Аденокарцинома желудка, ассоциированная с вирусом Эпштейна—Барр (EBV), по разным данным, составляет от 2 до 20% всех аденокарцином желудка при средней частоте встречаемости 10% [1, 2]. Объединенные частоты EBV-ассоциированного рака желудка составляют в Северной Америке 9,9%, Европе 9,2%, Азии 8,3% соответственно [3]. По другим сведениям, общемировая частота встречаемости составила 8,2%, в том числе: в Северной Америке 12,5%, Европе 13,9%, Азии 7,5% [4] (табл. 1).

Частота встречаемости EBV-ассоциированного рака желудка умужчин примерно в 2 раза выше, чем у женщин, однако это соотношение значительно уменьшается в старших возрастных группах [5] .

ЕBV (герпес-вирус 4-го типа) относится в семейству гамма-герпес-вирусов, геном которых представляет собой двуспиральную ДНК размером около 170 тыс. пар оснований. Это один из наиболее распространенных вирусов, считается, что показатель инфицированности им населения превышает 90% [6]. EBV стал первым вирусом, для которого была установлена прямая онкогенная активность. В 1964 г. британский патолог M. Epstein и вирусолог Y. Barr визуализировали вирусные частицы при электронной микроскопии клеток культуры лимфомы Беркитта, что послужило подтверждением ранее выдвинутой гипотезы о ее связи с инфекционным началом [7]. Последующие исследования показали, что EBV также участвует в патогенезе и ряде других злокачественных опухолей, таких как назофарингеальный рак, лимфома Ходжкина, экстранодальная NK/T-клеточная лимфома [8, 9].

В развитии рака желудка роль инфекционных агентов изучается давно — многие годы эти работы были сконцентрированы на бактерии Helicobacter pylori [10]. Считается, что она вызывает хронический гастрит путем стимуляции высвобождения провоспалительных цитокинов и путем развития ахлоргидрии с развитием каскада событий от метаплазии додисплазии с возможной малигнизацией [10]. Только определенные штаммы H. pylori способны продуцировать онкогенные белки, такие как CagA (cytotoxin-associated gene A) и VacA (vacuolating cytotoxin A), и именно эти штаммы ассоциированы с малигнизацией, что привело к значительной переоценке роли H. pylori в патогенезе аденокарциномы желудка. CagA вводится бактерией в клетки покровно-ямочного эпителия, его активация приводит к усилению активности онкогенов, блокированию активности многих генов-супрессоров, увеличению концентрации активных форм кислорода, изменениям профиля микроРНК клеток и рекрутированию опухольассоциированных макрофагов, которые способны подавлять противоопухолевый иммунитет. Белок VacA усиливает экспрессию EGFR (epidermal growth factor receptor) на поверхности клеток покровно-ямочного эпителия, что также способствует развитию аденокарциномы [11]. После транслокации белка CagA в клетку он активируется киназами SRC и ABL путем прямого фосфорилирования; негативная регуляция активности CagA осуществляется через фосфатазу SHP1 (tyrosine-protein phosphatase non-receptor type 6). Заражение EBV приводит к метилированию промотора гена SHP1, что блокирует его экспрессию и резко усиливает фосфорилирование и активность белка CagA. Таким образом, коинфекция EBV и H. pylori является гораздо более грозным фактором канцерогенеза, чем моноинфекция H. pylori [10].

В аденокарциноме желудка EBV не интегрируется в геном клетки-хозяина, а остается в виде плазмидоподобного включения кольцевой вирусной ДНК (вирусная эписома). Вирусная эписома находится в цитоплазме клетки-хозяина в большом количестве копий и передается дочерним клеткам в процессе деления цитоплазмы во время митоза. Методом секвенирования установлены однородность числа концевых повторов в ДНК вирусной эписомы в цитоплазме EBV-позитивных клеток рака желудка и высокая степень гомологии мутационного профиля ДНК клетки-хозяина, что позволяет ряду авторов предполагать единое клональное происхождение клеток EBV-ассоциированных аденокарцином желудка и, по их мнению, свидетельствует о непосредственном участии EBV в патогенезе опухолей данного типа [12].

EBV способен вызывать злокачественную трансформацию эпителиальных клеток за счет интенсивной экспрессии вирусных белков ивирусных некодирующих РНК; роль ключевого медиатора EBV-ассоциированного канцерогенеза в клетках покровно-ямочного эпителия отводится транскрипционному фактору ZEB-1 (zinc finger E-box binding factor 1) [13]. EBV также способен вызывать аберрантное метилирование ДНК клетки-хозяина, что приводит к транскрипционной инактивации генов-супрессоров опухолевого роста на ранних стадиях канцерогенеза в желудке [14]. Методами полноэкзомного, транскриптомного и эпигеномного секвенирования установлено, что EBV индуцирует мутационные нарушения в генах AKT2, CCNA1, MAP3K4, TGFBR1, ACSS1, FAM3B, IHH и TRABD клетки-хозяина (рис. 1)

Согласно определению А. Shinozaki и соавт. [16], EBV-ассоциированная аденокарцинома желудка определяется как моноклональная пролиферация опухолевых клеток без признаков внутриопухолевой гетерогенности с экспрессией различных латентных генов EBV. Акцент на отсутствии внутриопухолевой гетерогенности не бесспорен и частично противоречит современным представлениям о патогенезе опухолей. «Золотым стандартом» идентификации EBV является метод гибридизации in situ (ISH), позволяющий выявлять малые вирусные РНК EBER1 (Epstein—Barr virus-encoded small RNAs), концентрация которых в пораженных клетках достигает 10⁷ молекул на одну клетку [17].

Показана связь EBV-ассоциированного рака желудка с факторами, приводящими к развитию хронического атрофического гастрита (рис. 2, а, б), среди которых выделяют рефлюкс желчи, курение и др. [16]. Статистически значимой корреляции с употреблением алкоголя не обнаружено [18].

Данные о прогностическом значении EBV в аденокарциномах желудка противоречивы. В одних работах [19] показано, что для EBV-ассоциированного рака желудка характерны более низкая вероятность метастазирования (n=26), особенно на ранних стадиях, а также лучшая выживаемость по сравнению с EBV-негативными аденокарциномами. В других работах [20, 21] показано, что EBV-ассоциированный рак связан с худшей выживаемостью (n=192). Однако самое крупное исследование [4] (n=4599) показало, что EBV-ассоциированные аденокарциномы имеют более высокие показатели выживаемости.

Макроскопически EBV-ассоциированные раки желудка обычно представляют собой изъязвленные или блюдцеобразные опухоли с утолщением стенки желудка [19]. EBV-ассоциированные раки имеют тенденцию к образованию четкой границы между опухолевой и нормальной тканью (демаркация), не индуцируют десмопластическую реакцию и поэтому не склонны к формированию фиброза в подслизистой основе, что является важным условием для успешной эндоскопической мукозальной резекции опухоли [22]. EBV-ассоциированные раки желудка могут сочетаться с опухолями других локализаций синхронно или метахронно [23].

Морфологическая классификация EBV-ассоциированного рака желудка разработана A. Shinozaki, T. Ushiku и M. Fukayama [24] и не является официально принятой. Гистологически среди EBV-ассоциированных аденокарцином выделяют два основных типа (табл. 2):

Рак желудка с лимфоидной стромой (gastric carcinoma with lymphoid stroma — GCLS) определяется как карцинома с микроальвеолярным, трабекулярным или примитивно-тубулярным компонентом с равномерно плотной и диффузной лимфоцитарной инфильтрацией [26]. Общая частота встречаемости от 1,6 до 8,9% [1] или, по другим данным [27], 4,1%. Рак желудка с лимфоидной стромой включает несколько морфологических подтипов [19]: лимфоэпителиоподобную карциному, карциному с тканевой реакцией, подобной болезни Крона, и EBV-ассоциированную аденокарциному с остеокластоподобными гигантскими клетками.

Лимфоэпителиоподобная карцинома (lymphoepithelioma-like carcinoma; ICD-O 8082/3 [28]) описывается как малодифференцированная карцинома с высокой плотностью лимфоцитарной инфильтрации, крайне схожая по морфологии с типичной назофарингеальной карциномой. В связи с высокой плотностью лимфоцитарной инфильтрации идентифицировать одиночные опухолевые клетки при обзорном окрашивании гематоксилином и эозином трудно. Иммуногистохимическое окрашивание на цитокератины в сочетании с EBER-ISH позволяет с высокой точностью визуализировать опухолевые клетки эпителиального происхождения. В 1990 г. A. Burke и соавт. [29] впервые сообщили обассоциации лимфоэпителиоподобной аденокарциномы желудка с EBV. Более 80% раков желудка с лимфоэпителиоподобной морфологией являются EBV-позитивными [9, 19, 30]. Общая частота встречаемости до 2,7% [1].

Карцинома с тканевой реакцией, подобной болезни Крона (carcinoma with Crohn’s disease-like lymphoid reaction), определяется как опухоль с наличием двух или трех лимфоидных фолликулов с активными герминативными центрами в инвазивном крае опухоли, меньшим количеством лимфоцитов, частым формированием тубулярных или железистоподобных структур с минимальной десмоплазией или ее отсутствием [31]. Этот подтип представляет собой промежуточный вариант между лимфоэпителиоподобной карциномой иаденокарциномой обычного строения [16]. Общая частота встречаемости до 2,4% [27].

EBV-ассоциированная аденокарцинома с остеокластоподобными гигантскими клетками (EBV — carcinoma with osteoclast-like giant cells) характеризуется associated-гранулематозной реакцией с формированием небольших кластеров эпителиоидных клеток с наличием гигантских многоядерных клеток, отличающихся от клеток типа Лангханса (Langhans) или Тутона (Touton) и напоминающих по морфологии остеокласты. Общая частота встречаемости — до 0,7%. Наличие гранулематозного воспаления позволяет ряду авторов [24] предположить, что опухолевые клетки эпителиального происхождения продуцируют факторы, которые привлекают гистиоциты и вызывают их слияние в остеокластоподобные гигантские клетки.

EBV-ассоциированный рак желудка, имеющий строение типичной аденокарциномы, обычно описывается как высоко- или умеренно дифференцированная аденокарцинома с вариабельной лимфоцитарной инфильтрацией и может быть классифицирована как аденокарцинома кишечного типа по P. Lauren (см. рис. 2, в)

EBV-ассоциированный рак желудка на ранних стадиях имеет характерную морфологию «кружевного рисунка» (lace pattern) при малом увеличении — нерегулярные анастомозирующие тубулярные структуры с выраженной или умеренной лимфоцитарной инфильтрацией, что может быть основанием к назначению EBER-ISH.

При изучении маркеров дифференцировки EBV-ассоциированного рака желудка установлено, что половина подобных опухолей характеризуется интенсивной экспрессией муцинов желудочного типа (MUC5AC, MUC6), а другая половина опухолей не экспрессирует муцины желудочного типа и маркеры кишечной дифференцировки (MUC2 и CD10) [16]. Более 80% EBV-позитивных аденокарцином экспрессирует CLDN18 (ген клаудина 18-го типа), а CLDN3 (ген клаудина 3-го типа) экспрессируется только в 5% опухолей. CLDN18 и CLDN3 относятся к семейству белков-клаудинов, которые участвуют в образовании плотных контактов. Экспрессия CLDN18 специфична для нормальной слизистой оболочки желудка и ткани легкого, а CLDN3 экспрессируется в нормальной слизистой оболочке тонкой и толстой кишки и участках кишечной метаплазии и не экспрессируется в нормальной слизистой оболочке желудка (табл. 3).

Независимо от морфологического типа 20—80% от общего числа опухолевых клеток EBV-ассоциированных аденокарцином являются EBV-позитивными, что позволяет ряду авторов [16] говорить об исключительной роли EBV в канцерогенезе, хотя в литературе отсутствует убедительная информация о взаимосвязи гистологических типов, этиологических факторов, анатомической локализации, клеточного фенотипа, генетических или эпигенетических нарушений, поэтому причина описанного выше гистологического разнообразия среди EBV-ассоциированных аденокарцином неизвестна.

Выраженная воспалительная инфильтрация опухолевой ткани является одной из характерных гистологических особенностей EBV-ассоциированных раков желудка. Инфильтрат преимущественно представлен лимфоцитами (CD4+ или CD8+), а также CD68-позитивными клетками [1, 33—35]; часто выраженная инфильтрация опухолевой ткани В-лимфоцитами, плазматическими клеткам или нейтрофилами. Морфологическую диагностику может осложнять наличие в составе инфильтрата клеток Мотта (Mott), напоминающих опухолевые клетки и представляющих собой плазматические клетки с множественными тельцами Русселя (Russell) в цитоплазме [36].

Полиморфный состав внутриопухолевого воспалительного инфильтрата является важным морфологическим признаком EBV-ассоциированного рака желудка, что свидетельствует о высокой иммуногенности EBV, и считается, что именно это свойство определяет хороший прогноз [37].

В качестве предопухолевого или фонового процесса для EBV-ассоциированной аденокарциномы обсуждается глубокий кистозный гастрит (gastritis cystica profunda — GCP), характеризующийся полипоидной гиперплазией и кистозным расширением желез, которые достигают мышечной пластинки либо обнаруживаются в подслизистой основе, что связывают с повреждением мышечной пластинки при гастрэктомии и других оперативных вмешательствах на желудке. EBV часто поражает пострезекционные культи желудка (6—30%) [1], поэтому в зоне анастомозов EBV-ассоциированная аденокарцинома встречается чаще. Показано, что частота выявления EBV-позитивных опухолевых клеток значительно выше при раке желудка, ассоциированном с GCP (31,1%) по сравнению с раком желудка без сопутствующего GCP (5,8%), в связи с чем авторами выдвинута гипотеза, что возникновение GCP может изменять характер воспалительного ответа в слизистой оболочке желудка, однако до сих пор неясно, является ли GCP предопухолевым процессом или нет [38].

Основные характеристики EBV-ассоциированного рака желудка кратко представлены в табл. 4.

Механизм проникновения EBV в В-лимфоциты реализуется через рецептор CD21 (CR2) [39]. Установлено, что при культивировании эпителиальных клеток совместно с EBV-продуцирующими лимфобластоидными клетками заражение эпителиальных клеток происходит значительно быстрее, чем при культивировании с вирусными частицами. В связи с этим контакт эпителиоцитов с лимфобластоидными клетками рассматривается как основная модель проникновения EBV в эпителиальные клетки [40].

Ввиду этого предполагаемого механизма, хронический гастрит может увеличивать вероятность взаимодействия эпителиальных клеток слизистой оболочки желудка и В-лимфоцитов, а цитокины, продуцируемые клетками воспалительного инфильтрата, могут поддерживать рост клеток желудка, зараженных EBV [41].

В большинстве исследований для изучения роли EBV в канцерогенезе рака желудка использовали метод межклеточного взаимодействия in vitro путем вторичного заражения клеток аденокарциномы желудка. В этих экспериментах использовали линии опухолевых клеток, что не дает возможности ответить на вопрос, может ли EBV непосредственно индуцировать опухолевую трансформацию нормальных эпителиальных клеток либо участвовать в изменении биологических свойств клеток, уже прошедших стадию опухолевой трансформации [42].

В классической вирусологии имеется два термина, которые описывают способы взаимодействия любого вируса с клеткой-хозяином: литический цикл и латентный цикл. Литический цикл — это такое взаимодействие вируса с клеткой, при котором наступает гибель клетки путем разрыва плазматической мембраны с последующим выходом в среду новых вирусных частиц. Латентный цикл — это длительное персистирование вируса внутри клетки в виде нуклеиновой кислоты и комплекса вирусных белков без гибели клетки [43]. Для EBV характерен латентный цикл — длительное присутствие вирусной эписомы в клетках, которая обеспечивает непрерывную экспрессию вирусных белков и других транскриптов. В зависимости от набора экспрессируемых вирусных белков выделяют три типа латентного цикла EBV (табл. 5).

С момента контакта EBV с лимфоцитом или эпителиальной клеткой он надолго закрепляется в ней. Стоит отметить, что EBER-1, EBER-2, EBNA-1 (EBV-determined nuclear antigen) и микроРНК типа BART экспрессируются во всех латентных циклах. Латентный цикл 1-го типа специфичен для лимфомы Беркитта, характеризуется экспрессией EBER-1, EBER-2, EBNA-1, мРНК BART в пораженных клетках. Латентный цикл 2-го типа специфичен для лимфомы Ходжкина, характеризуется экспрессией LMP-1, LMP-2A и LMP-2B (latent membrane protein), а также EBER-1 и EBNA-1. Латентный цикл 3-го типа характеризуется экспрессией всех белков и всех вирусных РНК, встречается редко, в основном в лимфомах, ассоциированных с иммунодефицитами [44].

Считается, что EBV-ассоциированные аденокарциномы желудка занимают промежуточное положение между латентными циклами 1-го и 2-го типа, так как EBER-1, EBNA-1 и мРНК BART экспрессируются всегда, а LMP-1 и LMP-2A — только в половине случаев [42, 45]. Было проведено два исследования, в ходе которых сравнивали профили экспрессии вирусных белков и РНК в EBV-ассоциированных аденокарциномах желудка [46, 47]. Среди всех латентных генов преобладала экспрессия РНК EBER вместе с BART. Экспрессия белков LMP-2A, LMP-2B и EBNA-1 зарегистрирована на низком уровне. Также в ряде случаев обнаружена выраженная траскрипция ранних литических вирусных генов BZLF1 и BRLF1, однако при этом не наблюдали признаков литического повреждения клеток-хозяев [46]. Похожим образом экспрессия BZLF1 обнаружена в клетках рака желудка, которые культивировали in vitro в присутствии EBV, однако в клетках опухоли не развивался литический цикл. Исходя из этих данных, появилась гипотеза о том, что обратимый литический цикл (имеется в виду репликация вирусной эписомы, сопровождающаяся экспрессией ранних литических генов, но не приводящая к развитию литического цикла и гибели клетки), а не латентный цикл может являться основным механизмом амплификации генома EBV в клетках рака желудка [48]. Эта теория хорошо объясняет постоянную персистенцию вируса в клетках аденокарциномы желудка при отсутствии высокого уровня экспрессии белка EBNA-1, который является ключевым вирусным белком, ответственным за репликацию вирусного генома и формирование вирусных эписом.

Вирусный белок LMP-1 является ключевым фактором канцерогенеза при трансформации B-клеток в автономно пролиферирующие лимфобластоидные клеточные линии. Показано, что экспрессия LMP-1 в клетках аденокарциномы желудка находится на низком уровне [42].

LMP-1 — это вирусный белок, который способен встраиваться в мембрану зараженной клетки и выполнять функцию псевдорецептора [6, 45]. Внутриклеточный домен LMP-1 имеет высокую степень гомологии с рецептором TNF-α и рецептором CD40, что обеспечивает непрерывную передачу сигнала по сигнальным путям NF-kB, PI3K и JNK и приводит к неопластической трансформации зараженных клеток, а также к прогрессии опухолевого роста [49]. В связи с относительно низким уровнем экспрессии LMP-1 в клетках аденокарциномы желудка необходимо рассмотреть возможное участие других вирусных транскриптов в процессе канцерогенеза. Биологические функции других латентных генов EBV кратко представлены в табл. 6.

EBERs. EBERs (Epstein—Barr virus-encoded small RNAs) — малые вирусные РНК, представляющие собой наиболее часто экспрессирующиеся транскрипты генома EBV, обнаружены во всех типах латентных циклов. Считается, что EBERs выполняют следующие функции [59]:

— регуляцию процессов пролиферации клеток;

— усиление резистентности к апоптозу;

— усиление продукции аутокринных факторов роста;

— взаимодействие с белками клетки-хозяина для усиления передачи сигнала по определенным каскадам.

Роль EBERs в патогенезе аденокарциномы желудка изучена недостаточно. D. Iwakiri и соавт. [50] продемонстрировали, что EBV индуцирует экспрессию IGF-1 (insulin-like growth factor 1) в линиях EBV-негативной аденокарциномы желудка, который может выполнять роль аутокринного фактора роста.

Известно, что EBER-1 изменяет экспрессию микроРНК в клетке-хозяине, что приводит к снижению экспрессии E-кадгерина и может быть причиной эпителиомезенхимального перехода в клеточных линиях аденокарциномы желудка [51]. Показано, что EBERs способны усиливать экспрессию IL-6 и активировать белок STAT3, который является белком-посредником в сигнальном пути от рецептора IL-6. Такое воздействие приводит к снижению экспрессии ингибиторов клеточного цикла p21 и p27, что может быть ассоциировано с резистентностью к химиотерапии. EBERs способны индуцировать активацию прометастатических молекул, таких как pFAK (focal adhesion kinase, PTK2 — protein tyrosine kinase 2) и pPAK1 (серин-треонинкиназа, участвующая в ремоделировании цитоскелета) и ингибировать активность антиметастатических белков, таких как RhoGD1 и KAI-1 (CD82 — мембранный гликопротеин) [52]. Считается, что нарушение баланса между этими двумя группами факторов усиливает способность к миграции и метастазированию у клеток EBV-ассоциированного рака желудка.

EBNA-1. EBNA-1 является единственным вирусным белком, который конститутивно экспрессируется во всех типах EBV-ассоциированных опухолей, так как этот белок важен для репликации и стабильной персистенции вирусных эписом (см. табл. 6). Показано, что EBNA-1 способен усиливать геномную нестабильность в клетке-хозяине, что характеризует этот белок как потенциальный онкоген [1], но сведений об участии EBNA-1 в патогенезе аденокарциномы желудка в литературе мало.

Поскольку EBNA-1 является важнейшим белком для амплификации генома EBV и может выполнять функцию онкогена, он становится потенциальной мишенью для таргетной терапии EBV-ассоциированного рака желудка, но низкий уровень экспрессии EBNA-1 ограничивает эти возможности [1].

LMP-2A. Белок LMP-2A экспрессируется в половине случаев EBV-ассоциированной аденокарциномы желудка и в отличие от других латентных генов его роль в канцерогенезе рака желудка хорошо исследована. LMP-2A ингибирует TGFb-индуцированный апоптоз в клеточных линиях рака желудка [56]. Также известно, что клеточные линии с гиперэкспрессией LMP-2A характеризуются увеличением экспрессии белка сурвивина, что опосредовано активацией сигнального пути NF-kB и приводит к подавлению апоптоза [57]. Аналогично показано, что трансфекция LMP-2A в клетки аденокарциномы желудка приводит к усилению пролиферации и ингибированию апоптоза путем увеличиния экспрессии циклина E [60]. Другой возможной функцией LMP-2A является активация сигнального пути Notch, что приводит к нарушению процесса слияния-деления митохондрий путем увеличения экспрессии белка Drp-1 (dynamin-related protein-1) и гиперэкспрессии маркеров эпителиомезенхимального перехода [61].

В дополнение ко всем перечисленным эффектам LMP-2А также способен индуцировать эпигенетические изменения — усиливает фосфорилирование белка STAT3, который активирует транскрипцию ДНК-метилтрансферазы 1-го типа (DNMT1), а гиперэкспрессия DNMT1 приводит к подавлению экспрессии фосфатазы PTEN путем гиперметилирования CpG-островков на промоторе ее гена. Эпигенетические изменения, в том числе и гиперметилирование, рассматриваются в качестве ключевого механизма EBV-индуцированного канцерогенеза в желудке [14].

BARTs представляют собой мультифункциональные транскрипты, которые обнаружены в ксенографтных моделях назофарингеальной карциномы путем анализа библиотек кДНК. Также BART обнаружены в большом количестве и в других EBV-ассоциированных опухолях. Ряд исследователей сообщают о вовлечении BARF1 (BamHI — A rightward frame 1) в процесс канцерогенеза в желудке, так как этот тип транскриптов экспрессируется практически в 100% случаев EBV-ассоциированной аденокарциномы желудка [62]. Трансфекция BARF1 в клетки рака желудка приводит к значительным нарушениям в профиле экспрессии генов, особенно это касается генов, контролирующих процессы пролиферации и апоптоза [58, 63].

EBV-ассоциированная аденокарцинома желудка является подтипом рака желудка c характерными клинико-патолого-анатомическими и молекулярными особенностями. Относительная генетическая стабильность опухолевых клеток обусловливает преимущественно высокую степень дифференцировки и хороший прогноз выживаемости.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflicts of interest.

Сведения об авторах

Данилова Н.В. — e-mail: ndanilova@mc.msu.ru; https://orcid.org/0000-0001-7848-6707

Мальков П.Г. — e-mail: pmalkov@mc.msu.ru; https://orcid.org/0000-0001-5074-3513

Олейникова Н.А. — e-mail: noleynikova@mc.msu.ru; https://orcid.org/0000-0001-8564-8874

Михайлов И.А. — e-mail: imihailov@mc.msu.ru; https://orcid.org/0000-0001-8020-369X