Ежегодно около 20 млн человек переносит острые нарушения мозгового кровообращения (ОНМК), а смертность от инсульта уступает лишь смертности от заболеваний сердца и опухолей всех локализаций, достигая 11—12% в экономически развитых странах. Инсульт является лидирующей причиной функциональных нарушений головного мозга: от 15 до 30% больных остаются стойкими инвалидами, и лишь у 20% лиц, перенесших ишемический инсульт, полностью восстанавливается работоспособность [1]. Среди множества лекарственных средств, применяющихся при ОНМК, особое место занимают препараты, содержащие нейропептиды, аминокислоты, цитомедины и другие биологически активные вещества тканей мозга или компонентов крови. Среди них препараты Кортексин, Церебролизин и Актовегин занимают центральное место. Один из подходов к ведению подобных пациентов — применение различных нейропротекторных лекарственных средств. Результаты метаанализа исследований эффективности применения препаратов Церебролизин, Кортексин при сосудистой деменции, болезни Альцгеймера и ишемическом инсульте показали снижение летальности по сравнению со стандартной терапией или плацебо [2].

Церебролизин является одним из самых изученных препаратов — экстрактов головного мозга крупного рогатого скота и свиней. В работе О.А. Громовой и соавт. [3] отмечено, что в препарате определены аминокислотные последовательности 14 635 пептидов 8953 из которых могут модулировать активность 275 сигнальных белков человека, включая киназы CDK1 (Cyclin-dependent kinase 1), CDK2 (Cyclin-dependent kinase 1), TGFBR2 (Transforming growth factor, beta receptor II), GSK3 (Glycogen synthase kinase 3), mTOR (mammalian target of rapamycin) и проапоптотические каспазы CASP1 (Caspase-1), CASP3 (Caspase-3), CASP6 (Caspase-6). На основе полученных исследователями результатов был сделан вывод о наличии в составе препарата Церебролизин лей- и мет-энкефалинов, фрагментов орексина, нейропептида VF, галанина и фактора роста нервов, что может объяснить его нейротрофическое действие.

Нейропротективный препарат Актовегин состоит из депротеинизированого гемодеривата телят и содержит около 200 биологически активных веществ, которые в комплексе оказывают выраженное нейпропротективное и нейрорепаративное действие, улучшая метаболизм головного мозга в условиях ишемии/гипоксии и оказывая антиоксидантный эффект [4].

Лекарственный препарат Кортексин, действующим веществом которого являются полипептиды коры головного мозга крупного рогатого скота (низкомолекулярные водорастворимые активные нейропептиды с молекулярной массой не более 10 кДа; олиго- и короткоцепочечные пептиды (90%) и аминокислоты (10%), микроэлементы). Кортексин обладает большей тканевой специфичностью именно к коре больших полушарий [5] и его нейропротективный эффект может быть более выраженным или достигнут применением меньшей дозы, поскольку перимущественно в коре больших полушарий сосредоточена метаболически активная мозговая ткань. Входящие в состав препарата пептиды относят к классу цитомединов — естественных тканевых регуляторов, оказывающих нейропротективное, стимулирующее нейро- и синаптогенез, улучшающее метаболизм действие. Основной механизм нейропротективного действия Кортексина связан с предупреждением апоптоза и гибели нервных клеток вследствие подавления образования активных форм кислорода, повышения нейропластичности [6]. В 2019 году в Eurofins Pharma Discovery Services было проведено исследование, целью которого являлась оценка лиганд-рецепторного взаимодействия препарата Кортексин методом радиолигандного связывания. Тесты были выполнены для 36 типов рецепторов, которые были распределены на группы: глутаматные, дофаминовые, опиоидные, серотониновые, ГАМК, другие. Для одного рецептора одну концентрацию исследуемого препарата тестировали в 2-х повторах. Исследуемая концентрация препарата Кортексин составляла 10 мкг/мл. В результате наибольшее сродство было отмечено к следующим рецепторам: ГАМК — рецепторы (реализуют функции основного тормозного нейромедиатора ЦНС — ГАМК) — GABAA1; глутаматные рецепторы (регулируют процессы нейрональной возбудимости и глутамат-опосредованной гибели нейронов в условиях ишемии): Ionotropic AMPA; Ionotropic kainate; Metabotropic mGluR1; Metabotropic mGluR5. Эффективность применения Кортексина, доказанная в различных исследованиях, сочетается с благоприятным профилем безопасности: Кортексин не токсичен и не обладает канцерогенным, тератогенным, аллергизирующим и иммунотоксическим эффектами [7]. Потенциальные молекулярные механизмы нейропротективных свойств препарата Кортексин касаются ключевых процессов, лежащих в основе нейропластичности: передачи сигнала, энергетического метаболизма, протеолитической модификации белков, а также процессов нейровоспаления. Нейропротективное действие Кортексина было доказано на модели выживаемости нейроцитов в условиях перекисной и глутаматной интоксикации in vitro. В условиях моделирования острой гипоксии у животных Кортексин препятствовал апоптозу нейронов и поддерживал баланс дофамина и норадреналина в определенных структурах головного мозга [6].

Оксидативный стресс выделяется в качестве ведущего патогенетического звена ОНМК и хронических нарушений мозгового кровообращения (ХНМК), а применение антигипоксантов с антиоксидантыми свойствами — важная часть фармакотерапии. Антиоксидантное действие Кортексина, Церебролизина и Актовегина является общим компонентом механизма действия этих средств, что может стать побуждающим фактором проведения сравнительного исследования их антиоксидантного действия в условиях ХНМК [8]. Тем более, что, несмотря на наличие большого количества работ, посвященных доклиническим исследованиям препаратов, созданных на основе нейропептидов или компонентов крови животных, сведения о результатах сравнительных исследований, оказываемых ими эффектов, выполненных одновременно на релевантных экспериментальных моделях, в литературе широко не представлены.

Известно, что при нарушениях мозгового кровообращения формируется глобальная или очаговая ишемия мозга, сопряженная с активацией процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ), приводящих к повреждению нейронов и интенсификации нейродегенеративных процессов. Поэтому при изучении механизмов нейропротективного действия исследуемых препаратов различных групп важное место отводится оценке их влияния на эффективность функционирования антиоксидантной системы.

Цель исследования — сравнительное изучение антиоксидантных эффектов препаратов Кортексин, Церебролизин и Актовегин у животных, перенесших ХНМК.

Материал и методы

Эксперимент выполнен на 129 крысах-самцах (масса тела 300—350 г, Филиал «Столбовая» ГУ НЦБМТ РАМН (Московская обл.)). Возраст животных к началу эксперимента составлял 40—42 недели. После поступления из питомника животных помещали на карантин длительностью 14 дней в виварий ВолгГМУ, в помещении которого крысы содержались на протяжении эксперимента. Крыс содержали при температуре 20±2 °C в условиях 40—60% влажности в условиях сменяющегося цикла день/ночь (12/12 ч) с неограниченным доступом к корму и воде.

Экспериментальную патологию моделировали следующим образом: после наркотизации животного осуществляли оперативный доступ к общим сонным артериям, которые подвязывали к нейлоновым нитям определенного диаметра, затем нейлоновые нити извлекали, и сосуд заполнял освободившееся пространство. Диаметр нитей подбирался таким образом, чтобы после их изъятия кровоток по сонным артериям восстановился только на 50% от начального уровня (скорость кровотока для каждого животного контролировалась допплерографическим методом) [9]. После ограничения кровотока по артериям рану обрабатывали 0,05% раствором хлоргексидина и ушивали кисетным швом.

Через 40 дней (период, необходимый для развития повреждений головного мозга вследствие ХНМК), животных, у которых воспроизводили экспериментальную патологию, случайным образом распределяли в одну из 8 экспериментальных групп (по 12—15 особей в каждой) и которым внутримышечно вводили Кортексин в дозах 0,3, 1 или 3 мг/кг/сут, Церебролизин в дозах 0,83, 2,5 или 7,5 мл/кг/сут, Актовегин в дозе 5 мл/кг/сут или плацебо (D-маннитол) в эквивалентном объеме. Дозы препаратов были выбраны по данным литературы [10—12]. Животным контрольной (интактной) группы, у которых экспериментальную патологию не моделировали, лекарственных средств не вводили. Исследуемые препараты вводили двумя десятидневными курсами терапии, разделенными перерывом в 10 дней.

По завершении эксперимента в соответствии с Директивой 2010/63/EU Европейского Парламента и Совета Европейского Союза по охране животных, используемых в научных целях от 22 сентября 2010 г., животных умерщвляли и отбирали образцы тканей головного мозга, из которых готовили гомогенаты. Концентрацию малонового диальдегида (МДА) в гомогенатах определяли при помощи реакции с тиобарбитуровой кислотой; концентрацию восстановленного глутатиона — в реакции восстановления 5,5-дитиобис-(2-нитробензойной кислоты); определение активности каталазы, а также содержания лактата и пирувата —коммерчески доступными наборами реагентов. Активность супероксиддисмутазы (СОД) определяли фотометрическим методом, основанным на оценке степени ингибирования реакции окисления эпинефрина [13]. Все реакции проводили в трипликатах.

Все манипуляции с животными выполняли в соответствии с законодательством Российской Федерации и техническими стандартами Евразийского Экономического Союза по надлежащей лабораторной практике после одобрения протокола исследования Региональным независимым этическим комитетом (регистрационный номер: ИРБ 00005839 IORG 0004900 (OHRP), протокол №132 от 20 мая 2019 г.).

Статистическую обработку полученных результатов проводили методами описательной и аналитической статистики. Распределение количественных показателей оценивали, используя тесты Колмогорова—Смирнова и Шапиро—Уилка. При подтверждении гипотезы о нормальном распределении межгрупповые различия оценивали при помощи однофакторного дисперсионного анализа с пост-тестом Ньюмена—Кеулса, а значения представляли в виде среднего арифметического значения и его стандартной ошибки.

Результаты

У животных с ХНМК, которым вводили плацебо, регистрировали статистически значимое снижение содержания лактата и пирувата (p<0,001 при сравнении с соответствующими показателями контрольной группы), которое не сопровождалось существенным уменьшением их соотношения (p>0,05; см. рисунок). Лактат и пируват действуют как субстраты окислительной энергии, вызывая увеличение фазы окисления NAD(P)H, в условиях недостаточности глюкозы и кислорода свидетельствуют об энергодефиците во время интенсивной синаптической активности. Лактат может быть эффективным энергетическим субстратом, способным поддерживать и усиливать аэробный метаболизм мозга. Помимо этого, экспериментальная патология приводила к активизации свободнорадикальных процессов, о чем свидетельствовало снижение запасов восстановленного глутатиона, основного антиоксидантного фактора клеток и увеличение концентрации МДА, основного маркера окислительного стресса в гомогенатах головного мозга крыс на фоне уменьшения уровней активности СОД (супероксид является одним из основных активных форм кислорода в клетке, а СОД выполняет ключевую роль антиоксиданта) и каталазы (p<0,001, в каждом из случаев при сравнении с показателями контрольной группы). Каталаза катализирует разложение перекиси водорода до воды и кислорода, являясь важным ферментом в защите клетки от окислительного повреждения активными формами кислорода (ROS). Одна молекула каталазы может превращать миллионы молекул перекиси водорода в воду и кислород каждую секунду.

Влияние препаратов Кортексин, Церебролизин или Актовегин на энергетический обмен и свободнорадикальные процессы в головном мозге крыс, перенесших ОНМК.

*, **, *** — p<0,05, <0,01 и <0,001 соответственно при сравнении с показателем, зарегистрированным у интактных крыс; ^#, ^##, ^### — p<0,05, <0,01 и <0,001 соответственно при сравнении с показателем, зарегистрированным у крыс из группы плацебо.

МДА является вторичным продуктом ПОЛ, он возникает при деградации полунасыщенных жиров реактивными формами кислорода и служит маркером пероксидирования липидов и оксидативного стресса. Установлено, что ПОЛ и ферменты антиоксидантной защиты (АОЗ) представляют собой единую систему, находящуюся в состоянии динамических изменений: в норме между ними, существует положительная зависимость, т.е. при активации ПОЛ наблюдается активация ферментов АОЗ, что обеспечивает торможение образования и деградацию активных форм кислорода.

Эффекты препаратов Кортексин и Церебролизин были дозозависимы. У животных, которым вводили Кортексин, наблюдали увеличение содержания лактата и пирувата (без существенного изменения их соотношения), повышение содержания глутатиона, восстановление активности СОД и в меньшей степени каталазы, сочетавшееся со снижением концентрации МДА. Перечисленные эффекты были наиболее значимыми у крыс, которым Кортексин вводили в дозе 3 мг/кг/сут: рост активности СОД и снижение концентрации МДА было наиболее выраженными, а средние значения большинства показателей (за исключением содержания лактата) статистически значимо не отличались от показателей интактных (p>0,05 в каждом из случаев), что свидетельствует о способности препарата Кортексин активизировать механизмы АОЗ в условиях гипоксии тканей.

У животных, которым вводили Церебролизин в дозе 7,5 мл/кг/сут, большинство показателей было сопоставимо с таковыми у животных получавших Кортексин в дозе 3 мг/кг/сут (p<0,05).

У животных, получавших Актовегин в дозе 5 мл/кг/сут, содержание МДА (p<0,05) было статистически значимо ниже, а уровень восстановленного глутатиона выше, чем у животных, получавших плацебо, без значимого влияния на содержание лактата и пирувата, а также активность антиоксидантных ферментов.

Результаты, полученные в рамках настоящей работы, согласуются со сведениями литературы о доклинических исследованиях активности препарата Кортексин, в которых отмечалось, что препарат Кортексин проявлял антигипоксическое действие и существенно повышал выживаемость грызунов при циркуляторной или гипоксической гипоксии головного мозга. Оказывая нейротрофическое действие, Кортексин был способен повышать выживаемость культур нейронов в условиях перекисной или глутаматной интоксикации [6] и корректировал состояние нарушенной системы свободно-радикального окисления у крыс с ускоренным старением [14]. Нейропротективная терапия препаратом Кортексин в суточной дозе 0,3 мг/кг на протяжении 21 сут у крыс с экспериментальной ХНМК способствовала уменьшению интенсивности окислительного и нитрозирующего стрессов в мозговой ткани [15]. Антиоксидантное действие препарата Кортексин было отмечено в клинических исследованиях [16]. Вероятно, в том числе с подобными эффектами связано снижение смертности пациентов, которым на фоне ишемического инсульта вводили Кортексин или Церебролизин [2].

Возможно, перечисленные эффекты обусловлены с влиянием пептидов, входящих в состав препаратов, на активность основных протеаз, принимающих участие в гибели клеток головного мозга. В частности, А. А. Яковлев и соавт. установили, что Кортексин дозозависимо подавлял активность каспазы 8 с медианной эффективной концентрацией (IC50), равной 0,75±0,12 мкг/мл, и был способен предотвращать индуцированную глутаматом гибель зернистых нейронов мозжечка in vitro [17]. Таким образом, в проведенном исследовании отмечено, что лекарственные препараты Кортексин и Церебролизин вызывали сопоставимые дозозависимые эффекты в отношении антиоксидантного статуса головного мозга крыс, перенесших ОНМК, что свидетельствует об их способности активизировать механизмы АОЗ в условиях гипоксии тканей. В то же время Церебролизин в дозе 7,5 мл/кг/сут несколько уступал препарату Кортексин по влиянию на содержание МДА. Препарат Актовегин в дозе 5 мл/кг/сут превзошел плацебо лишь в отношении содержания МДА и восстановленного глутатиона, без значимого влияния на содержание лактата и пирувата, а также активность антиоксидантных ферментов.

Таким образом, нейропротективное действие препаратов Кортексин и Церебролизин, содержащих пептиды, выделенные из головного мозга животных, может реализовываться за счет антиоксидантных эффектов, которых Актовегин в данной экспериментальной модели практически не проявлял.

Заключение

Курсовое введение препаратов Кортексин (3 мг/кг/сут), Церебролизин (7,5 мл/кг/сут) и в меньшей степени Актовегина (5 мл/кг/сут) оказывало положительное влияние на состояние антиоксидантной системы головного мозга в условиях ХНМК.

Исследование выполнено при финансовой поддержке ЗАО «Фарм-Холдинг». Авторы статьи подтверждают отсутствие конфликта интересов и свою независимость при подготовке содержания статьи и формировании выводов.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.