Ожидаемая продолжительность жизни при рождении в последние годы непрерывно увеличивается как в нашей стране, так и в большинстве европейских стран [1, 2]. В связи с этим возрастает число лиц, достигающих пожилого возраста, что существенно повышает риск развития заболеваний, ассоциированных с этой возрастной группой. Одним из таких заболеваний является болезнь Паркинсона (БП), распространенность которой варьирует в общей популяции от 100 до 350 человек на 100 000 населения [3]. Двигательные нарушения (брадикинезия, ригидность и тремор), доминирующие в клинической картине БП, связывают с гибелью дофаминовых нейронов в вентральной области компактной части черного вещества (ЧВк) головного мозга и накоплением телец Леви в пигментированных (содержащих меланин) нейронах [4]. Тельца Леви, сформированные нерастворимыми агрегатами синуклеина и других белков, образующихся в результате нарушения работы убиквитин-протеасомной системы, механически смещают органеллы в нейронах, что может приводить к гибели последних и образованию свободного внеклеточного нейромеланина [5]. Высвобождение меланина при деструкции нейронов, как и накопление внеклеточных протеиновых агрегатов, обусловливает активацию микроглии [6], которая в свою очередь инициирует нейровоспалительную реакцию, усиливая гибель дофаминовых нейронов и усугубляя тем самым клинические проявления БП [7]. При старении по сравнению с БП убыль дофаминовых и пигментированных нейронов происходит значительно медленнее и не имеет «катастрофического» характера: на протяжении 2—3 десятилетий количество нейронов у взрослого человека снижается в среднем на 10% [8], а у пациента с БП на ранних стадиях болезни оно убывает на 50—90% [9].

Изложенное выше свидетельствует, что морфологическая основа возрастной инволюции головного мозга при старении и патоморфология БП изучены достаточно полно. Вместе с тем как при физиологическом старении, так и при БП недостаточно уточнены изменения экспрессии астроцитарных (глиального кислого фибриллярного белка, белка S100 и др.) и микроглиальных (IBA1, лектинов) белков. Одни авторы выявляют увеличение их экспрессии при старении [10] и БП [11], а другие его не обнаруживают [12]. Кроме того, при БП недостаточно изучены характер накопления в черном веществе (ЧВ) соединений железа и та роль, которую они играют в условиях патологии [13].

Цель работы — уточнить особенности морфохимических изменений клеточных структур ЧВ головного мозга при БП.

Исследовали аутопсийный материал головного мозга умерших от интеркуррентных заболеваний лиц с БП (3 случая) и лиц, у которых в анамнезе сведения о неврологических расстройствах отсутствовали (8 случаев), — контрольная группа. Возраст умерших с БП составлял в первом случае 60 лет, во втором — 70 лет, а в третьем — 74 года. Ретроспективный анализ результатов клинического обследования больных показал, что во всех 3 случаях была диагностирована смешанная форма БП, у одного из пациентов установлена 2-я стадия заболевания, а у двух других — 3-я стадия (по шкале Хена—Яра). Длительность заболевания составила в одном случае 5 лет, в другом — 6 лет, а в третьем — 10 лет. В контрольной группе к периоду пожилого возраста (от 60 и до 75 лет) отнесли 3 случая, а к периоду старческого возраста (старше 75 лет) — 5 случаев. Средний возраст умерших из контрольной группы составил 77 лет.

Аутопсийный материал головного мозга фиксировали в 10% растворе формалина, затем дегидратировали и заключали в парафиновые блоки, которые на уровне ЧВк раскладывали на фронтальные срезы толщиной 10 мкм. Часть гистологических срезов окрашивали гематоксилином и эозином, а также по методу Ниссля. Другую часть срезов использовали для проведения гистохимических и иммуногистохимических реакций. Для выявления соединений железа (II) в структурах ЧВ применяли метод Перлса, предварительно обрабатывая срезы 30% раствором перекиси водорода в течение 30 мин. Иммуногистохимически выявляли дофаминовые нейроны, используя поликлональные антитела к тирозингидроксилазе («Sigma», №T8700) в разведении 1:1500, и астроцитарную нейроглию, применяя реакцию с моноклональными антителами («Sigma», №G3893) на кислый глиофибриллярный белок (GFAP) в разведении 1:200. Микроглию выявляли авидинпероксидазным методом при помощи антител к белку IBA1 (1:200, «Sigma», №SAB2500042), который экспрессируется как находящейся в стадии покоя, так и активированной микроглией [10]. В качестве хромогена использовали 3,3-диаминобензидин с хлоридом кобальта. Иммуногистохимические реакции выполняли согласно протоколу фирмы «Sigma-Aldrich». Кроме того, выявляли накопление альфа-синуклеина, фосфорилированного по серину-129 (α-Syn-p129), составного элемента телец Леви и специфического маркера Б.П. Использовали первичные антитела к α-Syn-p129 («Wako»; № 015−25191), а также вторичные антитела из набора Multivision («Тhermo Scientific»; №TL-012-MHRA). Препараты исследовали визуально и оценивали количественно на микроскопе Leica DMLB, оснащенном цифровой видеокамерой и программой анализа изображений Leica QWin. Изучали морфохимические изменения структур ЧВ головного мозга при БП, оценивая локализацию тирозингидроксилазы, соединений железа (II), GFAP и др. Дофаминовые нейроны в сегментах вентральной области ЧВк подсчитывали в поле зрения микроскопа (об. ×40, ок. ×10), используя каждый 5-й срез. Накопление α-Syn-p129 в ЧВк оценивали по количеству телец Леви, выявленных (об. ×40, ок. ×10) на единицу площади гистологического среза (0,01 мм²), т. е. подсчитывали плотность распределения телец Леви, также используя каждый 5-й срез. Полученные данные обрабатывали статистически c использованием пакета прикладных программ SigmaPlot-12.0. Различия по числу дофаминовых нейронов в сегментах вентральной области ЧВк и плотности распределения телец Леви в ЧВк у лиц с БП и в контрольной группе устанавливали с использованием U-критерия Манна—Уитни. Данные представляли в виде: Me [LQ; HQ], где Me — медиана; LQ — 1-й квартиль; HQ — 3-й квартиль.

В области среднего мозга у лиц контрольной группы ЧВ наблюдали в виде тяжа, который располагался между красным ядром и основанием ножек мозга и разделялся на две части: редкоклеточную ретикулярную и густоклеточную компактную. В последней выделяли две области: дорсальную и вентральную (рис. 1, а). По сравнению с контрольной группой у лиц с БП нейроны в ЧВк располагались более разреженно, а в одном случае БП в дорсальной области выявляли лишь отдельные клеточные скопления (см. рис. 1, б).

Дофаминовые нейроны выявляли в ЧВк как у лиц контрольной группы (рис. 2, а), так и у лиц с БП (см. рис. 2, б). В то же время в контрольной группе число дофаминовых нейронов в вентромедиальном и промежуточном сегментах вентральной области ЧВк, выявленных на одном срезе, составило 178 [158; 196], а у лиц с БП — 136 [114; 158]. Эмпирическое значение U-критерия Манна—Уитни определяли как 43, а его критическое значение — 201 (для р<0,01).

Соединения железа (II) в контрольной группе располагались вокруг стенок сосудов и в единичных клеточных элементах (рис. 3, а), а наиболее интенсивно его соединения окрашивались в вентральной области ЧВк и ретикулярной части ЧВ. В нейронах и нейроглии соединения железа (II) при БП выявляли в большом количестве (см. рис. 3, б), а в нейропиле интенсивность реакции на железо (II) была меньше, чем в клеточных элементах, но выше, чем в контроле.

Тельца Леви в ЧВк обнаруживали как в мозге у лиц контрольной группы, так и при БП, используя морфологическое окрашивание по Нисслю и иммуногистохимическое окрашивание на α-Syn-p129 (рис. 4, а—в). В контрольной группе их обнаруживали в 3 из 8 случаев исключительно в мозге людей старческого возраста. У лиц с БП, как и в контрольной группе, α-Syn-p129 локализовался в телах нейронов в виде интенсивно окрашенных агрегатов округлой формы и в отростках нейронов в виде веретенообразных включений с небольшими утолщениями. Кроме того, обнаруживали нейроны с цитоплазматическим окрашиванием на α-Syn-p129, но без крупных агрегатов белка. Интенсивность накопления α-Syn-p129 (плотность распределения телец Леви) составила на 0,01 мм² гистологического среза в контрольной группе 2 [1; 3], а у лиц с БП 3 [2; 5]. Эмпирическое значение U-критерия Манна—Уитни определяли как 183,5, а его критическое значение — 192 (для р<0,01).

Астроциты, содержавшие GFAP, как в случаях контроля, так и в случаях БП распределены по ЧВ головного мозга неравномерно. Преимущественно их обнаруживали на границе компактной и ретикулярной частей вне групп скоплений нейронов и в периферическом сегменте ретикулярной части на границе с красным ядром. В случаях контроля у большинства астроцитов, содержавших GFAP, интенсивность окрашивания тела была умеренной (рис. 5, а), а в случаях БП — значительной (см. рис. 5, б). Для GFAP-позитивной нейроглии ЧВ у лиц контрольной группы характерны длинные тонкие отростки (см. рис. 5, а), тогда как у лиц с БП — короткие утолщенные (см. рис. 5, б).

Наиболее часто микроглиоциты при реакции на белок IBA1 выявляли в ретикулярной части ЧВ как в контрольной группе, так и при Б.П. При этом обнаруживали как микроглию с разветвленными, извитыми отростками (в стадии покоя), так и активированные клетки, имевшие овоидную форму с утолщенными короткими отростками или без них (рис. 6, а, б). Активированные клетки микроглии и макрофаги, интенсивно экспрессирующие IBA1, в мозге у лиц с БП располагались преимущественно вокруг сосудов.

Проведенная работа позволила обнаружить как в группе контроля, так и при БП внутриклеточные включения, содержащие α-Syn-p129 (тельца Леви), в нейронах ЧВк головного мозга. Кроме того, при БП, как и в группе контроля, в этом же образовании мозга выявляли нейроглию, накапливающую соединения железа (II) и характеризующуюся увеличенным содержанием GFAP. Следовательно, проведенная работа позволила продемонстрировать взаимосвязь старения и БП на основе сходных морфологических изменений, формирующихся в ЧВ при возрастной инволюции и нейродегенеративном процессе.

Вместе с тем убыль дофаминовых нейронов в ЧВк при БП была существенно выше, чем в контроле, что соответствует данным литературы [14]. Тельца Леви в ЧВк выявляли в контрольной группе исключительно у лиц старческого возраста, а при БП — в пожилом возрасте. Наряду с этим в случаях БП накопление телец Леви в ЧВк было выше, чем в случаях контроля, и коррелировало с данными литературы [15]. Кроме того, накопление соединений железа (II) в клеточных элементах и нейропиле и усиление экспрессии GFAP в клетках нейроглии при БП выражены более отчетливо, чем при физиологическом старении.

Следовательно, интенсивность структурных изменений, выявленных в ЧВ головного мозга при возрастной инволюции (физиологическом старении) и нейродегенеративном процессе (БП), была различной. Во втором случае она значительно выше, чем в первом.

Умеренная активация микроглии, описанная нами у пациентов с БП, длительность заболевания у которых составляла не менее 5 лет, согласуется с данными других авторов [16], установивших, что увеличение активности микроглии происходит лишь в начальной стадии заболевания и приводит к избыточной потере синапсов, инициируя последующие патоморфологические изменения. Подобную реакцию микроглии наблюдали и в группе контроля, что согласуется с данными других исследователей [10], обнаруживших в ЧВк при старении признаки умеренной активации микроглии. Установленное нами более отчетливое усиление экспрессии GFAP в ЧВ у лиц с БП по сравнению с контролем может свидетельствовать, что астроглиоз до некоторой степени предохраняет гибель части нейронов при прогрессировании нейродегенеративного процесса.

Таким образом, у лиц с БП патологоанатомический диагноз (сопутствующее заболевание) не должен основываться лишь на выявлении в ЧВк телец Леви и активированных глиальных клеток. Он должен быть существенно обоснован изучением качественных и количественных изменений клеточных структур ЧВк. Кроме того, как показало наше исследование, структурные изменения ЧВк, обусловленные инволютивным процессом при старении, усугубляются и значительно усиливаются в связи с формированием патологии. Этот факт следует учитывать при разработке прижизненных методик идентификации латентной стадии нейродегенеративных заболеваний, столь необходимых клиницистам для уточнения диагноза и своевременного назначения нейропротекторов [17], и верифицировать клинический диагноз у пациентов из группы риска, прибегая к нейроморфологическим методам в максимально ранние сроки.

Исследование выполнено при частичной финансовой поддержке РФФИ в рамках научного проекта № 16−04−00377 а.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования: В.Н.С., Р.М.Х., Д.Н.В.

Сбор и обработка материала: В.Н.С., Д.Н.В., В.Б.С., К.А.К.

Статистическая обработка: В.Н.С.

Написание текста: В.Н.С., Д.Н.В.

Редактирование: Р.М.Х.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.