Известно, что в регуляции функционирования кровеносных сосудов большую роль играет периферическая нервная система. Проблема иннервации магистральных кровеносных сосудов привлекает внимание ученых различных специальностей (клиницистов, физиологов, фармакологов и морфологов) из-за высокой актуальности фундаментального и прикладного значения. Строение нервных аппаратов артериальных и венозных сосудов в прошлом веке интенсивно изучалось с помощью классических методов гистологии, гистохимии и электронной микроскопии. Результаты этих исследований представлены в ряде обзорных статей и монографий [1—7]. В этих работах не только обобщены данные о строении и топографии различных компонентов нервного аппарата сердечно-сосудистой системы, но и освещены вопросы их функционального значения. В настоящее время наиболее информативными и удобными в использовании являются методы иммуногистохимии, которые используются не только при экспериментальных исследованиях, но и для разработки способов диагностики. На сегодняшний день в литературе имеется еще недостаточно работ [8—10], посвященных выяснению особенностей иннервации артериальных сосудов человека при атеросклерозе, выполненных с помощью иммуногистохимических маркеров. Особенно интересно изучение особенностей иннервации при формировании нестабильных атеросклеротических бляшек, которые являются причиной абсолютного большинства острых клинических осложнений ишемической болезни сердца у человека. В настоящее время работы, посвященные изучению состояния нервных структур в стенке аорты при образовании нестабильных атеросклеротических бляшек практически отсутствуют. Исследования в этом направлении помогут определить место нарушений автономной иннервации артерий в патогенезе атеросклероза и при его неблагоприятном резко прогрессирующем течении.

Цель настоящего исследования — изучение нервных структур в стенке аорты при атеросклерозе с использованием комплекса иммуногистохимических маркеров (белка PGP 9.5, тирозингидроксилазы и синаптофизина).

Материал и методы

Объектом исследования стал материал 4 аутопсий из архива лаборатории атеросклероза им. Н.Н. Аничкова. Материал получен от мужчин (средний возраст 60±8 лет), умерших от острой сердечно-сосудистой недостаточности. Непременным условием для отбора материала являлось отсутствие тяжелых сопутствующих заболеваний. Исследовали сегменты аорты из дуги, грудного и брюшного отделов, при этом анализу подвергались фрагменты, содержащие только нестабильные атеросклеротические бляшки. Всего было 32 образца ткани. Материал фиксировали в 4% параформальдегиде на 0,1М фосфатном буфере (pH 7,2—7,4). Для верификации типов атеросклеротических поражений и отбора нестабильных бляшек, обладающих признаками прогрессирующего роста, препараты окрашивали красителем Oil Red O и гематоксилином и эозином. При исследовании нервного аппарата сосудистой стенки фрагменты аорты фиксировали в течение 1 сут в растворе цинк-этанол-формальдегида [11] и после обезвоживания заливали в парафин и изготавливали срезы толщиной 10 мкм. После депарафинирования срезов проводили иммуногистохимические реакции для выявления трех нейральных маркеров. Для идентификации катехоламинергических структур симпатической нервной системы использовали ферментный маркер тирозингидроксилазу (ТН), для холинергических — белок PGP 9.5, для терминальных варикозных аксонов применяли синаптофизин (СФ). Для выявления белка PGP 9.5 использовали поликлональные кроличьи антитела (Spring Bioscience, США); для выявления СФ — кроличьи моноклональные антитела (клон SP11) (Spring Bioscience, США); для TH — поликлональные кроличьи антитела (Abcam, Великобритания). В качестве вторичных реагентов использовали реактивы из набора Reveal Polyvalent HRP/DAB Detection System kit (SpringBioscience, США). Отрицательный контроль для иммуногистохимических реакций проводили путем нанесения на срезы вместо первичных антител их разбавителя (Dako, Дания). Часть срезов докрашивали толуидиновым синим по Нисслю. Анализ гистологических препаратов осуществляли с помощью микроскопа Leica DM 750 (Leica, Германия) и цифровой камеры Leica ICC 50 (Leica, Германия).

Результаты

Во всех изученных случаях стенки аорты нервные структуры, располагающиеся в адвентиции вблизи нестабильных атеросклеротических бляшек, имеют тяжелые патологические изменения. Так, с помощью иммуногистохимической реакции на СФ и ТН были обнаружены дегенеративные изменения аксонов нервных сплетений: как расположенного в адвентиции среди отечного вида коллагеновых пучков, так и основного терминального синаптического сплетения, локализующегося на границе адвентиции и средней гладкомышечной оболочки (рис. 1). Изменения проявляются в глыбчатом и зернистом распаде претерминальных и терминальных отделов тяжей безмиелиновых варикозных аксонов этих сплетений.

Рис. 1. Деструктивные изменения в адвентиции аорты.

а — отсутствие vasa vasorum и выраженная мононуклеарно-клеточная инфильтрация участка адвентиции под нестабильной атеросклеротической бляшкой; б — зернистый распад терминальных варикозных аксонов на границе адвентиции (Ад) с гладкомышечной оболочкой (ГМ).

а — окраска гематоксилином и эозином; б — иммуногистохимическая реакция на тирозингидроксилазу, докраска толуидиновым синим по Нисслю. ×400.

Следует отметить, что в изученном материале в большинстве случаев не удалось обнаружить сохраненные или интактные vasa vasorum ни в адвентиции, ни в мышечной оболочках, ни в атеросклеротических бляшках. На месте расположения vasa vasorum выявлены воспалительные инфильтраты из различных клеточных элементов, а также продукты зернистого распада аксонов (рис. 2). Эти факты свидетельствуют о гибели этих важных трофических сосудов в процессе развития атеросклероза.

Рис. 2. Очаговые воспалительные инфильтраты на месте разрушенных vasa vasorum и их периваскулярных нервных структур в адвентиции аорты.

Ад — адвентиция; ГМ — мышечная оболочка.

Иммуногистохимическая реакция на тирозингидроксилазу, докраска толуидиновым синим по Нисслю. ×400.

Нередко в стенке сегментов аорты, полученных из грудного и брюшного отделов, были обнаружены типичные нестабильные атеросклеротические бляшки (рис. 3), а в соединительной ткани и жировой клетчатке адвентициальной оболочки вблизи бляшек выявлены различные нервные аппараты. Один из таких случаев представлял особый интерес. Его особенностью явилось наличие в адвентиции наряду с фрагментами нервного сплетения, состоящего из стволиков и пучков немиелинизированных нервных волокон, интрамурального микроганглия. На рисунке видно, что в ганглии находятся нервные клетки на разных стадиях патологических изменений. С помощью окраски толуидиновым синим по Нисслю (рис. 4, а, б) видно, что часть из них находится в реактивном или дистрофическом состоянии, другие имеют признаки тяжелых изменений: пикнотические клетки, «клетки-тени» с признаками отека, фрагменты распада цитоплазмы и отростков тел клеток. Клеточные структуры с признаками тяжелых дегенеративных изменений оказались иммунонегативными к белку PGP 9.5, специфичному для холинергических парасимпатических нейронов интрамуральных ганглиев вегетативной нервной системы (см. рис. 4, а, б).

Рис. 3. Нестабильная атеросклеротическая бляшка с крупным липидным ядром (1) и истонченной, поврежденной фиброзной покрышкой (2).

Окраска Oil red О и гематоксилином, ×100.

Рис. 4. Микроганглий и нервные стволики нервного сплетения в жировой клетчатке адвентиции аорты вблизи нестабильной атеросклеротической бляшки.

а, б — отсутствие экспрессии белка PGP 9.5 в нейронах с дегенеративными изменениями; в, г — позитивная реакция с антителами к тирозингидроксилазе. СНК — симпатические нейроциты, НКТ — «клетки-тени», ЖК — жировые клетки. Иммуногистохимическая реакция, докраска толуидиновым синим по Нисслю. а, в — ×100, б, г — ×400.

Другая часть нейроцитов с признаками реактивных и дистрофических изменений, имеющих иммуноположительную реакцию на катехоламины (ТН⁺-клетки), — это типичные симпатические нейроциты. Такие клетки имеют мультиполярную форму, пузырьковидное ядро в центре тела, гомогенную структуру цитоплазмы коричневого цвета, реактивно измененные отростки, некоторые из которых образуют «намотки» вокруг перикарионов (см. рис. 4, в, г), сходные с намотками Перрончита (намотки Перрончита — специальный нейрогистологический термин, отражающий реактивный характер изменения нервных волокон в ганглиях).

На препаратах, докрашенных толуидиновым синим по Нисслю, в ганглиях можно видеть небольшие очаговые скопления глиальных клеток. Часть из них вплотную прилежит к дистрофически измененным нейронам, что может свидетельствовать о начале процесса нейронофагии.

Патологические изменения обнаруживаются не только в ганглии, но и в нервных стволиках и пучках, располагающихся как внутри ганглия, так и выходящих из него в окружающие ткани. В стволиках наблюдается очевидная разреженность нервных волокон внутри эндоневрия (рис. 5). Иммуногистохимические реакции и докраска срезов толуидиновым синим подтверждают гибель большинства нервных волокон в эндоневрии и замещение этих участков глиальной тканью. Сравнительный анализ окраски нервных стволиков и пучков с помощью иммуногистохимических методов показал, что наиболее интенсивной дегенерации подвергаются парасимпатические нервные проводники. В то же время ТН-иммуноположительные структуры, включая нейроциты в микроганглии, а также симпатические волокна в стволиках и пучках, даже при наличии в стенке аорты бляшки, сохраняются.

Рис. 5. Патологически измененные нервные стволики в адвентиции аорты.

а — в разреженном эндоневрии стволиков четко выявляются сохранившиеся, гипертрофированного вида измененные симпатические проводники; на месте погибших парасимпатических нервных волокон видны многочисленные тяжи пучков нейролеммоцитов; б — фрагмент денервированного пучка, эндоневрий которого заполнен нейролеммоцитами; стрелками обозначены PGP 9.5-позитивные глыбки — остатки распада парасимпатических нервных волокон. Иммуногистохимическая реакция с антителами к тирозингидроксилазе (а) и белку PGP 9.5 (б), докраска толуидиновым синим по Нисслю, ×400.

Обсуждение

Согласно данным литературы [1, 2, 4—6], стенки крупных магистральных сосудов, таких как аорта, легочная, сонная, коронарные артерии, на всем протяжении в большей или меньшей степени иннервированы и снабжены нервными структурами разной медиаторной природы. Среди них имеются парасимпатические и симпатические нейроны, нервные стволики и пучки миелинизированных и немиелинизированных волокон, сплетения, рецепторные окончания. Перечисленные нервные структуры отличаются разнообразием, плотностью распределения и также топографией в стенке сосуда. Известно, что в области восходящего ствола и дуги аорты, в сонных и коронарных артериях синокаротидной области, кроме нервных сплетений из смешанных стволиков и пучков нервных волокон, находятся рефлексогенные зоны со сложным составом клеточно-волокнистых структур. Среди них микроганглии, параганглии, группы хромаффинных эндокриноцитов, рецепторные образования. В нашем предыдущем исследовании отмечалось, что в зоне формирования нестабильных атеросклеротических бляшек нервные аппараты стенки аорты подвергаются глубоким дистрофическим изменениям по сравнению со стабильными бляшками [9]. Результаты настоящего исследования дополняют ранее полученные данные. Впервые проанализировано состояние нервных клеток и постганглионарных нервных волокон в микроганглиях, обнаруженных в жировой ткани адвентициальной оболочки. С помощью комплекса нейральных маркеров удалось идентифицировать нейроны различной медиаторной природы и отметить их дистрофические и дегенеративные изменения. Оказалось, что в микроганглиях пораженной аорты сохраняются только симпатические нейроны, в то время как парасимпатические дегенерируют.

Известно, что на одну треть своей толщины стенка аорты пронизана vasa vasorum с периваскулярными структурами. Роль vasa vasorum в развитии атеросклеротических заболеваний еще недостаточно изучена и в настоящее время активно исследуется [12—15]. На границе адвентиции со средней гладкомышечной оболочкой периваскулярные нервные аппараты vasa vasorum объединяются с основным терминальным синаптическим сплетением и выполняют важную нейротрофическую функцию [12, 16]. Таким образом, иннервация и трофика крупных артериальных сосудов ограничиваются в основном структурами адвентиции и узкопетлистым терминальным синаптическим сплетением, локализующимся на поверхности гладкомышечной оболочки стенки сосуда. В настоящем исследовании отмечена гибель vasa vasorum и дегенерация основного терминального сплетения гладкомышечной оболочки, которое, как известно, представлено дистантными синапсами варикозных аксонов en passant. Кроме того, подтверждено, что изменения vasa vasorum и нервных аппаратов в стенке аорты сочетаются с выраженной иммуновоспалительной реакцией [9].

Результаты настоящего исследования свидетельствуют о глубоких дистрофических изменениях нервных аппаратов стенки аорты и vasa vasorum в зоне формирования нестабильных атеросклеротических бляшек. Причем эти изменения сочетаются с выраженной иммуновоспалительной реакцией, одновременно развивающейся как в интиме, так и в адвентиции сосуда. Механизмы нарушения автономной иннервации при атеросклерозе требуют дальнейших исследований. Возможно, это позволит разработать более совершенные подходы к диагностике, профилактике и лечению нестабильных атеросклеротических поражений стенки артерий.

Выводы

1. Показано, что в адвентиции стенки аорты в непосредственной близости от нестабильных атеросклеротических бляшек наблюдаются выраженные патологические изменения клеток интрамуральных ганглиев.

2. На границе соединительной ткани адвентиции и поверхностного гладкомышечного слоя средней оболочки выявлены признаки зернистого распада варикозных аксонов основного терминального нейромышечного сплетения.

3. Отмечены дистрофические и дегенеративные признаки в состоянии нейронов и постганглионарных нервных волокон в микроганглиях.

4. Установлено, что в микроганглиях адвентиции к моменту формирования нестабильной атеросклеротической бляшки остаются выжившими только симпатические нейроны, парасимпатические нейроны и их постганглионарные холинергические волокна погибают.

5. В адвентиции обнаружены распад периваскулярных нервных сплетений и гибель vasa vasorum, что свидетельствует не только о нарушении иннервации, но и трофики нижележащих тканей средней (мышечной) и внутренней (интимальной) оболочек.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — Е.И. Чумасов, П.В. Пигаревский

Сбор и обработка материала — Е.С. Петрова, О.Г. Яковлева

Написание текста — Е.И. Чумасов, Е.С. Петрова, Д.Э. Коржевский

Редактирование — Д.Э. Коржевский, П.В. Пигаревский

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.