Результаты и обсуждение

Согласно рекомендациям ASCO/CAP, оценка результатов FISH-исследования проводится в комбинации с данными ИГХ и базируется на основании подсчета количества копий гена HER2/neu и соотношения HER2/CEP17 в 20/40 ядрах опухолевых клеток. Амплификация считается подтвержденной при значениях HER2/CEP17 ≥2 и числе копий гена HER2/neu ≥4. При этом речь идет о средних значениях. Интересны не только эти показатели, но и количество копий HER2/neu, а также соотношение HER2/CEP17 в каждом учтенном ядре каждой опухоли. На основании этих цифр на материале, полученном от 25 пациентов (500 значений каждого показателя), были построены диаграммы рассеяния (рис. 1, 3),

графики значений медиан и 95% ДИ (рис. 2, 4).

На диаграмме рассеяния количества копий гена HER2/neu очевидны не только значительная вариабельность этого показателя в каждой конкретной опухоли, но и отличия опухолей друг от друга (см. рис. 1). Лишь в опухолях нескольких пациентов расположение точек (каждая точка соответствует подсчитанному значению HER2/neu в одном опухолевом ядре) на диаграмме достаточно компактное. То же самое наблюдается в отношении HER2/CEP17 (см. рис. 3). На графиках значений медиан и 95% ДИ (см. рис. 2, 4) точками обозначены медианные показатели HER2/neu и HER2/CEP17, а «усы» обозначают границы 95% ДИ и почти всегда асимметричны, что указывает на отклонение распределения признаков от нормального. Ширина 95% ДИ (размах «усов») свидетельствует о большой вариативности показателей. Существенные отличия количества копий гена HER2/neu между опухолевыми клетками, находящимися в непосредственной близости друг от друга, отмечены многими исследователями [8, 12, 13]. Наиболее вероятное объяснение такой неоднородности амплификации HER2/neu — повторяющиеся BFB-циклы (Breakage-Fusion-Bridge), лежащие в основе механизма амплификации генов. Каждый BFB-цикл начинается с двухцепочечного разрыва ДНК с последующим образованием нестабильной дицентрической хромосомы, в которой во время анафазы митоза происходит следующий двухцепочечный разрыв [14]. Поскольку количество таких разрывов, как и самих BFB-циклов, в каждой клетке абсолютно случайно, это приводит к вариабельности амплификации, визуально определяющейся методом FISH.

На графиках обращает на себя внимание не только тот факт, что 95% ДИ демонстрируют широкую вариабельность показателей, но и то, что в ряде случаев 95% ДИ вообще не перекрываются друг с другом. Это может указывать на статистически значимые различия между группами. Действительно, при сравнении медианных значений 25 групп между собой с помощью критерия Краскела—Уоллиса установлены достоверные различия как между количеством копий HER2/neu, так и соотношением HER2/CEP17 у разных пациентов (Н₍₂₄₎=232,4; р<0,001 и Н₍₂₄₎=267,2; р<0,001 соответственно). Апостериорные попарные сравнения не проводили ввиду того, что количество тестируемых гипотез 300, а при таком их числе существует большая вероятность случайно обнаружить ложную статистическую взаимосвязь.

Однако подсчет соотношения HER2/CEP17 в каждой учтенной опухолевой клетке каждого образца и соотнесение его с количеством копий HER2/neu позволили обнаружить, что в 7 случаях из 25 в образце опухоли присутствуют клетки с соотношением HER2/CEP17 <2 и количеством копий гена HER2/neu 4 ≤ HER2/neu <6. Рекомендации ASCO/CAP в редакции 2018 г. относят такие опухоли (с некоторыми допущениями, как пересмотр результатов ИГХ и трактовка на основе данных ИГХ- и FISH-метода в совокупности, повторный подсчет FISH-сигналов) к HER2/neu-негативным [4]. Поэтому, если в опухоли обнаруживали клетки с соотношением HER2/CEP17 <2 и количеством копий гена 4 ≤ HER2/neu <6, подсчет проводили повторно. Если результат не менялся, интерпретировали его как отсутствие амплификации гена HER2/neu. Опухолевые клетки без амплификации были единичными — их количество в наших образцах составляло от 5 до 15%.

Поделив анализируемую выборку на две группы — имеющих и не имеющих опухолевые клетки без амплификации, обнаружили статистически значимые их различия: критерий Манна—Уитни U_{(7, 18)}=20; р=0,0076. В группе с гетерогенной амплификацией значения HER2/CEP17 были ниже, чем в группе, в которой все учтенные клетки характеризовались наличием амплификации HER2/neu: 2,37 (95% ДИ 2,06—3,43) и 3,93 (95% ДИ 3,39—4,55). Данные группы отличались и по количеству копий гена HER2/neu на ядро: критерий Манна—Уитни U_{(7, 18)} = 24; р=0,0166. Количество копий гена HER2/neu в группе опухолей с гетерогенной амплификацией составило 6,25 (95% ДИ 4,3—12,45), в группе без таковой — 10,65 (95% ДИ 6,95—12,10).

Зависимость наличия в опухоли клеток без амплификации от показателей среднего значения HER2/CEP17 можно оценить с помощью модели бинарной логистической регрессии. Для наших образцов эта модель описывалась уравнением: y = 1 / (1 + e^{–(3,2—1,3x})), где у — вероятность наличия в HER2-положительной опухоли клеток без амплификации, х — среднее значение отношения HER2/CEP17 в 20 клетках этой опухоли. Данная зависимость статистически значима: критерий отношения правдоподобия G₍₁₎ = 3,8942; р=0,00485.

Пороговое значение HER2/CEP17, при котором в опухоли c положительным HER2/neu-статусом обнаруживаются клетки без амплификации (не важно, в каком количестве), составляет 2,5. Так как во всех проанализированных РМЖ отношение HER2/CEP17 ≥2, а количество копий гена HER2/neu ≥4 (в большинстве случаев 6 и более), они, бесспорно, относятся к категории HER2/neu-положительных, при этом больным показана наиболее эффективная для них таргетная терапия. Однако является ли феномен неоднородности амплификации клинически незначимым?

Применение таргетной терапии при РМЖ — один из великолепных примеров успеха персонализированной медицины и огромный прорыв в онкологии. Использование таргетных препаратов существенно ограничено первичной или приобретенной резистентностью, в основе которой лежит множество факторов, в том числе и генетическая гетерогенность опухоли. Существование генетической гетерогенности — пространственной и временно́й — отличительная черта РМЖ, что отмечается во многих исследованиях [9, 15, 16]. Вероятно, появление нескольких субклонов в пределах одной опухоли является одним из способов изменения ее злокачественного потенциала [17]. В нескольких ретроспективных исследованиях показано, что гетерогенные РМЖ ассоциированы с плохим прогнозом [18, 19]. Авторы объясняют прогрессию заболевания существованием резистентных к терапии субклонов опухоли, получающих конкурентное преимущество на фоне проводимого лечения. Поэтому определение и характеристика таких клонов имеют не только научный интерес, но и непосредственное отношение к прогнозу течения и выбору тактики лечения заболевания.

Определение мутационного статуса различных субклонов опухолей, которое стало возможным благодаря появлению методов полногеномной амплификации и секвенирования нового поколения, убедительно продемонстрировало существование в каждом из них совершенно особых генетических аберраций. Так, клетки без амплификации HER2/neu могут отличаться наличием амплификации других генов — BRF2(8p11-p12) и DSN1(20q13), а также соматическими мутациями HER2/neu [7]. Мутации PIK3CA в HER2/neu-положительных РМЖ с гетерогенной экспрессией HER2/neu также встречаются в тех клетках, где амплификации HER2/neu не наблюдается [20]. Клиническое значение обнаружения этих генетических аберраций пока неясно, но то, что различия между опухолями с разной долей HER2/neu-отрицательных опухолевых клеток в основной популяции с амплификацией HER2/neu существуют, продемонстрировано в нескольких работах. Так, например, показано, что РМЖ с высокой вариабельностью количества копий гена HER2/neu и присутствием клеток без амплификации на фоне доминантной HER2/neu-положительной опухоли имеют более высокий риск прогрессии и развития отдаленных метастазов по сравнению с гомогенными по амплификации HER2/neu-положительными опухолями, а также опухолями с отрицательным HER2/neu-статусом [21]. Эти РМЖ, по-видимому, очень близки описанным M. Ballard и соавт. [22] опухолям с «неклассическими» результатами FISH. Авторы отнесли к ним среди прочих РМЖ с низкой амплификацией, а именно те опухоли, которые при соотношении HER2/CEP17 ≥2 имеют среднее количество копий гена HER2 на ядро от 4 до 6. Проанализировав данные 8000 пациентов, исследователи обнаружили, что время до прогрессирования таких опухолей статистически значимо меньше, чем опухолей с «классической» амплификацией.

Следует отметить, что градации низкой амплификации отличаются в разных исследованиях. Например, в работе А. Borley и соавт. [23] это опухоли с количеством копий гена HER2/neu на клетку от 6 до 12. Авторы отмечают, что они резистентны к таргетной терапии в адъювантном режиме и имеют плохой прогноз по сравнению с РМЖ с более высоким количеством копий HER2/neu. Анализируемая выборка при соотношении HER2/CEP17 ≥2 содержит 6,25 (95% ДИ 4,3—12,45) копии гена HER2/neu на ядро, т. е. соответствует описанным в исследовании [23] опухолям с низкой амплификацией. Хотя причины неэффективности терапии авторами в этой работе не обсуждаются, считаем, что гетерогенность амплификации HER2/neu может играть здесь определенную роль. Амплификация HER2/neu, вероятно, вносит значительный вклад в появление опухолевых клонов de novo, генетическое и клональное разнообразие РМЖ. Таргетная анти-HER2/neu-терапия, действуя на чувствительные к ней HER2/neu-позитивные клетки, может способствовать селективному отбору минорных субклонов с отрицательным HER2/neu-статусом и прогрессии заболевания. В случаях, которые ранее интерпретировались как неопределенные в отношении амплификации HER2/neu (согласно рекомендациям ASCO/CAP, 2013), гетерогенность амплификации, возможно, выражена гораздо сильнее, чем в опухолях с положительным HER2/neu-статусом.