Ответ организма-хозяина на развивающуюся опухоль предполагает сложные взаимодействия эпителиальных опухолевых клеток с клетками организма, которые обозначаются как десмопластическая реакция, или опухолевая трансформация стромы. Иммунные клетки, капилляры, базальная мембрана, активированные фибробласты и внеклеточный матрикс, окружающие опухолевые клетки, представляют собой опухолевую строму, или опухолевое микроокружение (tumor microenvironment, TME) [1]. Как стало понятно в последнее время, прогрессия опухоли и метастазирование контролируются TME и не зависят исключительно от автономных генетических дефектов опухолевых клеток [2]. Одним из ключевых компонентов опухолевой стромы являются опухолеассоциированные фибробласты (cancer-associated fibroblasts, CAF) — неэпителиальные неиммунные клетки с мезенхимными свойствами, расположенные в строме опухоли или по ее краю [3]. В сравнении с нормальными активированными фиб-робластами CAF характеризуются повышенным синтезом факторов роста и хемокинов, обладают большей пролиферативной активностью, способностью к передвижению. По некоторым данным [1], CAF также могут включать ассоциированные с опухолью мезенхимальные стволовые клетки (cancer-associated mesenchymal stem cells, MSC). CAF являются одним из ключевых компонентов опухолевой прогрессии и обеспечивают широкий спектр фиброзных изменений в строме в большинстве известных опухолей. В частности, CAF продуцируют белки, разрушающие внеклеточный матрикс (матриксные металлопротеиназы — MMP), обеспечивая миграцию опухолевых клеток. CAF описаны для большого количества опухолей, в том числе для колоректального рака [3].

Общепризнанным маркером активированных фибробластов, в частности CAF, является гладкомышечный альфа-актин (αSMA), который также экспрессируется в гладкомышечных клетках и нормальных перикриптальных фибробластах [4]. Другими маркерами CAF считаются белок активации фибробластов (FAP), рецепторы тромбоцитарного фактора роста (PDGFRα) и PDGFRβ), подопланин (POD)[5]. Все обозначенные маркеры не являются специфичными для CAF. Так, FAP также экспрессируется воспалительными клетками, PDGFR выявляются на перицитах [1, 6], POD — в лимфатических сосудах. Некоторые маркеры, используемые для оценки CAF, также характерны для нормальных активированных (не покоящихся) перикриптальных фибробластов.

Опухоли иногда представляют как «раны, которые не заживают», так как длительное накопление опухолевых клеток в любой ткани инициирует хроническую репаративную реакцию. Роль миофибробластов в заживлении ран достаточно исследована и понятна, но их функциональная роль в прогрессировании рака и метастазировании сложна и противоречива. Некоторые исследования свидетельствуют о том, что CAF могут не только способствовать прогрессии опухоли, но и сдерживать ее развитие [7, 8]. Выявление специфичных маркеров CAF, оценка их роли в канцерогенезе и разработка таргетных препаратов — важные этапы в развитии диагностики и лечении колоректального рака.

Материал и методы

В исследование включен 21 случай аденокарциномы толстой кишки без метастазов. Отбирали блоки из центральной (некраевой) части опухоли. Для идентификации CAF использовали моноклональные антитела к POD (Abcam, клон EPR22182), FAP (Abcam, клон SP325), PDGFRα (Abcam, клон EPR22059-270), PDGFRβ (Abcam, клон Y92). Использована технология дуплексной метки — на каждом из срезов параллельно проводили две реакции: с одним из исследуемых маркеров CAF и с антителами к гладкомышечному альфа актину (αSMA). Детекцию дуплексной метки осуществляли с помощью набора Double Stain IHC Kit: M&R on human tissue (HRP/Green&AP/Red, Abcam ab210061) по методике, рекомендованной производителем. На всех срезах αSMA окрашивали зеленым цветом, а любой второй исследуемый маркер — красным. Предварительную обработку (депарафинирование, регидратацию и демаскировку антигенов) проводили в PT-Module (Thermo Scientific, Англия) в течение 20 мин (95—98 °С) при pH 8,0. Блокировку эндогенных ферментов проводили последовательно с помощью Hydrogen Peroxide Block (Ultra Vision Quanto Detection System HRPDAB) и 1 мМ раствора левамизола (по 10 мин). Иммуногистохимические реакции осуществляли в полуавтоматическом режиме с использованием автостейнера Autostainer 480S (Thermo Scientific, Англия).

Полученные препараты оценивали с помощью микроскопа Leica DM4000B, камеры Leica DFC495 и специализированной системы продвинутого морфометрического анализа LASX, в которой методом цветоделения проводили выделение и подсчет площади красной и зеленой меток по отдельности. В каждом случае осуществляли оценку при увеличении объектива в 20 раз в трех зонах опухоли: апикальной (ближайшей к просвету органа), центральной и в инвазивном крае. Зона интереса — области с выраженной стромой и максимально выраженными реакциями обоих маркеров (рис. 1). Из подсчета исключали реакцию αSMA в стенках сосудов, мышечной пластинке слизистой оболочки и мышечном слое стенки кишки. Полученные значения площади каждой метки далее по тексту обозначены как «значение маркера», «показатель», «уровень экспрессии».

Рис. 1. Иммуногистохимические реакции с антителами к PDGFRβ (красный) и αSMA (зеленый), дуплексная метка на одном срезе, ×20.

а, б, в — апикальная часть опухоли; г, д, е— инвазивный край опухоли; б, в, д, е — выделение (черный) каждого из цветов методом цветоделения с помощью программного средства LASX с последующим подсчетом площади метки: б — 6,029% PDGFRβ; в — 1,708% αSMA; д — 5,782% PDGFRβ; е— 0,722% αSMA.

Для статистической обработки полученных данных использовали программный пакет Statistica 10 (StatSoft, Inc., США).

Анализ колокализации маркеров проводили в 2-элементных группах, составленных из 5-элементного множества. Число анализируемых пар переменных рассчитывали на основании формулы классической комбинаторики для расчета биномиального коэффициента:

,

.

Всего проанализировано 10 попарных сочетаний маркеров, а с учетом разделения каждого препарата на три зоны (апикальная, центральная части и инвазивный край опухоли) число пар переменных составило 30.

В качестве меры локализации маркеров использовали коэффициент линейной корреляции Пирсона (Pearson).

Значимость различий в уровне экспрессии маркеров устанавливали с помощью параметрических и в ряде случаев — непараметрических методов. Из параметрических методов использовали одно- и многофакторный дисперсионный анализ (ANOVA) и F-тест. Проверку характера распределения проводили на основании критериев Шапиро—Уилка (Shapiro—Wilktest) и Колмогорова—Смирнова. Из непараметрических методов для попарного сравнения применяли критерий Манна—Уитни (Mann—Whitney U-test); для множественного сравнения — критерий Краскала—Уоллиса (Kruskal—Wallistest).

Результаты и обсуждение

Настоящая работа не была нацелена на выявление потенциальных прогностических характеристик субпопуляций CAF, ввиду чего подбиралась максимально однородная выборка: в исследование включены аденокарциномы G1-G2 без регионарных и отдаленных метастазов, лимфоваскулярной и сосудистой инвазии, преимущественно без периневральной инвазии и неодъювантного лечения на дооперационном этапе. Тем не менее выявлены существенные различия в уровне экспрессии маркеров в разных зонах опухоли. За исключением αSMA, в интактной слизистой оболочке исследуемые маркеры (POD, FAP, PDGFRα, PDGFRβ) не экспрессировались. Реакция αSMA наблюдалась в мышечной пластинке слизистой оболочки, а также в криптальных фибробластах, формируя окантовку каждой крипты (рис. 2, а).

Рис. 2. Иммуногистохимические реакции, ×20.

а — реакция с антителами к αSMA в интактной слизистой оболочке, вторая метка отсутствует; б — реакция с POD (красный) и αSMA (зеленый) в апикальной части опухоли; в — реакция с POD (красный) и αSMA (зеленый) в грануляционной ткани (внутренний край изъязвления опухоли); г — реакция с FAP (красный) и αSMA (зеленый) в инвазивном крае опухоли.

В ходе многофакторного дисперсионного анализа установлено, что уровень экспрессии маркера αSMA в каждой из трех зон достоверно различался (рис. 3) (уровень значимости p=0,0081), а именно: уровень экспрессии αSMA был значимо выше в инвазивном крае и центральной части по сравнению с апикальной.

Рис. 3. Средние значения αSMA и POD в трех различных зонах со стандартными отклонениями.

При анализе уровня экспрессии маркера POD в каждой из трех зон методом многофакторного дисперсионного анализа достоверных различий не обнаружено (уровень значимости p=0,2018). Однако при применении непараметрического аналога этого метода (критерия Краскала—Уоллиса) установлены значимые различия в уровне экспрессии маркера POD в каждой из трех зон (уровень значимости p=0,0138). При этом по сравнению с αSMA уровень экспрессии POD демонстрирует противоположную тенденцию: в апикальной части (рис. 2, б) он выше, чем в центральной и инвазивном крае. Значения остальных маркеров значимо не отличались в разных зонах опухоли.

Установленные различия в уровне экспрессии каждого маркера в разных зонах свидетельствуют о выраженной гетерогенности. Отсутствие общей закономерности в распределении всех маркеров, описываемых как маркеры CAF, свидетельствует о потенциально разных выявляемых субпопуляциях клеток, с одной стороны, и о невозможности выявить все CAF с помощью одного маркера, — с другой. Несомненно, открытым остается вопрос о принадлежности всех этих маркеров к CAF. Несмотря на то что в исследовании выбирали поля зрения с минимальными «лишними» элементами, а воспалительный инфильтрат, мышечные элементы стенки кишки и сосуды не включали в оцениваемую площадь, полностью исключить все не относящиеся к CAF элементы невозможно. Мы полагаем, что повышенный уровень POD в апикальной части может быть связан с увеличенным количеством молодых сосудов и фибробластов, являющихся основой грануляционной ткани (рис. 2, в) в части опухоли, окружающей язвенный дефект, который наблюдался в 90,5% случаев выборки. Однако вследствие малого объема выборки статистически это предположение не подтвердилось.

Противоположная картина наблюдалась с αSMA, максимальная экспрессия которого выявлялась в инвазивном крае и центральной зоне. Инвазивным краем считалось место непосредственной инвазии в клетчатку (где по последним рекомендациям следует подсчитывать количество «опухолевых почек» (tumor budding) [9]). В этой зоне нет грануляционной ткани, изобилия сосудов, которые могли бы стать причиной ложных высоких показателей, а воспалительный инфильтрат, наблюдаемый в немногочисленных случаях, не экспрессирует αSMA. В связи с этим полученные данные представляются корректными.

При сравнении значений маркеров между собой (рис. 4) обращают внимание более высокие показатели PDGFRβ и αSMA и низкие показатели PDGFRα в центральной и инвазивной зонах. Отмечен высокий уровень экспрессии PDGFRβ во всех зонах большинства наблюдений. Считается, что экспрессия PDGFRβ в строме опухоли толстой кишки может быть ассоциирована с метастатическим потенциалом [10] и низкой дифференцировкой опухоли в плоскоклеточных опухолях пищевода [11].

Рис. 4. Средние значения отношения площади метки к площади поля зрения для каждого маркера в различных зонах аденокарциномы толстой кишки.

Корреляционный анализ с целью поиска связи между экспрессией маркеров (колокализация) в каждой из зон обнаружил сильную обратную связь между уровнем αSMA и FAP в центральной зоне (r=0,79, p=0,034). Этот факт свидетельствует о разном биологическом значении FAP и αSMA в отношении CAF и о том, что эти маркеры могут быть использованы для выявления разных субпопуляций CAF. Известно, что FAP также экспрессируется мезенхимальными стволовыми клетками (MSC) в различных локализациях. Кроме того, FAP выделен методом ПЦР из условно интактной стромы, прилежащей к опухоли (карцинома пищевода, легкого и глиома), в то время как в интактных тканях, расположенных на отдалении от опухоли, FAP не обнаружен [12, 13].

Также выявлены две сильные тенденции прямых взаимосвязей в центральной зоне в парах переменных αSMA/PDGFRα и POD/PDGFRα (p=0,06 и p=0,07 соответственно) и слабая тенденция в паре переменных PDGFRβ/PDGFRα (r=0,62, p=0,054). Есть данные о связи высокого уровня PDGFRα с хорошим прогнозом, а PDGFRβ с плохим во многих солидных опухолях, что некоторые авторы интерпретируют как принадлежность PDGFRα к сдерживающей популяции CAF [14]. Полученные данные не противоречат этой концепции: если принять PDGFRα в качестве хорошего прогностического фактора, то прямые вза-имосвязи с POD и αSMA косвенно свидетельствуют и об их благоприятном прогностическом значении. В рамках этих рассуждений обратная взаимосвязь αSMA/FAP представляет FAP как неблагоприятный прогностический фактор, что сочетается с данными мировой литературы, поскольку есть сведения о связи высокого уровня экспрессии FAP с регионарным метастазированием, низкой общей выживаемостью, высокой степенью злокачественности для карцином различной локализации, в том числе колоректального рака [15]. Таким образом, полученные корреляции и данные о колокализации маркеров кажутся логичными, хотя нельзя исключать определенной погрешности в связи с малой выборкой (n=21).

В ходе анализа изображений помимо площади метки обратили внимание на расположение каждого из пары маркеров относительно опухолевых комплексов. Обнаружено, что в разных случаях внутренний (ближайший к опухолевым комплексам) слой отличался. Так, в одной карциноме (1-й случай) ближайшим оказался зеленый слой (αSMA) по сравнению с POD и PDGFR (рис. 5, a, г). В другой опухоли (2-й случай) ближайшим оказался красный слой (рис. 5, б, д) (POD и PDGFRβ соответственно). Мнение о том, что распределение маркеров зависит от конкретной опухоли, оказалось ложным, так как в рамках каждого из приведенных случаев обнаружена смешанная экспрессия: для ряда маркеров ближайший к эпителиальным комплексам контур был представлен как зеленой, так и красной меткой. Такая ситуация продемонстрирована для пары POD/αSMA в n2 (рис. 5, в) и пары FAP/αSMA в n1 (рис. 5, е). Продемонстрированные различия кажутся чрезвычайно интересными, поскольку, возможно, именно ближайший слой фибробластов оказывает большее влияние на эпителиальные структуры, обусловливая поведение и развитие опухоли. Перспективным может оказаться поиск корреляций между прогностическими клинико-морфологическими характеристиками и внутренним слоем фибробластов.

Рис. 5. Различия в расположении реакции маркеров CAF относительно опухолевых комплексов на примере двух случаев (n1 и n2).

а, б, в — реакция с POD (красный) и αSMA (зеленый); г, д — реакция с PDGFRβ (красный) и αSMA(зеленый); е — реакция с FAP (красный) и αSMA (зеленый), ×40.

Настоящая работа основана на сравнении исследуемых маркеров с αSMA как наиболее общепризнанного маркера CAF. Однако наличие αSMA также в сосудах, мышечной ткани и, возможно, в ряде мезенхимальных элементов затрудняет идентификацию именно CAF, в связи с чем оценка внутреннего слоя в сравнении с αSMA может оказаться некорректной. Другой проблемой является гетерогенность распределения даже в пределах одного случая, как в нашем 2-м примере (см. рис. 5, б, в), когда в одной опухоли конкретный маркер (POD) является и внутренним и внешним слоем одновременно в разных полях зрения. И третьей основной проблемой является непосредственная оценка внутреннего слоя (см. рис. 5, е) при смешанной экспрессии, когда часть контура представлена зеленой меткой (αSMA), а часть — красной. Возможно, при рассмотрении бóльшего количества маркеров на одном срезе, распределение окажется еще более мозаичным и сложным.

Заключение

Проведены идентификация и оценка уровня CAF с помощью пяти маркеров: αSMA, FAP, PDGFRα, PDGFRβ и POD. Несмотря на выраженную гетерогенность распределения маркеров в зависимости от зоны опухоли, удалось установить более высокий уровень экспрессии POD в апикальной части и αSMA в инвазивном крае. В большинстве случаев во всех зонах отмечался достоверно не различающийся высокий уровень экспрессии PDGFRβ. Впервые получены статистически значимые данные о колокализации αSMA/FAP, αSMA/PDGFRα и POD/PDGFRα в колоректальном раке, а также отмечены статистически значимые данные о колокализации αSMA/FAP, αSMA/PDGFRα и POD/PDGFRα в колоректальном раке. Выявленные впервые различия в расположении маркеров относительно опухолевых (эпителиальных) комплексов стали возможны благодаря идентификации CAF с помощью технологии дуплексной метки на одном срезе. Полученные данные побуждают к проведению дополнительных исследований CAF и их особенностей на большем объеме материала с целью лучшего понимания молекулярно-биологических характеристик колоректального рака.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — Н.А. Олейникова

Сбор и обработка материала — Н.А. Олейникова, О.А. Харлова

Статистическая обработка данных — И.А. Михайлов

Написание текста — Н.А. Олейникова

Редактирование — Н.В. Данилова, П. Г.Мальков

Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (РФФИ, грант «Перспектива» №19-315-60006) и с использованием оборудования, приобретенного по программе развития МГУ им. М.В. Ломоносова до 2020 г.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflicts of interest.

<