Введение

Проблема лечения диффузных глиальных опухолей, в частности самых злокачественных их вариантов — глиобластом (ГБ), находится в первом ряду актуальных задач нейроонкологии. Обусловлено это рядом причин. Во-первых, глиобластомы — это самые частые первичные злокачественные новообразования ЦНС. Во-вторых, несмотря на все достижения нейрохирургии, лучевого и лекарственного противоопухолевого лечения, выживаемость пациентов со злокачественными глиомами остается неудовлетворительной. Медиана безрецидивной и общей выживаемости при ГБ составляет только 6,2—7,5 мес и 14,6—20,5 мес соответственно [1, 2]. Эти показатели существенно не меняются на протяжении последнего времени.

Инфильтративный характер роста ГБ препятствует их тотальному удалению, поэтому лучевое лечение имеет большое значение и входит в стандарт первичного лечения, а также применяется при рецидивах [1, 2]. Принципиальная составляющая злокачественного потенциала глиальных опухолей — их радиорезистентность, т.е. устойчивость к лучевому лечению. Основная часть (79—93%) рецидивов злокачественных глиом происходит в пределах объема проведенного лучевого лечения [3, 4]. Исследования не подтвердили увеличения выживаемости пациентов при эскалации дозы в процессе лучевого лечения [5, 6].

Эти факты свидетельствуют о низкой радиочувствительности глиом и обосновывают исследование данного аспекта как потенциальной мишени для терапевтического воздействия. Анализ литературы демонстрирует актуальность этой проблемы и активное ее изучение при помощи клеточных опухолевых линий.

Один из ключевых вопросов, который необходимо рассмотреть при обсуждении использования линий опухолевых клеток, — насколько точно клеточная линия отражает или имитирует опухолевый процесс in vivo. Во многих работах продемонстрирована схожая экспрессия различных значимых биомаркеров. В работе Y. Zhang и соавт. показано, что изменения в пути TP53—ARF—MDM2 определяются в 84% ГБ и в 94% соответствующих клеточных линий [7]. C. Pesenti и соавт. определили схожие геномные аберрации в глиобластомах и клеточных культурах [8]. В других исследованиях отмечены некоторые различия. V.G. LeBlanc и соавт. сопоставляли экзом и транскриптом в 12 глиобластомах, а также в эксплантах и глиомосферах, полученных из этих опухолей [9]. Авторы заключили, что экспланты в большей степени, чем глиомосферы, отражают генетическую гетерогенность, присущую первичной опухоли. J. Lee и соавт. отметили, что культуральная среда может способствовать росту опухолевых стволовых клеток, которые в большей степени отражают основные свойства первичной опухоли [10].

В механизмах, обеспечивающих радиорезистентность ГБ, в том числе при ее прогрессировании, имеют значение несколько ключевых факторов. Среди них можно выделить гипоксию, микроокружение и метаболические особенности опухоли, особенности стволовых клеток глиом, внутриопухолевую гетерогенность, микроРНК, особенности клеточного цикла, а также некоторые аспекты повреждения и репарации ДНК.

Гипоксия

Гипоксия как фактор, влияющий на реакцию клеток млекопитающих на ионизирующее излучение, описана в середине прошлого века [11]. Большая часть повреждений ДНК, вызываемых лучевым воздействием в условиях нормоксии, опосредуется активными формами кислорода. Способность лучевой терапии вызывать окислительный стресс, обусловленный свободными радикалами, снижается в условиях гипоксии, поэтому неудивительно, что гипоксия приводит к развитию радиорезистентности. F. Marampon и соавт. исследовали чувствительность клеточных культур глиобластомы T98G, U87MG, U138MG и U251MG к облучению в условиях гипоксии при воздействии ингибиторов MEK/ERK и HIF-1α. Авторы сделали вывод, что путь MEK/ERK приводит к устойчивой экспрессии каталитической субъединицы ДНК-зависимой протеинкиназы (DNA-PKcs), далее к экспрессии и активации фактора, индуцируемого гипоксией 1α (HIF-1α), который поддерживает радиорезистентность ГБ в условиях гипоксии [12].

В других исследованиях показано, что после включения гипоксией фактора HIF-2α (который в отличие от HIF-1α является специфичным для опухолевых клеток) активируются пути OCT4, NANOG и c-MYC, имеющие большое значение для стволовых клеток. Это, в свою очередь, регулирует самообновление и дифференцировку стволовых клеток, приводит к смене фенотипа в пользу плюрипотентных клеток. Таким образом, гипоксия может вызывать радиорезистентность за счет увеличения «стволовости» популяций клеток глиомы [13]. С учетом специфичной экспрессии HIF-2α в опухолевых стволовых клетках предполагается терапевтическая значимость этой мишени [14].

Микроокружение

Микроокружение играет важную роль в онкогенезе и прогрессировании ГБ, а также в развитии радиорезистентности. Клеточный состав опухолевого микроокружения ГБ включает неопухолевые стромальные клетки, нормальные и реактивные астроциты, фибробласты, внеклеточные и сосудистые перициты, стволовые и иммунные клетки, а также структуры межклеточного матрикса [15]. Все эти клетки и биомолекулы в микроокружении опухоли вносят свой вклад в ответ на облучение [16]. Основную роль в этом процессе играет взаимодействие опухолевых стволовых клеток и микроокружения. Глиальные стволовые клетки находятся в особых «нишах» микроокружения, которые обеспечивают их различными молекулами и факторами, обусловливающими развитие устойчивости [17]. Показано, что клетки эндотелия и стволовые глиальные клетки взаимно стимулируют рост и выживаемость друг друга, в том числе в условиях лучевого повреждения [18, 19].

В нескольких исследованиях выявлено, что клетки глиом, облученные in vivo на моделях ксенотрансплантатов, радиорезистентны, притом что те же клетки, выращенные in vitro, имели большую чувствительность к облучению [20]. Это демонстрирует роль микроокружения опухоли in vivo в развитии радиорезистентности.

Стволовые клетки

Предполагается, что устойчивость глиом к лечению и способность к рецидивированию определяются небольшой субпопуляцией клеток. Инициирующие клетки глиомы устойчивы к лучевому воздействию и напрямую определяют результаты лечения пациентов [21]. Доля этих клеток в первичной опухоли коррелирует с выживаемостью пациентов [22]. Инициирующие клетки глиом отличаются экспрессией группы маркеров, таких как SOX2, OCT4, NANOG, OLIG2, NESTIN, ID1, CD133, CD15, CD44 и A2B5 [23—27]. Доля клеток глиомы, экспрессирующих CD133 (маркер как нервных, так и инициирующих клеток глиом), увеличивается после облучения [28]. В исследованиях C.-J. Chang и соавт. in vitro показана большая выживаемость CD133-положительных клеток после облучения культур [29]. В CD133-положительных инициирующих клетках глиом после облучения преимущественно активируются белки контрольных точек повреждения ДНК, такие как Chk1 и Chk2, которые выполняют репарацию радиационно-индуцированных повреждений ДНК более эффективно, чем это происходит в CD133-отрицательных клетках. Таким образом, повышенная способность к репарации повреждений ДНК, вероятно, частично определяет радиорезистентность CD133-положительных инициирующих клеток глиом [30]. Показано, что стволовые клетки и инициирующие клетки ГБ вносят вклад в радиорезистентность ГБ за счет повышенной активации путей контрольных точек повреждения ДНК и внутренней гиперактивации путей PI3K/AKT и PTEN [31, 32]. Различия в молекулярных и генетических характеристиках разных клеток в пределах одной опухоли вызывают разные ответы на лучевую терапию среди этих популяций. После облучения выжившие радиорезистентные популяции в конечном итоге становятся доминирующими, что приводит к общему увеличению устойчивости опухоли [33].

Внутриопухолевая гетерогенность

Внутриопухолевая гетерогенность является следствием нарушения механизмов поддержания стабильности генома в опухолевых клетках и определяет вариативность ответа на неблагоприятные факторы, в том числе на лучевую терапию. После облучения радиорезистентные популяции в конечном итоге становятся доминирующими, что приводит к общему увеличению устойчивости опухоли [29, 33]. Сообщалось, что клетки с мутацией IDH1 более радиочувствительны за счет эпигенетического подавления активности TIGAR (активированный TP53 регулятор гликолиза и апоптоза). Подавление гена IDH1 и последующее снижения уровня NADPH может улучшить ответ клеток ГБ на облучение [34].

Метаболизм

Изменения метаболизма и митохондриальной биоэнергетики, определяемые в клетках ГБ, способствуют пролиферации и инвазии, а также обеспечивают устойчивость к стандартным методам лечения ГБ. В частности, высокая скорость гликолиза коррелирует с радиорезистентностью ГБ, а выключение гликолитического пути снижает эту устойчивость как in vitro, так и in vivo [35, 36].

Восстановитель NADPH является основным источником электронов для большинства клеточных антиоксидантных систем, опосредованных глутатионом и тиоредоксином, которые играют критическую роль в окислительно-восстановительном метаболизме и определяют устойчивость к многочисленным прооксидантам, в том числе к ионизирующему излучению. В глиобластомах IDH1 дикого типа повышается продукция NADPH в ответ на облучение, что также способствует радиорезистентности. Напротив, нокдаун IDH1 дикого типа снижает уровень NADPH, делая клетки ГБ радиочувствительными in vitro и in vivo [37]. В клетках глиомы отмечается повышенная экспрессия митохондриального протеина семейства АТФаз и АТФ-зависимых митохондриальных калиевых каналов, что также способствует развитию радиорезистентности [38].

МикроРНК

МикроРНК представляют собой небольшие некодирующие РНК, которые обычно подавляют экспрессию генов на посттранскрипционном уровне. Изменения экспрессии некоторых микроРНК отмечены при различных формах рака [39].

Согласно обзору, выполненному H.G. Møller и соавт., в ГБ по сравнению с нормальной мозговой тканью выявляется повышенная экспрессия 235 и снижение уровня еще 95 микроРНК [40]. МикроРНК в ГБ активно влияют на сигнальные пути, связанные с ответом на облучение, и могут быть мишенью для воздействия с целью радиосенсибилизации. Обнаружено, что miR-124 увеличивает радиочувствительность клеток глиомы за счет выключения CDK4 [41, 42]. Избыточная экспрессия miR-1 и miR-221/222 обусловливают радиорезистентность клеток ГБ через сигнальный путь AKT вне зависимости от статуса PTEN. Сигнальный путь AKT модулирует экспрессию каталитической субъединицы ДНК-зависимой протеинкиназы (DNA-PKcs), которая участвует в репарации повреждений ДНК (DDR), тем самым повышая радиорезистентность [43]. Показано, что miR-1, miR-125a, miR-150 и miR-425 повышают радиорезистентность клеток ГБ, влияя на контрольные точки клеточного цикла [44]. Таким образом, эти исследования демонстрируют, что различные микроРНК могут регулировать радиорезистентность ГБ путем модуляции передачи сигналов пути AKT, контрольных точек клеточного цикла и активности репаративного пути DDR.

Клеточный цикл, репарация ДНК и другие молекулярные пути

В нескольких исследованиях получены данные о роли путей репарации ДНК в радиорезистентности ГБ. F. Marampon и соавт. сообщили, что фермент гистондеацетилаза (HDAC4 и HDAC6) в клетке обусловливает радиорезистентность ГБ за счет репарации двухцепочечных разрывов [45]. Повышенная экспрессия интегрина α6 также усиливает радиорезистентность ГБ за счет повышения эффективности репаративного пути DDR [46]. Повышение уровня EGFR и EGFRvIII стимулирует как гомологичную рекомбинацию, так и негомологичное соединение концов, а также активирует ключевой фермент DNA-PKcs, участвуя в репарации двунитевых разрывов ДНК [47].

Один из путей, вовлеченных в формирование радиорезистентности ГБ, это сигнальный путь Notch. Этот сигнальный путь важен для поддержания жизнедеятельности различных клеток, в том числе опухолевых и стволовых [48]. Эффект радиорезистентности реализуется через влияние на пути PI3K/AKT, а выключение сигнальных путей Notch 1 и 2 восстанавливает радиочувствительность стволовых клеткок глиомы [49]. Лучевое воздействие активирует путь AKT в ГБ и тем самым способствует развитию радиорезистентности [32]. Активация AKT может усилить восстановление повреждений ДНК (DDR) за счет разрешения очагов фосфорилированных гистонов (γ-H2AX), тогда как подавление AKT способствует нерепарируемым двунитевым разрывам ДНК в облученных клетках глиомы U251 [31, 47]. В ГБ часто изменена экспрессия гена PTEN — важного компонента в сигнальном пути PI3K/AKT [50]. Утрата или мутация PTEN приводит к активации AKT и, как следствие, к снижению радиочувствительности.

Опухолевый супрессор P53 является одним из наиболее часто дисрегулируемых генов при злокачественных опухолях человека и находится в центре сигнальных путей, ответственных за пролиферацию и выживаемость клеток. Около 40—50% ГБ характеризуются наличием мутаций в гене P53, и отсутствие p53-опосредованного апоптоза может быть фактором резистентности к терапии [51]. Нарушение способности P53 запускать экспрессию p21BAX является также одной из причин развития радиорезистентности в клетках ГБ [52].

Большое значение для формирования резистентности имеет сигнальный путь Wnt. Повышенная экспрессия Wnt/β-катенина коррелирует с агрессивностью ГБ и плохим прогнозом у пациентов [53]. Несколько генов, связанных с сигнальным путем Wnt, включая APC, FZD1, LEF1, TCF4 и WISP1, гиперэкспрессируются в радиорезистентных клетках ГБ [54]. Выключение пути Wnt/β-катенин восстанавливает радиочувствительность клеток ГБ [55].

В исследовании N. Kim и соавт. показано, что пациенты с ГБ и мутацией в гене ATM более чувствительны к проведению радиотерапии [56]. Играя центральную роль в системе репарации ДНК, гены XPC, BRCA2 и ATM определяют устойчивость ГБ к алкилирующим агентам и радиотерапии, а выключение ATM оказывает радиосенсибилизирующий эффект in vivo [56].

A. Balbous и соавт. в своих исследованиях подтвердили важность гена RAD51 в механизмах радиорезистентности стволовых клеток глиом [57]. Ингибирование RAD51 с помощью RI-1 приводило к уменьшению репарации ДНК и способствовало развитию апоптоза после облучения дозой 16 Гр в клетках, в которых выявлен высокий уровень экспрессии RAD51. Инактивация белков SOCS в клетках глиомы после облучения может активировать путь JAK/STAT, который увеличивает радиорезистентность [58].

Заключение

На данный момент многие опухоли ЦНС являются причиной высокой летальности пациентов, несмотря на многочисленные исследовательские усилия, клинические испытания препаратов и разработку методов улучшения результатов лечения.

Использование клеточных культур позволяет перейти к технологиям персонализированной медицины и индивидуального подбора доз и режимов лучевой терапии и химиотерапии. Гетерогенность опухолевых культур, полученных непосредственно от пациентов, является одним из преимуществ по сравнению с классическими линейными культурами, например такими как U87, U251, A172. Культуры, полученные от пациента, позволяют исследовать важные клеточные субпопуляции — инвазивную и неинвазивную фракцию стволовых клеток, а также клетки с повышенной миграционной активностью. В недавнем исследовании Z. Tang и соавт. показано, что «инвазивная» субпопуляция клеточной культуры U87 по сравнению с «неинвазивной» отличается повышенной способностью к репарации повреждений ДНК, снижением процессов апоптоза и увеличением клоногенной выживаемости инвазивных клеток [59]. Изучение этих особенностей опухоли обеспечивает новые подходы к снижению радиорезистентности. Например, перспективным представляется использование облучения с высоким линейным переносом энергии или создание молекул-регуляторов процессов, связанных с инвазией и миграцией опухолевых клеток, что является предметом разработки новых терапевтических стратегий.

Гетерогенность опухолевой культуры проявляется в различной радиочувствительности клеточных субпопуляций. Известно, что стволовые клетки глиом отличаются большей радиорезистентностью, чем другие опухолевые клетки. Получены данные о том, что белок одного из путей репарации — гомологичной рекомбинации RAD51 гиперэкспрессируется именно в стволовых клетках глиом, что приводит к восстановлению повреждений ДНК и восстановлению популяции опухолевых клеток. Соответственно, потенциальный интерес могут представлять молекулы, ингибирующие данный путь восстановления ДНК.

Создание клеточных культур прогрессирующих опухолей, полученных непосредственно от пациента, прошедшего курсы лучевого и химиотерапевтического лечения, позволяет изучать процессы химиорезистентности и радиорезистентности. Проведение геномного и транскриптомного анализа и выявление основных путей, которые задействованы в процессах радиорезистентности, позволит разрабатывать специфически нацеленные на них аптамеры и ингибиторы. Эксперименты на клеточных культурах с облучением позволяют сравнить радиочувствительность культур, полученных от пациентов сразу после первичного удаления опухоли и после многоэтапного лечения. Проведение данных экспериментов требует проработки техники облучения, в частности соблюдения принципов распределения доз в емкостях с клетками, точности подведения доз. В наших экспериментах для этих целей мы использовали специально изготовленный водоэквивалентный фантом для фиксации матрасов и планшетов с клеточными культурами. Использование специально изготовленного водоэквивалентного фантома позволило принципиально увеличить гомогенность и воспроизводимость полученных результатов [60].

Изучение радиосенсибилизаторов остается перспективным направлением для улучшения результатов лечения глиобластом. Необходимы дополнительные исследования механизмов радиорезистентности глиобластом и других опухолей, чтобы улучшить результаты лечения пациентов с этими заболеваниями. Преимущество перевиваемых и частично перевиваемых культур также состоит в том, что данные культуры могут быть использованы для создания ортотопических моделей. Например, линия U87 имеет посредственный инвазивный потенциал in vivo, что обусловливает интерес к перевиваемым клеточным культурам, которые могут содержать клетки с более высокими миграционными и инвазивными свойствами.

Представляется, что создание биоабанка клеточных культур, полученных от пациента при удалении глиобластом и других глиом, может сыграть значительную роль в поиске новых стратегий для улучшения результатов лечения пациентов с опухолями ЦНС.

Работа поддержана грантом Министерства науки и высшего образования Российской Федерации (соглашение №075-15-2021-1343).

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.