Введение

Тяжелая травма спинного мозга приводит к грубым и стойким нарушениям чувствительности, двигательных и тазовых функций. При нарушении морфологии спинного мозга в месте травмы образующийся травматический конгломерат препятствует репарации спинного мозга на клеточном уровне, делая невозможным самопроизвольное восстановление его функций [1]. Именно отсутствие функционального восстановления спинного мозга после его тотального поперечного повреждения до сегодняшнего дня заставляет относить эту патологию к неизлечимой. Механизмы тканевой репарации в спинном мозге признавались невозможными из-за микроокружения, явлений аутофагии, нарастания отека, нарушения кровоснабжения, гипоксии, пролиферации глии и последующего формирования глиального рубца [2]. В последнее время научный поиск сконцентрирован на механизмах, препятствующих описанным процессам. К их числу относят и исследования буферных сред, инъекции стволовых клеток, использование клеточных матриц и мембранных клеев [3—6].

В данной статье рассмотрен клинический эффект применения соединений на основе полиэтиленгликоля и хитозана после травмы спинного мозга в эксперименте на кроликах.

Цель исследования — изучить динамику клинической картины у кроликов с поперечно пересеченным спинным мозгом при применении смеси хитозана и полиэтиленгликоля (Нейро-ПЭГ), а также сопоставить клинические результаты с гистологической картиной.

Материал и методы

В качестве животной модели использованы кролики (n=20) средней массой 2,5 кг, самцы. Животных наркотизировали инъекцией золетила и ксилазина (1:4) после премедикации атропина сульфатом и дроперидолом. С дорсальной поверхности выполняли доступ к позвоночным дужкам на уровне Th8—Th10, выполняли ламинэктомию задней дужки Th9 позвонка (рис. 1, а, б). Твердую мозговую оболочку (ТМО) рассекали продольно на протяжении 5—7 мм по средней линии. В субдуральное пространство между передней поверхностью спинного мозга и задней поверхностью тел позвонков вводили гибкий шпатель. Лезвием скальпеля (№11) поперечно пересекали спинной мозг так, чтобы лезвие скальпеля упиралось в шпатель (рис. 1, в). Гемостаз производили орошением холодным (8 °C) изотоническим раствором натрия хлорида. В опытной группе (n=10) животным в место травмы вводили фотосшитый хитозан в гомогенной смеси с полиэтиленгликолем. Животным из контрольной группы (n=10) в место травмы вводили раствор хлорида натрия 0,9% (рис. 1, г). ТМО герметизировали, область операции укрывали жировой клетчаткой, рану послойно ушивали. Животных помещали в индивидуальные боксы для послеоперационного выхаживания. Всем животным согласно Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях [7], создавали условия достаточного обезболивания, световой режим ночь-день, предоставляли свободный доступ к воде и регулировали питание. Проводили кондиционирование помещений и поддерживали температурный режим.

Рис. 1. Этапы операции.

а — скелетирование дужек позвонков; б — выполненный доступ к спинному мозгу; в — поперечное пересечение спинного мозга, место травмы указано стрелкой; г — осуществление гемостаза и введение полиэтиленгликоля и хитозана. Желтой звездочкой указан головной конец; черной стрелкой — место травмы.

У всех животных до операции констатировали полный объем движений во всех конечностях, сохранность болевой и температурной чувствительности, физиологическую сохранность тазовых функций. Сразу после операции у всех животных развивалась нижняя параплегия с анестезией ниже уровня поражения, обнаруживались нарушения тазовых функций по типу задержки.

Оценивали двигательную активность, болевую чувствительность и состояние тазовых функций.

Уровень двигательной активности у животных исследовали по модифицированной шкале Basso Beattie Bresnahan (BBB) путем постановки обычной шаговой пробы на расстояние 1 м, с констатацией движений в суставах согласно шкале, а также с помощью теста с горизонтальной лестницей длиной 1 м, с шагом лестницы 2 см [8]. Чувствительность изучали путем раздражения иглой дистальные и проксимальные участки кожи задних конечностей. Оценивали реакцию животных. Отсутствие реакции оценивали в 0 баллов, звуковую реакцию (писк, крик) в ответ на болевое раздражение и/или попытку убрать раздражитель или уйти от него (при отсутствии движения в конечности) — в 1 балл, попытку отдернуть конечность — в 2 балла, активное сопротивление в ответ на раздражитель — в 3 балла.

Тазовые функции исследовали по показателям диуреза, дефекации, пальпаторного исследования и аускультации. Отмечали наличие или отсутствие диуреза и дефекации и их объем, наполненность мочевого пузыря, кишечника, аускультативно изучали моторику кишечника. Через 10 дней после операции стереотаксически выполняли инъекцию трассировочного витального красителя DiI в моторную кору.

Длительность эксперимента — 40 дней. На 14-е и 21-е сутки было выведено из эксперимента по одному животному из каждой группы для гистологического исследования. Остальных животных выводили из эксперимента на 40-е сутки после операции, посредством передозировки золетила извлекали 1 см спинного мозга с участком травмы, фиксировали в 4% параформальдегиде при 4 °C в течение суток. Проводили стандартную гистологическую проводку материала, выполняли гистологические срезы, окрашивали и исследовали с помощью микроскопа Zeiss PrimoStar-1.

Результаты

На протяжении всего эксперимента у животных из контрольной группы положительной динамики двигательной активности и чувствительности не отмечалось. У них сохранялась стойкая нижняя параплегия (рис. 2). Со вторых суток начинала прогрессировать задержка тазовых функций, которая разрешалась принудительным опорожнением мочевого пузыря, а копростаз чаще разрешался самостоятельно. На 3-и сутки умерло 1 животное из контрольной группы. На аутопсии выявлены переполненный мочевой пузырь с расширенными мочеточниками, застой каловых масс в кишечнике, частичная ишемия толстого и тонкого кишечника. Смерть еще трех животных из контрольной группы произошла на 5-е, 7-е и 12-е сутки со схожими результатами аутопсии. У животных из основной группы начиная с 1-х суток отмечалась положительная динамика в двигательной активности и чувствительности. Так, уже на 2-е сутки после операции у одного животного из основной группы выявлены активные движения задними лапами в горизонтальной плоскости (слабое подтягивание лап при передвижении) (рис. 3). В промежутке между 7 и 10 днем эксперимента у 5 из 8 (62,5%) животных основной группы сила в задних конечностях была достаточной для того, чтобы отталкиваться и сопротивляться руке экспериментатора при противодействии. К 14-му дню эксперимента у всех животных, получивших интраоперационно препарат полиэтиленгликоля с хитозаном, отмечены слабые движения и возвращение болевой чувствительности. Животные могли самостоятельно передвигаться, опираясь на задние лапы, однако совершать прыжок не могли. Тазовые нарушения к этому времени принимали непостоянный характер и, чаще после однодневной задержки, наступало самопроизвольное опорожнение мочевого пузыря и толстого кишечника. К 21-му дню эксперимента у животных сохранялся легкий нижний парапарез, но объем движений значительно увеличился. К 30-му дню двигательная активность животных оценивалась от 15 до 18 баллов, а чувствительность — в 2—3 балла. Такие показатели стойко сохранялись до конца эксперимента (рис. 4).

Рис. 2. Контрольная группа животных.

а, б — 2-е сутки после операции, стойкая параплегия; в, г — 21-е сутки после операции, параплегия сохраняется, животное не опирается на лапы, не чувствует их.

Рис. 3. Основная группа животных.

а, б — 2-е сутки после операции; в, г — 7-е сутки после операции, животное опирается на задние конечности; д, е — 21-е сутки после операции, животное активно использует задние конечности при ходьбе.

Рис. 4. Двигательные и чувствительные функции в эксперименте.

Период наблюдения до операции — 2 дня. День операции обозначен «0». После операции наблюдение — 40 дней (ось X). Баллы по шкале BBB — ось Y, для движений диапазон составлял от 21 до 0 баллов, для чувствительности — от 3 до 0 баллов. Желтый график — контрольная группа. Синий график — основная группа, двигательные функции. Красный график — основная группа, чувствительность.

Гистологическое исследование выявило морфологические различия между группами. Так, в контрольной группе место травмы характеризовалось наличием фиброзно-глиозной трансформации, пролиферацией глиальных клеток, наличием большого числа кистозных полостей, очагов некроза в разных стадиях организации, макрофагальной и фибробластной инфильтрацией. Ход аксонов был нарушен, в краниальном конце отмечали выраженное утолщение аксональных отрезков, их булавовидное изменение. Фиброзно-глиозный рубец занимал все пространство диастаза и прерывал ход аксонов (рис. 5). Гистологическая картина на 14-е, 21-е и 40-е сутки существенно не менялась.

Рис. 5. Гистологическая картина спинного мозга в области травмы у контрольной группы животных.

Окраска гематоксилином и эозином. а — кистозные полости в веществе спинного мозга (указаны стрелкой). Увеличение ×40; б — кистозная полость. Увеличение ×200; в — организующиеся некротические массы (желтая звездочка). Увеличение ×200; г — линия пересечения показана пунктиром (1). Визуализируется кистозная полость на границе отрезков спинного мозга (2), утолщенные проксимальные культи аксонов (3), усиление глиальной и фибробластной пролиферации (4), соединительнотканные волокна (5), очаги некроза в дистальном отрезке спинного мозга (6), мелкие кисты в дистальном отрезке спинного мозга. Увеличение ×400; д — область травмы (1), очаги некроза (2), булавовидные аксональные культи (3). Головной конец указан черной звездочкой. Увеличение ×400.

В основной группе по сравнению с контрольной явления дегенерации были выражены в значительно меньшей степени. Отмечали единичные кисты в веществе спинного мозга, извитость аксонов, их утолщение. Однако на большей площади в месте травмы визуализировали отсутствие глиальной пролиферации, макрофагальной инфильтрации. Искривленные и расширенные аксоны пересекали место травмы и визуализировались в каудальном направлении (рис. 6). Распространение трассировочного витального красителя в аксонах выявило связь между аксонами кранильного и каудального расположения относительно места травмы. Так, краситель распространялся через место травмы, прокрашивая аксоны на всем протяжении (рис. 7).

Рис. 6. Гистологическая картина спинного мозга в области травмы у основной группы животных.

Окраска гематоксилином и эозином. а — межаксональное пространство увеличено (показано стрелкой), ход аксонов не нарушен, имеется полость кисты (указана звездочкой). Увеличение ×40; б — утолщение аксонов (указано стрелками). Увеличение ×400; в — стрелками указано место травмы. Видны аксональные мостики (стрелки). Увеличение ×140; г — излишняя извитость аксонов в месте травмы. Увеличение ×140; д — место пересечения (1), извитые утолщенные аксоны (2). Увеличение ×400; е — место пересечения (1, стрелка и зеленая линия), 2 — утолщенные аксоны, переходящие место травмы. Головной конец указан желтой звездочкой. Увеличение ×400.

Рис. 7. Гистологическая картина спинного мозга в области травмы у основной группы животных с витальной трассировкой аксонов DiI.

а — общий вид; б — схема. 1 — место травмы (пунктир); 2 — аксональные мостики; 3 — распространение красителя по аксонам в проксимальном отрезке спинного мозга; 4 — распространение красителя в дистальном отрезке спинного мозга; 5 — распространение красителя через место травмы по ходу аксонов. Головной конец указан звездочкой.

Обсуждение

Восстановление спинного мозга после тяжелой спинальной травмы мало изучено. В эксперименте показана возможность восстановления нервной ткани и продемонстрированы ее функции после травмы под воздействием различных веществ. В работах S. Kouhzaei и соавт., C.Y. Kim и соавт. и других исследователей, которые используют полимерные соединения для решения этой проблемы, показаны схожие клинические результаты, которые превосходят результаты, полученные при исследованиях с использованием различных нейротрансплантатов и стволовых клеток [4—6]. Создание среды для ограничения вторичного повреждения спинного мозга в зоне травмы и создание условий для репарации нервной ткани патогенетически более оправдано, чем включение в зону травмы новых элементов. Если в периферическом нерве клеточное окружение после травмы способствует аксональному росту, то в центральной нервной системе наблюдается усиленный выброс факторов вторичного повреждения нервной ткани, и это приводит к глиозно-фиброзной трансформации. Такие явления препятствуют репарации аксонов, в том числе и из трансплантируемых клеток.

Изучаемые среды тормозят описанный эффект цитотоксичности. Рассмотренный в нескольких исследованиях эффект снижения цитотоксичности и усиления репарации аксонов путем мембранного восстановления и склеивания вызывает несколько категорий веществ, которые названы фузогенами или фузоген-герметиками (от англ. fusion — слияние) [3]. В нашем эксперименте рассмотрено действие авторской комбинации фузогенов на основе фотосшитого хитозана и полиэтиленгликоля. Точность сопоставления концов спинного мозга оказалась достаточной, чтобы аксоны из одной и той же функциональной группы были соединены между собой. Погрешности в сопоставлении компенсируются свойствами нейропластичности. Вероятно, в первую очередь имеют значение явления именно репарации, а не регенерации аксонов. В пользу этого говорят как ранние проявления двигательной активности у опытных животных, так и данные гистологического исследования.

Первые результаты проводимых экспериментов опубликованы нами в 2020 г., когда были получены морфологические признаки восстановления нервной ткани. Было показано, что применение соединения ПЭГ-хитозана после спинальной травмы вызывает в первую очередь репарацию аксонов с явлениями вторичной регенерации за счет создания оптимальных условий для роста аксона [9]. Настоящее исследование — продолжение изучения клинической картины и динамики функциональных и морфологических изменений у экспериментальных животных.

Выводы

Использование нами в эксперименте соединения хитозана и полиэтиленгликоля (Нейро-ПЭГ) у кроликов с пересеченным спинным мозгом для «склеивания» его отрезков приводит к определенному восстановлению двигательных, чувствительных и тазовых функций. Вероятно, ведущим механизмом в восстановлении ткани спинного мозга под воздействием препарата модифицированного хитозана является не аксональный рост, а эффект «слияния» поврежденных аксонов, который требует дальнейшего изучения.

Соблюдение правил биоэтики. Протокол исследования одобрен Локальным этическим комитетом ФГБОУ ВО «Ставропольский государственный медицинский университет» Минздрава России 12.03.20. Исследование выполнено в соответствии с этическими нормами обращения с животными, принятыми Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для исследовательских и иных научных целей.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — Лебенштейн-Гумовски М.В.

Сбор и обработка материала — Башаханов Р.М.

Статистический анализ данных — Лебенштейн-Гумовски М.В.

Написание текста — Лебенштейн-Гумовски М.В., Шатохин А.А.

Организация работы исследовательского коллектива, подготовка иллюстраций — Лебенштейн-Гумовски М.В.

Выполнение эксперимента — Лебенштейн-Гумовски М.В., Башаханов Р.М.

Руководство работами по биохимическому синтезу — Ковалев Д.А.

Выполнение биохимического синтеза — Жиров А.М.

Гистологическое исследование — Боташева В.С.

Научное руководство и редактирование текста — Гринь А.А.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Комментарий

Статья посвящена актуальной проблеме спинальной нейрохирургии — травме спинного мозга, в частности, применению полимерных соединений для стимуляции его регенеративного и репаративного потенциала. Данная тема активно развивается в Российской Федерации и за ее пределами.

В представленной статье авторы приводят многообещающие результаты, посвященные восстановлению двигательной и чувствительной активности лабораторных животных (кроликов) после управляемой хирургической травмы спинного мозга с последующим введением комбинации фузогенов на основе фотосшитого хитозана и полиэтиленгликоля.

Дизайн исследования ясен, способ иллюстрации результатов не вызывает вопросов.

Статья структурирована, содержит аннотацию, введение, описание материалов и методов исследования, результаты, обсуждение и заключение.

Данные иллюстрированы 7 рисунками, посвященными технике операции и сравнению результатов восстановления двигательных и чувствительных функций в опытной и контрольной группе.

Работа продолжает ранее начатые авторами исследования и фокусируется на клиническом эффекте применения соединения хитозана и полиэтиленгликоля.

Представленная на рецензию статья М.В. Лебенштейн-Гумовски и соавт. «Возможности клинического восстановления функций спинного мозга при его полном пересечении в эксперименте под воздействием полимерных соединений хитозана» представляет собой законченный научный труд, который является фундаментом для дальнейшего изучения перспектив применения соединения хитозана и полиэтиленгликоля для восстановления пациентов после травмы спинного мозга. Данная работа представляет несомненный интерес для практикующих специалистов и фундаментальных исследователей.

Д.С. Асютин (Москва)