Список сокращений
МРС — магнитно-резонансная спектроскопия
МРТ — магнитно-резонансная томография
PCr — фосфокреатин
Pi — неорганический фосфат
pH — водородный показатель
δPi — химический сдвиг пика неорганического фосфата
В неинвазивной диагностике заболеваний головного мозга наряду со стандартной магнитно-резонансной томографией (МРТ) широко применяются методики мультиядерной магнитно-резонансной спектроскопии (МРС) [1—4], одна из которых — фосфорная МРС — используется для оценки энергетического метаболизма клеток головного мозга. В дополнение к уже известным возможностям этого метода в изучении энергетического профиля клеток фосфорная МРС позволяет измерить внутриклеточный уровень водородного показателя (pH) мозгового вещества in vivo в отличие от большинства методов, основанных на определении pH тканей in vitro [5—7].
Возможность оценки внутриклеточного pH с помощью резонансных частот пиков фосфорных спектров продемонстрирована в 1973 г. в работе R. Moon и J. Richards из Калифорнийского Технологического института [8]. В этой работе авторы представили результаты исследования влияния внутриклеточного pH на резонансные частоты фосфолипидов в фосфорном спектре. Резонансные частоты клеточных фосфолипидов — продуктов энергетического обмена — возрастали с увеличением уровня внутриклеточного pH среды, тогда как резонанс фосфокреатина оставался постоянным.
В 1985 г. O. Petroff и соавт. продолжили исследование зависимости резонансов пиков фосфорного магнитно-резонансного спектра тканей печени и мозга и получили уравнение для вычисления внутриклеточного pH по величине химического сдвига пика неорганического фосфата (Pi) (основной вклад в который вносит магнитно-резонансный сигнал от цитоплазмы) относительно химического сдвига пика фосфокреатина (PCr), которое применяют сейчас в фосфорной МРС для оценки внутриклеточного pH [9].
Внутриклеточный pH является важным физиологическим параметром, который изменяется при различных патологических состояниях мозгового вещества, в том числе при опухолях. Ранее в экспериментальных исследованиях доказано, что внутриклеточный уровень pH опухолей имеет более щелочные значения по сравнению с нормальным мозговым веществом [9—11]. В дальнейшем появились работы по измерению уровня pH с помощью фосфорной МРС в клинических условиях при различной патологии головного мозга — демиелинизирующих процессах, ишемических изменениях, травме, а также при опухолевом поражении [6, 7, 12—14]. Однако полученные результаты при исследовании pH опухолей значительно варьировали.
Цель исследования — изучить возможности измерения внутриклеточного pH с помощью фосфорной МРС в глиобластомах, а также сравнить полученные данные со значениями внутриклеточного pH здоровых добровольцев.
Материал и методы
В исследование включены 10 пациентов в возрасте от 41 года до 67 лет (средний возраст 55,8 года) с первоначальным диагнозом глиобластомы, который в дальнейшем подтвержден гистологически. Перед проведением фосфорной МРС всем пациентам выполнено анатомическое МРТ сканирование по стандартному протоколу. При МРС размеры исследуемого вокселя составили 6×6×2 см. Помимо солидного компонента опухоли в область интереса попали участки некроза, геморрагический компонент, зона отека—инфильтрации, а также неизмененное мозговое вещество. В качестве контрольной группы взяты результаты исследования 23 условно здоровых добровольцев, полученные ранее (И.Н. Пронин и соавт., 2019) [15]. В той же статье подробно описана методика выполнения фосфорной МРС, которую использовали при проведении этого исследования. Обработку спектров проводили с помощью программы SAGE. Расчет внутриклеточного pH опухолевой ткани проводили по формуле, предложенной O. Petroff и соавт., которую использовали в большинстве работ по измерению внутриклеточного pH [7, 9, 12, 14, 15]:
pH=6,77+log [(δPi—3,29)/(5,68—δPi)],
где δPi — химический сдвиг пика Pi относительно пика PCr, который расположен на шкале на уровне 0 ppm. На рис. 1 представлено схематическое изображение определения химического сдвига Pi относительно пика PCr.
Рис. 1. Схематическое изображение фосфорного спектра.
Красная стрелка указывает расстояние между пиком фосфокреатина (PCr) и пиком неорганического фосфата (Pi), являющееся химическим сдвигом неорганического фосфата (δPi) относительно пика PCr. Подставляя полученное значение δPi в специальную формулу, можно получить значение внутриклеточного рН исследуемой ткани.
Статистическая обработка проведена в программе R-project (https://www.r-project.org), для ROC-анализа использовали библиотеку pROC (порог значимости выше 0,7—0,8 рассматривали в качестве порога статистической значимости). Статистическая значимость рассматривалась при пороге значимости p<0,05.
Результаты
При структурной МРТ все глиобластомы имели разнообразную магнитно-резонансную МР картину и различались по ряду признаков, включая наличие кровоизлияния в опухоль, соотношение некротического и тканевого компонентов, выраженность перифокального отека, а также характер контрастного усиления (табл. 1). Все глиобластомы по молекулярно-генетическому статусу имели IDH1 дикий тип. Содержание MGMT в опухоли не оценивали.
Таблица 1. Магнитно-резонансная характеристика глиобластом
| № | Пол | Возраст | Соотношение некротического/солидного компонентов | Кровоизлияние в опухоль | Выраженность перифокального отека | Характер контрастного усиления | рН |
| 1 | м | 53 | Преобладает некроз | Есть | Выраженный | Кольцевидное | 7,58 |
| 2 | м | 63 | Преобладает некроз | Есть | Нет | Кольцевидное | 7,20 |
| 3 | м | 41 | Преобладает солидный компонент | Нет | Не выражен | Кольцевидное | 7,07 |
| 4 | м | 67 | Преобладает солидный компонент | Нет | Нет | Диффузное | 7,04 |
| 5 | м | 46 | Преобладает некроз | Нет | Минимальный | Кольцевидное | 6,96 |
| 6 | ж | 51 | Преобладает некроз | Есть | Нет | Кольцевидное | 6,98 |
| 7 | м | 63 | Преобладает некроз | Нет | Выраженный | Кольцевидное | 6,98 |
| 8 | ж | 58 | Преобладает некроз | Есть | Минимальный | Кольцевидное | 6,98 |
| 9 | ж | 57 | Равное соотношение некроза с солидным компонентом | Есть | Выраженный | Кольцевидное | 6,89 |
| 10 | м | 59 | Преобладает некроз | Нет | Выраженный | Кольцевидное | 6,78 |
Во всех исследованиях получен фосфорный спектр, в котором четко определялись пики PCr и Pi, необходимые для вычисления уровня pH, а также остальные пики основных фосфоросодержащих метаболитов, результаты обработки которых не вошли в данное исследование. Вычисление внутриклеточного уровня pH проведено на основе представленной выше формулы. В табл. 2 приведены средние значения внутриклеточного pH глиобластомы и здорового мозгового вещества. Фосфорный спектр глиобластомы показан на рис. 2.
Таблица 2. Среднее значение внутриклеточного pH ткани глиобластом и здоровой мозговой ткани по данным магнитно-резонансной спектроскопии
| Группы | Среднее значение рН |
| Контрольная группа | 6,943±0,044 |
| Группа с глиобластомами | 7,047±0,21 |
Рис. 2. Фосфорный спектр глиобластомы.
Самый высокий пик спектра, соответствующий значению 0 ppm на шкале химического сдвига, относится к фосфокреатину. Три пика спектра, распложенные в отрицательной зоне шкалы, соответствуют АТФ. В положительной зоне спектра расположены пики неорганического фосфата (ближний к фосфокреатину), далее — пики фосфодиэфиров и фосфомоноэфиров.
В нашем исследовании у пациентов в глиобластомах среднее значение pH составило 7,047±0,21, а в мозговом веществе здоровых добровольцев — 6,943±0,044. У исследуемых с глиобластомами стандартное отклонение было в несколько раз выше по сравнению со стандартным отклонением pH у добровольцев контрольной группы. Полученные значения pH глиобластом находились в диапазоне от 6,787 до 7,58. В 4 случаях в глиобластомах выявлен более высокий уровень pH по сравнению со здоровой тканью мозга. В 2 случаях значения pH были ниже, чем в здоровом веществе мозга. На рис. 3 представлена глиобластома с максимальным значением уровня pH — 7,58. В проведенном нами ROC-анализе и при обработке данных с применением теста Манна—Уитни статистически значимого различия уровня pH глиобластом с уровнем pH здорового мозгового вещества не было.
Рис. 3. Глиобластома правой теменной доли.
Магнитно-резонансная томография в режиме Т2 (а) и Т1 после контрастного усиления (б) демонстрирует гетерогенное строение внутримозговой опухоли с кольцевидным типом контрастного усиления.
Обсуждение
В нашем исследовании мы получили более щелочные значения pH глиобластом по сравнению с pH здорового мозгового вещества, однако из-за большого разброса значений pH глиобластом статистически значимого различия между показателями этих двух групп не получено. Такое разнообразие значений pH среди опухолей, вероятно, обусловлено выраженной структурной неоднородностью глиобластомы, в которой присутствует большое количество некротических и геморрагических компонентов в сочетании с особенностью методики, заключающейся в исследовании большого объема ткани. Помимо солидного компонента опухоли в исследуемый воксель неизбежно попадают участки некроза, кровоизлияний, нормальная паренхима мозга, область отека и др., что в результате приводит к искажению истинного значения внутриклеточного pH опухолевых клеток.
В других работах по оценке pH глиобластом также определялась тенденция к изменению уровня pH в сторону щелочных значений. Например, в исследовании D. Maintz и соавт. получен уровень pH 7,12±0,02 (контрольные значения pH 7,04±0,01) [12]. В другом исследовании K. Wenger и соавт. измеряли pH in vivo пациентам с первичной глиобластомой до и после проведения антиангиогенной терапии. В их исследовании среднее значение уровня pH глиобластом до лечения составило 7,11±0,053, и статистически значимо отличалось от значений контрольной группы (7,017±0,026) [14]. Следует отметить, что исследование K. Wenger и соавт. выполнено с применением мультивоксельной технологии.
Изменение уровня pH в сторону щелочных значений имеет биохимическое объяснение. Считается, что злокачественные опухоли, такие как глиобластомы, характеризуются высоким по сравнению с нормальным мозговым веществом уровнем анаэробного гликолиза [16], так как в процессе своей жизнедеятельности преобразуют глюкозу в пировиноградную кислоту, а затем в лактат, как при отсутствии кислорода (анаэробный гликолиз с последующим молочнокислым брожением), так и при его наличии в клетке (так называемый Warburg-эффект) [17]. В ходе этого процесса кроме извлечения энергии опухолевые клетки также снижают pH внеклеточной среды за счет активного транспорта протонов (Н+) и лактата во внеклеточное пространство [18]. При проведении некоторыми исследователями измерений внеклеточного pH in vivo продемонстрировано, что микроокружение солидных опухолей является более кислым, чем микроокружение нормально дифференцированных клеток [10, 19, 20]. Кислая внешняя среда, не являясь вредной для самих опухолевых клеток, способствует повышению пролиферативной активности, более высокой инвазии опухолевых клеток, а также усиливает опухолевый неоангиогенез [21—23]. При этом транзиторное повышение внутриклеточного pH активирует некоторые механизмы, усиливающие клеточную пролиферацию, а также ингибирующие клеточный апоптоз, что способствует более высокой выживаемости патологических клеток в агрессивной для них среде [23—25]. Таким образом, характерными особенностями опухолевого роста являются повышение скорости гликолиза, а также изменения в работе ионных насосов и транспортных белков плазматической мембраны, которые осуществляют экспорт протонов и лактата во внеклеточное пространство. Это позволяет опухолевым клеткам поддерживать более высокий внутриклеточный уровень pH, усиливающий их пролиферативную активность и способность к инвазии [24, 25].
Такие особенности соотношения pH внутри- и внеклеточной среды стали основой для изучения эффективности некоторых химиотерапевтических препаратов [26]. В исследованиях N. Raghunand и соавт. на опухолях мышей in vivo показано, что индуцированное повышение внеклеточного pH в опухоли приводило к усилению цитотоксической активности химиотерапевтических препаратов [27, 28]. В нашем исследовании уровень pH одной из глиобластом имел очень высокое значение — 7,58. Такая информация может в дальнейшем лечь в основу клинических исследований с целью изучения эффективности применяемых химиотерапевтических препаратов в опухолях с различными кислотно-щелочными характеристиками.
Наряду с фосфорной МРС существуют и другие способы измерения внутриклеточного pH in vivo [29]. Среди этих методов следует отметить недавно появившийся метод амидно-протонного трансфера (APT-CEST), который использует pH-зависимую скорость обмена амидных или аминных протонов с водой для контраста и обладает достаточно хорошим пространственным разрешением [30, 31]. Недостатками такого метода являются двухмерность полученных данных, а также выраженные технические артефакты, искажающие точность исследований.
Заключение
Фосфорная магнитно-резонансная спектроскопия является развивающимся методом измерения внутриклеточного pH мозгового вещества in vivo, исследование которого в глиобластомах показало тенденцию к защелачиванию внутриклеточной составляющей опухолей. Такой метод имеет как преимущества, так и недостатки, в основном связанные с большим объемом исследуемого вокселя. Техническое усовершенствование методики в виде применения мультивоксельной технологии, высокопольного томографа и многоканальной фосфорной катушки повысит точность измерения внутриклеточного pH, увеличив пространственное разрешение. Изменение внутриклеточного pH мозгового вещества в дальнейшем может быть использовано в качестве потенциального маркера ранних патологических изменений, не визуализируемых при стандартном магнитно-резонансном томографическом исследовании, а также в оценке эффективности противоопухолевой терапии. Механизмы, приводящие к вариациям значений pH в различных по структуре опухолях, остаются неясными и должны быть изучены в дальнейшем.
Участие авторов:
Концепция и дизайн исследования — Пронин И.Н., Мерцалова М.П.
Сбор и обработка материала — Мерцалова М.П., Шульц Е.И., Баталов А.И., Тюрина А.Н., Родионов П.В.
Статистический анализ данных — Фадеева Л.М., Погосбекян Э.Л.
Написание текста — Мерцалова М.П.
Редактирование — Пронин И.Н., Захарова Н.Е., Подопригора А.Е., Голанов А.В., Постнов А.А.
Работа выполнена при поддержке гранта РНФ №18-15-00337.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Комментарий
Работа посвящена применению метода фосфорной магнитно-резонансной спектроскопии (31Р-МРС) для изучения внутриклеточного pH глиобластомы и сравнению полученных данных со значениями pH мозгового вещества здоровых добровольцев. Метод фосфорной спектроскопии позволяет визуализировать основные фосфорсодержащие метаболиты, присутствующие в клетке, с помощью которых можно изучить энергетических профиль патологической ткани, а также измерить уровень ее внутриклеточного pH. Другими словами, 31Р-МРС позволяет неинвазивно получать важную информацию об изменениях в фундаментальных клеточных процессах при различной патологии головного мозга, в том числе при злокачественных опухолях головного мозга, наиболее агрессивной из которых является глиобластома. С помощью фосфорного спектра можно вычислить значения внутриклеточного pH опухоли, вариация значений которого отражает степень метаболических нарушений клеток, что может служить маркером ответа опухоли на проводимое химио/лучевое лечение.
При сопоставлении уровня внутриклеточного pH в глиобластомах со значениями pH тканей мозга здоровых добровольцев выявлена тенденция к увеличению уровня внутриклеточного pH в опухолях по сравнению с уровнем pH здоровых тканей.
Результаты исследования для определения воспроизводимости сопоставлялись с данными других авторов. Полученные значения pH не противоречат измерениям, выполненным другими авторами.
На основании проведенных исследований авторы показали, что данная методика в дальнейшем может быть использована в качестве потенциального маркера ранних патологических изменений, не визуализируемых при стандартном магнитно-резонансном томографическом исследовании, а также в оценке эффективности противоопухолевой терапии.
А.Х. Бекяшев (Москва)