтальном стержне. В 6-й группе, несмотря на снижение общей суммы баллов, отмечено значимое ухудшение только выполнения теста подтягивания, а снижения показателей в остальных тестах зафиксировано не было. Выявленные изменения свидетельствуют о меньшем неврологическом дефиците у животных, получавших цитрат лития, до создания хронической двусторонней окклюзии общих сонных артерий.

Эксперименты на КЗН мозжечка показали, что в 7-суточных культурах, не обработанных глутаматом, при воздействии церебролизина с цитратом лития выживаемость нейронов не изменяется по сравнению с контролем.

В модели глутаматного воздействия (250 мкМ глутамата) в контрольной группе выживало 20,0±4,0% нейронов. Добавление комбинации церебролизина с цитратом лития повышало выживаемость нейронов до 61,2±3,6% при концентрации лития 0,1 мМ и до 82,2±4,2% при концентрации лития 1 мМ. Таким образом, смесь церебролизина и цитрата лития при концентрациях лития 0,1—1,0 мМ дозозависимо защищает нейроны в культуре от токсического действия глутамата (рис. 7, рис. 8).

Несмотря на обилие публикаций по исследованию нейропротекторов и нейротрофических свойств лития, взаимодействия между литием и такими нейропептидами, как ФРН, энкефалины, орексин и галанин, остаются малоизученными. Известно, что литий повышает содержание ФРН, мозгового нейротрофического фактора и глиальных клеток в гиппокампе, фронтальной коре, затылочной коре и полосатом теле [27, 28]. Повышение концентрации хлорида лития в питьевой воде приводило к повышению его концентрации в сыворотке крови до 0,72±0,08 ммоль/л, что было ассоциировано с увеличением концентрации ФРН в лобной коре (на 23%), гиппокампе (на 72%), миндалевидном теле (на 74%) и лимбическом переднем мозге (на 47%) (р<0,05) [29].

На синергизм между литием и ФРН может указывать тот факт, что литий повышает размеры транспортных пузырьков в нейронах, которые претерпели дифференциацию именно под воздействием ФРН. В обработанных литием клетках отмечено значительное увеличение их количество (в 1,5—2 раза) и диаметра (примерно на 15%) [30].

В эксперименте внутрибрюшинное введение лития (4 ммоль/кг в течение 6 сут) повышает уровни энкефалинов в базальных ганглиях крыс [31]. Воздействие лития на энкефалиновые сигнальные системы требует соблюдения оптимального интервала дозирования. Диета с меньшим содержанием лития приводила к повышению его уровня в мозге до 0,40—0,55 ммоль/л, а диета с более высоким его содержанием — к повышению до 0,70—1,0 ммоль/л. При диете с меньшим содержанием лития, через 3 нед было отмечено его достоверное по сравнению с контролем повышение. После 3 нед диеты с низким содержанием лития уровень лейцин-энкефалина в бледном шаре и в nucleus accumbens повышался. При диете с более высоким содержанием лития, повышения уровней лейцин-энкефалина не наблюдалось [32].

Ионы лития могут участвовать в регуляции сродства опиоидных рецепторов к энкефалинам [33]. Кроме того, гликогенсинтазы-киназа 3b (GSK-3b) — основной фермент, опосредующий нейропротективные эффекты лития, ингибируется как ионами лития, так и агонистами дельта-опиоидных рецепторов. Ингибирование GSK-3b ионами лития и агонистами дельта-опиоидных рецепторов осуществляется посредством фосфорилирования GSK-3b, что соответствует активации сигнальных путей клеточного выживания [34]. Таким образом, имеющиеся данные позволяют предполагать, что установленный нами синергичный эффект между ионами лития и нейропептидами церебролизина обусловлен эффектами ФРН и энкефалинов.

В работе впервые установлено существование нейропротективного и нейротрофического синергизма между ионами лития и нейропептидами церебролизина. Фармакокинетический синергизм заключается в ускоренном накоплении лития в тканях головного мозга под воздействием пептидов церебролизина. Иначе говоря, нейропептиды церебролизина потенцируют таргетную доставку ионов лития в мозг и усвоение их нейронами. Существование фармакодинамического синергизма между литием и нейропептидами церебролизина вытекает из всего комплекса проведенных нами экспериментальных, нейроцитологических, гистоморфологических исследований и анализа микроэлементного профиля биосубстратов мозга. Ранее нами было установлено, что в состав легкой пептидной фракции церебролизина входят активные фрагменты ФРН и энкефалины. Вероятные клеточные механизмы осуществления исследуемого синергизма между литием и пептидами церебролизина включают повышение литием размеров и числа больших транспортных везикул, необходимых для секреции моноаминов и других нейротрансмиттеров в нейронах под воздействием ФРН; повышение литием аффинитета опиоидных рецепторов к энкефалинам; совместное ингибирование литием и энкефалинами GSK-3b.