Широкая распространенность неврологической патологии обусловливает востребованность имеющихся больших возможностей ботулинотерапии в различных областях клинической медицины. Спастичность представляет собой один из видов мышечной гиперактивности, которая возникает у больных после очагового поражения ЦНС и считается наиболее инвалидизирующим проявлением синдрома верхнего мотонейрона [1]. Спастичность мышц нижней конечности развивается у ¹/₃ пациентов, перенесших инсульт, у ¹/₂—¹/₃ — с рассеянным склерозом, у ³/₄ — с церебральным параличом, у ¹/₈ — с черепно-мозговой травмой [2]. Одним из научно обоснованных и общепризнанных методов лечения очаговой спастичности нижних конечностей является внутримышечное таргетное введение ботулинического токсина типа A [3]. В настоящее время в России для инъекций в мышцы всей нижней конечности, включая мышцы бедра у взрослых, могут использоваться препараты Диспорт и Лантокс.

Настоящее исследование проведено в рамках научно-исследовательской программы, проводимой в АО «НПО «Микроген», с целью оценки общетоксических свойств препарата Релатокс Токсин ботулинический типа A в комплексе с гемагглютинином, лиофилизат для приготовления раствора для инъекций 100 ЕД (далее по тексту также «Релатокс», «испытуемый препарат») с использованием дозы 600 ЕД, рассматриваемой в качестве оптимальной для лечения спастичности нижних конечностей. Данное лекарственное средство имеет широкий профиль применения, в который планируется включить и лечение спастичности мышц нижней конечности, что и обусловило необходимость проведения данного исследования.

Аналогом испытуемого препарата, который зарегистрирован в Российской Федерации, является Диспорт, лиофилизат для приготовления раствора для инъекций 300 ЕД («Ипсен Биофарм Лимитед», Великобритания) (далее по тексту также «Диспорт», «препарат сравнения», «референтный препарат») (регистрационный номер: ЛП-001486). Данный препарат использован в исследовании в качестве препарата сравнения.

Цель исследования — оценить токсическое действие лекарственного препарата Релатокс на половозрелых аутбредных крысах и мышах в остром опыте в сравнении с зарегистрированным аналогом Диспорт. Задачами исследования явились: определить параметры токсического действия препарата Релатокс при однократном внутримышечном или внутрибрюшинном введении самцам и самкам половозрелых аутбредных крыс и мышей в сравнении с препаратом Диспорт; изучить токсическое действие однократного введения препарата Релатокс на системы организма, внутренние органы и ткани крыс и мышей в сравнении с препаратом Диспорт.

Материал и методы

Исследования выполняли согласно следующим документам: Решение Совета Евразийской экономической комиссии от 3 ноября 2016 г. №81 «Об утверждении Правил надлежащей лабораторной практики Евразийского экономического союза в сфере обращения лекарственных средств» [4], методические указания «Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ», 2005 [5], «Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Часть первая», 2012 [6]. Эксперименты на животных проводили в соответствии с правилами, принятыми Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и иных научных целей [7]. Животные получены из питомника «Филиал «Андреевка» ФГБУН «Научный центр биомедицинских технологий Федерального медико-биологического агентства».

Крыс и мышей содержали в виварии согласно санитарным правилам и на стандартном рационе в соответствии с документом ГОСТ 33215-2014. Межгосударственный стандарт «Руководство по содержанию и уходу за лабораторными животными. Правила оборудования помещений и организации процедур», введенные в действие Приказом Росстандарта от 09.11.2015 №1732-ст. [8]. Животных содержали в контролируемых условиях: температура воздуха 20—22 °C; относительная влажность 60—70%. Температуру и влажность воздуха контролировали в каждом помещении ежедневно, показания документировали. Освещение естественно-искусственное (12 ч свет/12 ч темнота). Крыс и мышей содержали в поликарбонатных клетках соответственно по 6 и 10 голов в каждой. В качестве подстила использовали древесные опилки. Крыс и мышей содержали на разных стеллажах. Корм представлял собой сухой брикетированный корм ПК-120 ГОСТ Р 51849-2011 Р.5 (ООО «Лабораторкорм», Москва). Для питья предоставлялась водопроводная вода (ГОСТ Р 51232-98 «Вода питьевая»), которую крысам и мышам давали ad libitum из стандартных поилок.

Препараты Релатокс и Диспорт вводили крысам и мышам двумя путями (внутрибрюшинным и внутримышечным) первоначально в дозах 10; 50; 100 и 150 ЕД/кг; для расчета токсикологических параметров использовали дополнительные дозы. Дозы обоих препаратов были эквивалентны по содержанию активного вещества за счет различного разведения препаратов и объема введения. Несмотря на различную активность (Релатокс 100 ЕД и Диспорт 300 ЕД), во всех случаях препараты вводили животным в одинаковых дозировках по активному веществу. Во всех случаях объем введения не превышал допустимый для внутрибрюшинного и внутримышечного введения крысам и мышам. В качестве контрольного вещества использовали натрия хлорид раствор для инфузий (ОАО НПК «ЭСКОМ»; серия 9321221; годен до 12.23).

Значение LD₅₀ и других параметров острого токсического действия рассчитывали с использованием пробит-анализа [9].

Результаты и обсуждение

Основным составляющим компонентом исследования было тщательное наблюдение за возможной гибелью и проявлением симптомов интоксикации у опытных животных. Длительность наблюдений составляла 14 сут. В результате проведения острого опыта получены экспериментальные данные, которые позволяют составить четкое представление о токсических эффектах испытуемого препарата на стадии проведения доклинических исследований.

Оба препарата были более токсичными при внутрибрюшинном введении по сравнению с внутримышечным путем, что хорошо понятно, поскольку первый приравнивается к внутривенному пути и обеспечивает высокую биодоступность активных веществ. Исключение представляют значения LD₅₀ для препарата Релатокс у самцов мышей, когда токсикологические параметры не различались между двумя путями введения, и у самок мышей, когда значения различались незначительно, что, вероятно, связано с особенностями токсикодинамики активного вещества на данном виде животных. Гибель самцов и самок крыс и мышей при внутримышечном пути введения носила более отсроченный характер по сравнению с внутрибрюшинным введением. Так, при внутрибрюшинном введении основной падеж животных от токсических доз имел место на 1—2-е сутки, в то время как при внутримышечном введении продолжался до 5-х суток.

При внутрибрюшинном введении из всех тестированных дозировок можно выделить дозу 10 ЕД/кг, которая не была летальной. При внутримышечном введении падеж крыс и мышей отсутствовал в двух дозах — 10 и 50 ЕД/кг. Однако частота гибели животных после введения в дозах 100 и 150 ЕД/кг различалась и была выше для препарата Релатокс. Оба препарата индуцировали развитие аналогичных симптомов интоксикации, среди которых можно отметить локальные парезы и параличи, а также дыхательную недостаточность, скорее всего, вследствие пареза дыхательной мускулатуры. Данные токсические эффекты — проявление механизма действия ботулинического токсина, являющегося активным веществом этих лекарственных средств. На уровне организма трудно и скорее всего невозможно четко разделить токсические и фармакологические эффекты данных лекарственных средств.

В отношении вышеописанных показателей оба препарата — Релатокс и Диспорт — были полностью эквивалентны между собой.

Первоначально препараты Релатокс и Диспорт вводили в четырех дозах: 10; 50; 100 и 150 ЕД/кг. Для расчета LD₅₀ и других токсикологических параметров, которые являются статистическими величинами, необходимы промежуточные летальные дозы и абсолютно смертельная доза, которые отсутствовали в том или ином варианте опыта. Для общего представления о токсических свойствах препаратов в количественном аспекте провели расчет токсикологических параметров, для чего в свою очередь использовали дополнительные дозы.

Приводим дополнительные дозы препарата Релатокс и Диспорт, которые использовали для расчета токсикологических параметров — Релатокс (крысы): внутрибрюшинное введение — 20; 30 и 40 ЕД/кг; внутримышечное введение — 60; 70 и 80 ЕД/кг. Релатокс (мыши): внутрибрюшинное введение — 20 и 80 ЕД/кг (самцы) и 20 и 30 ЕД/кг (самки); внутримышечное введение — 20 и 80 ЕД/кг. Дополнительные дозы препарата Диспорт, использованные для расчета токсикологических параметров, составили для крыс: внутрибрюшинное введение — 70 и 60 ЕД/кг (самцы); 70 и 80 ЕД/кг (самки); внутримышечное введение — 200 и 250 ЕД/кг (самцы) и 200 и 250 ЕД/кг (самки); для мышей: внутрибрюшинное введение — 60 и 80 ЕД/кг (самцы) и 60 и 80 ЕД/кг (самки); внутримышечное введение — 200 и 250 (самцы) и 200; 250 и 300 ЕД/кг (самки).

В табл. 1 и 2 приведены расчетные значения LD₅₀ и других токсикологических параметров для препаратов Релатокс и Диспорт.

Таблица 1. Значения токсикологических параметров препарата Релатокс при внутрибрюшинном и внутримышечном путях введения крысам и мышам (ЕД/кг)

Таблица 2. Значения токсикологических параметров препарата Диспорт при внутрибрюшинном и внутримышечном путях введения крысам и мышам (ЕД/кг)

Судя по установленным значениям токсикологических параметров, имеются различия в значениях LD₅₀, препарат Диспорт является менее токсичным, по сравнению с препаратом Релатокс. Это может быть связано с различной специфической активностью данных препаратов. В частности, показано, что препарат Диспорт в силу отличия штамма C. clostridium типа A, используемого при его производстве, является примерно в 2,5—3 раза менее активным по сравнению с препаратом Релатокс [10, 11]. Несомненно, что токсичность непосредственно связана с активностью. Следовательно, если сделать поправку для значений LD₅₀ препарата Диспорт, то получим практически одинаковые значения с препаратом Релатокс. В качестве примера приведем значения LD₅₀ препарата Релатокс и препарата Диспорт для крыс-самцов при внутрибрюшинном введении, составляющие соответственно 30 и 84 ЕД/кг, разница в этом случае равняется примерно 2,8 раза. Таким образом, если разделить величину LD₅₀ препарата Диспорт на 2,8, то получим значение, не отличающееся от среднесмертельной дозы препарата Релатокс. Аналогичным образом можно скорректировать и другие значения LD₅₀.

Заключение

Изучена острая токсичность препарата Релатокс, лиофилизат для приготовления раствора для инъекций 100 ЕД (АО «НПО «Микроген», Россия) в сравнении с его зарегистрированным аналогом Диспорт, лиофилизат для приготовления раствора для инъекций 300 ЕД («Ипсен Биофарм Лимитед», Великобритания) на крысах и мышах (самцах и самках) при внутрибрюшинном и внутримышечном пути введения. В большинстве случаев оба препарата являются более токсичными при внутрибрюшинном введении по сравнению с внутримышечным путем. При двух путях введения у крыс и мышей отсутствует видовая и половая чувствительность к обоим препаратам. При внутрибрюшинном и внутримышечном введении препаратов Релатокс и Диспорт развивается идентичная картина интоксикации с преобладанием неврологических симптомов, локальных парезов и параличей. Значения LD₅₀ препаратов Релатокс и Диспорт, установленные по результатам острого опыта, следует рассматривать с учетом различий (в 2,5—3 раза) в специфической активности данных лекарственных средств.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.