Отечественная неврологическая практика имеет более чем 20-летний клинический опыт успешного использования нейропротективных препаратов в лечении острых нарушений мозгового кровообращения. Учитывая гетерогенность патофизиологических сценариев острого ишемического повреждения головного мозга, особый интерес представляют лекарственные средства с мультимодальным цитопротективным действием [1, 2]. В каждом случае ишемический инсульт представляет индивидуальное сочетание факторов нарушения церебральной гемодинамики и повреждения головного мозга, поэтому комплексная активация различных саногенетических процессов повышает вероятность восстановления функций нервной системы.
Универсальным механизмом при повреждении тканей и органов является синтез различных групп цитокинов, регулирующих процессы межклеточной кооперации и функциональную активность клеток, что наиболее актуально для высокодифференцированной нервной ткани [3]. В головном мозге основными источниками факторов роста нервной ткани выступают не только нейроны и клетки нейроглии, но и эндотелиоциты, входящие в состав гематоэнцефалического барьера. Фармакологическая защита различных типов клеток при развитии патологических процессов в ЦНС может способствовать активации взаимодополняющих нейротрофических комплексов и являться патогенетической основой для обоснования интимных механизмов церебропротективного действия лекарственных соединений, активно используемых в лечении пациентов неврологического и нейрохирургического профилей [4—7].
Цель настоящего исследования — изучение особенностей эндогенной и фармакологической активации нейротрофических механизмов при моделировании острого ишемического повреждения головного мозга у крыс.
Материал и методы
Исследование было выполнено на 170 самцах-альбиносах серых крыс массой тела 195—205 г без соматической и инфекционной патологии.
Включенные в эксперимент крысы были рандомизированы методом случайных чисел на три группы:
1-я — контрольная группа — включала 20 интактных животных, по результатам обследования которых были получены референтные значения (группа контроль).
Во 2-й группе у 75 животных моделировали ишемический инсульт путем электрокоагуляции проксимального сегмента левой средней мозговой артерии с одновременным наложением постоянной лигатуры на левую общую сонную артерию (группа инсульта).
В 3-й группе у 75 животных моделировали ишемический инсульт и проводили лечение путем ежедневного введения в хвостовые вены препарата цитофлавин в дозе 0,2 мл в 0,2 мл 0,9% раствора натрия хлорида со скоростью 0,5 мл/мин в течение 10 сут (группа инсульт + лечение).
Неврологическое обследование животных группы контроль проводили при включении в исследование в экспериментальных группах его выполняли непосредственно перед манипуляциями по моделированию инсульта, затем на 1, 3, 7, 14-е сутки после инсульта. Неврологическое обследование включало оценку наличия комы, птоза верхнего века, туловищной атаксии, мышечной слабости в конечностях, изменения тонуса.
Взятие биологического материала выполняли после неврологического обследования животных. Биологический материал (кровь, головной мозг) получали на 1, 3, 7 и 14-е сутки после моделирования острого нарушения мозгового кровообращения.
Забор крови проводили путем транскутанной пункции сердца под эфирным наркозом с помощью вакуумных систем Monovette с ЭДТА («Sarstedt», Германия). Обработку материала осуществляли по ранее описанной методике [8].
После взятия крови животных умерщвляли путем ингаляции паров эфира с последующим немедленным взятием образцов головного мозга и их обработкой по методике A.M. Щербакова и соавт. [9] для подготовки к иммуноферментному анализу.
С учетом необходимости комплексной оценки изучали нейронспецифическую енолазу (NSE), оксид азота (NO), сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF), фактор роста нервов (NGF) [10—14]. Исследование проводили в плазме крови и цитолизате головного мозга иммуноферментным методом.
В качестве референтных значений использовали показатели 1-й группы (контрольной): NSE в цитолизате головного мозга — 30,6±2,37 пг/г, в плазме крови — 5,5±0,41 мкг/л; NO в плазме крови — 100,5±10,11 мкмоль/л; VEGF в цитолизате головного мозга — 29,5±3,41 пг/г, в плазме крови — 34,3±7,64 пг/мл; NGF в цитолизате головного мозга — 109,1±4,37 пг/г.
В ходе исследования в соответствии с рекомендациями по обработке результатов медико-биологических исследований [15] применяли следующие процедуры и методы статистического анализа: определение числовых характеристик переменных; оценку соответствия эмпирического закона распределения количественных переменных теоретическому закону нормального распределения по критерию Шапиро—Уилка; оценку значимости различий количественных показателей в независимых выборках по Т-критерию Стьюдента; оценку значимости различий количественных показателей в независимых выборках по U-критерию Манна—Уитни. Проверку гипотезы о происхождении групп, сформированных по качественному признаку, из одной и той же популяции проводили на основе построения таблиц сопряженности наблюдаемых и ожидаемых частот, применяли критерий Пирсона χ2, метод максимального правдоподобия (в случаях его неустойчивости использовался двусторонний Fisher exact test). Описание количественных признаков выполняли с использованием среднего значения и ошибки среднего значения. При описании качественных признаков рассчитывали 95% доверительный интервал (ДИ) вероятности случайного события. Нулевая статистическая гипотеза отвергалась при уровне значимости р<0,05.
Результаты и обсуждение
Моделирование острого нарушения мозгового кровообращения приводило к развитию неврологической симптоматики и сопровождалось высокой летальностью животных экспериментальных групп (табл. 1).
Высокий уровень летальности во 2-й группе (44% животных, из них 76% в 1-е сутки) отражает валидность использованной модели ишемического инсульта. В 3-й группе летальность за весь период наблюдения составила 25,3% и была достоверно ниже, чем во 2-й группе (р=0,025). При этом общая структура летальности в обеих экспериментальных группах была сопоставимой: максимальное число павших животных (76 и 79% в группах 2-й и 3-й соответственно) отмечалось в 1-е сутки после моделирования поражения головного мозга (см. табл. 1). Таким образом, применение цитофлавина приводило к статистически значимому снижению общей летальности экспериментальных животных, что свидетельствует о церебропротективном эффекте изучаемого препарата на модели острой ишемии мозга.
Неврологическое обследование животных не выявило нарушений функций нервной системы в 1-й группе, продемонстрировало достоверно более частое появление неврологической симптоматики у крыс во 2-й и 3-й группах (p<0,001).
NSE является специфичным биомаркером нейронов, поэтому в модели острой ишемии изменение концентраций NSE в цитолизате головного мозга и плазме крови рассматривали как результат повреждения нейронов головного мозга (рис. 1, 2).
Во 2-й группе концентрация NSE в цитолизате головного мозга были выше референтных значений на 1-е (p<0,001) и 3-и сутки (p=0,006), в плазме крови — на 1-е (p=0,009), 3-и (p<0,001) и 7-е сутки (p=0,018), что свидетельствует об остром и отсроченном повреждении нейронов, сохранявшемся более 7 сут (см. рис. 1, 2). В то же время к 7 и 14-м суткам уровень NSE в плазме крови значительно уменьшался, что может отражать степень интенсивности саногенетической эндогенной нейропротекции и соответственно нормализации функционального состояния нейронов.
Динамика концентраций NSE у животных 3-й группы в цитолизате головного мозга и плазме крови свидетельствует об уменьшении повреждения нейронов уже к 3-м суткам (p<0,02). Уровень NSE в плазме крови у крыс в 3-й группе на 3, 7 и 14-е сутки был достоверно ниже, чем во 2-й группе (p<0,02). Полученные различия свидетельствуют, что применение цитофлавина позволяет на более ранних сроках обеспечить нейропротекцию при поражении головного мозга ишемического генеза.
Также обращают на себя внимание разнонаправленные изменения концентрации NSE в плазме крови к 3-м суткам — увеличение во 2-й группе (p=0,022) и уменьшение в 3-й группе (p=0,01). Вероятно, применение цитофлавина позволяет не только уменьшать, но и предупреждать вторичные механизмы отсроченного повреждения нейронов в остром периоде инсульта.
В обеих экспериментальных группах на 1-е и 3-и сутки после моделирования инсульта уровни NO в плазме крови были ниже референтных значений (p<0,001) с последующим повышением концентрации NO к 7-м суткам (p<0,01) (рис. 3). Принимая во внимание ключевую роль NO в регуляции тонуса кровеносных сосудов на уровне микроциркуляционного русла, значительное (в 2—5 раз) снижение уровней NO в 1—3-и сутки свидетельствует о развитии выраженной эндотелиальной дисфункции. Сравнение динамики концентрации NO не выявило достоверных различий между 2-й и 3-й группами. По-видимому, исследуемый лекарственный препарат не оказывает существенного влияния на активность NO-синтаз у экспериментальных животных.
Снижение уровней NSE и повышение уровней NO в цитолизате головного мозга к 7-м суткам после моделирования инсульта у крыс, не получавших фармакологическую поддержку, может отражать уменьшение повреждения нейронов и восстановление функции эндотелиоцитов как результат активации эндогенных саногенетических механизмов.
Изучение содержания факторов роста в цитолизате головного мозга и плазме крови существенно дополнило вышеописанные результаты. Концентрации NGF в цитолизате головного мозга были превышены во 2-й группе к 7-м суткам (p=0,019), а в 3-й группе — уже к 3-м суткам (p=0,049). Кроме этого, к 3-м суткам уровень NGF в цитолизате головного мозга в 3-й группе был достоверно выше, чем во 2-й (p=0,015) (рис. 4).
Изменения содержания VEGF в цитолизате головного мозга имели сходную динамику — во 2-й группе уровень этого фактора достоверно превысил референтные значения к 14-м суткам (p=0,029), а в 3-й группе — уже к 3-м суткам (p=0,041). При этом уровень VEGF в цитолизате головного мозга на 7-е сутки в группе был достоверно выше, чем в группе нелеченных животных (p=0,035) (рис. 5).
Таким образом, на используемой модели ишемического инсульта показано, что активация нейротрофических механизмов в головном мозге носила преимущественно отсроченный характер. Применение цитофлавина способствовало более раннему и более интенсивному синтезу базовых нейропротективных факторов роста — NGF и VEGF.
Основным источником NGF являются астроциты [16]. В отличие от 2-й группы, в 3-й группе получавших цитофлавин к 3-м суткам произошло повышение концентрации NGF и снижение уровня NSE в цитолизате головного мозга, что может свидетельствовать о раннем активирующем влиянии препарата на нейротрофический механизм, опосредуемый астроцитами и уменьшающий повреждение нейронов.
Снижение уровней VEGF в плазме крови (рис. 6), но не в цитолизате головного мозга (см. рис. 5) на 1-е и 3-и сутки в обеих исследуемых группах (p<0,05) согласуется с лабораторными признаками эндотелиальной дисфункции.
Во 2-й группе концентрации VEGF в плазме крови в течение всего периода наблюдения не превысили референтных значений, в 3-й группе они превысили их к 14-м суткам (p=0,002) (рис. 6). Динамика уровня VEGF в плазме крови практически полностью соответствовала динамике уровня NO в плазме крови, в том числе повышение концентраций к 7-м суткам (p<0,05), что может свидетельствовать об отсроченном улучшении функции эндотелия и его нейротрофической активности в виде синтеза VEGF.
Уровень VEGF в плазме крови, очевидно, в большей степени зависит от состояния эндотелия сосудов, что может объяснить выявленные различия в уровнях VEGF в плазме крови и цитолизате головного мозга. В 3-й группе максимальное значение концентрации VEGF в цитолизате головного мозга было зафиксировано на 7-е сутки, а в плазме крови — на 14-е сутки. Более позднее увеличение концентрации VEGF в плазме крови может быть связано с отсроченной активацией синтеза этого фактора роста эндотелиоцитами, что согласуется с данными об эндотелиопротективных свойствах цитофлавина [17].
Заключение
Результаты исследования показывают, что при моделировании ишемического инсульта у лабораторных животных происходит отсроченная активация нейротрофических механизмов, наблюдаемая в астроцитах, которая сопровождается снижением тяжести отсроченного повреждения нейронов. Применение цитофлавина в лечении экспериментального инсульта привело к более ранней и более интенсивной активации нейротрофических механизмов в астроцитах, а также отсроченной их активации в эндотелиоцитах, что патогенетически обусловливает нейропротективное действие препарата на более ранних сроках развития заболевания, уменьшение и предупреждение отсроченного повреждения нейронов. Таким образом, защита нейронов при ишемическом инсульте может быть следствием не только прямого нейропротективного влияния цитофлавина, но и ранней интенсивной активации нейротрофических механизмов в клетках глии и эндотелиоцитах, обусловленной мультимодальным цитопротективным действием лекарственного средства.