Реакция организма на стресс в зависимости от триггера часто сопровождается септическим или асептическим воспалением [1]. Постановка диагноза и эффективность коррекции воспаления в значительной степени зависят от идентификации его типа, стадии и механизмов развития. Наряду с биохимическими показателями [2] особую роль в изучении воспаления играют морфологические методы, позволяющие выявить клеточный состав исследуемых тканей, оценить локальные межклеточные взаимодействия и визуализировать нарушения клеточного гомеостаза [3].

В современной морфологии накоплен большой опыт исследования воспаления в тканях сердечно-сосудистой системы [4—6], однако нельзя считать, что широко используемые в клинической практике методы универсальны и достаточны.

Рутинные гистологические методики не дают возможности достоверно идентифицировать клетки [6], применение иммуногистохимического исследования не позволяет достичь высокой детализации изучаемых структур. Кроме того, с помощью иммуногистохимического окрашивания можно достаточно точно типировать определенный вид клеток, однако оценить структуру образца в целом нельзя [7, 8].

С помощью трансмиссионной электронной микроскопии (ТЭМ) можно изучать субклеточные структуры и формировать косвенные заключения о функциональном состоянии клетки. ТЭМ дает возможность оценить межклеточные взаимодействия и даже идентифицировать клетки при применении антител, конъюгированных с наночастицами золота (электронная иммуногистохимия). Однако существенным недостатком этого метода является очень малый размер изучаемой площади образца (около 0,5 мм²). Потеря большей части биологического материала в процессе приготовления ультратонких срезов и технические сложности при пробоподготовке также не способствуют широкому применению этого исследования [9].

Кроме того, общим недостатком рассмотренных методов является необходимость приготовления срезов, что вызывает затруднения при работе с образцами тканей, содержащих очаги минерализации или металлические имплантаты. Дополнительные возможности в этом аспекте демонстрирует ранее представленный нами метод, основанный на использовании сканирующей (растровой) электронной микроскопии (СЭМ) в обратно-рассеянных электронах [10]. Следует отметить, что биологический материал для изучения предлагаемым методом нуждается в предварительной пробоподготовке: заключение в заливочные смолы и приготовление шлифов. Так как в данном методе отражение электронов, формирующих изображение, зависит от атомного веса входящих в состав образца элементов, образцы нуждаются в предварительном окрашивании тетраоксидом осмия и уранилацетатом, а также контрастировании цитратом свинца после полировки поверхности блока.

Изображения, полученные с использованием СЭМ в обратно-рассеянных электронах, имеют визуальное сходство с традиционными электронограммами ТЭМ, но представлены в негативном (инвертированном) контрасте. Сходство изображений обусловлено тем, что для фиксации и окрашивания образцов используются те же красители, что и для ТЭМ, в результате при обоих методах происходит контрастирование одних и тех же структур. Негативный контраст возникает вследствие того, что при СЭМ в обратно-рассеянных электронах светлые участки изображения формируются за счет отраженных от атомов образца электронов, в то время как при ТЭМ светлые участки изображения формируются электронами, прошедшими сквозь срез. Переключение в режим инверсии цвета (например, BSECOMP для микроскопа HitachiS-3400N) позволяет получать изображение, имеющее полное визуальное сходство с полученным при ТЭМ. Важной особенностью рассматриваемого метода является то, что при использовании низковязких смол (Epon, смола Спурра) он позволяет получать качественную структуру образцов, имеющих площадь от 1 см² и более.

В данном исследовании представлены результаты использования СЭМ в обратно-рассеянных электронах для исследования клеточного состава тканей в различных участках сердечно-сосудистой системы.

Цель работы — описание структуры и проведение идентификации иммунокомпетентных клеток в тканях при различных заболеваниях кровеносной системы методом СЭМ в обратно-рассеянных электронах.

Материал и методы

В качестве эталонных объектов исследования выбраны: 1) фрагмент стентированной внутренней сонной артерии, полученный при повторной каротидной эндартерэктомии вследствие рестеноза (мужчина, 57 лет); участок сосуда извлечен у пациента с гемодинамически значимой хронической ишемией головного мозга; 2) фрагмент внутренней сонной артерии с атеросклеротической бляшкой, взятый в момент каротидной эндартерэктомии; участок сосуда извлечен у мужчины 60 лет также с гемодинамически значимой хронической ишемией головного мозга; 3) стент, полученный при тотальной хирургической коррекции тетрады Фалло (девочка, 3 мес); 4) ксеноаортальный биопротез клапана сердца взят из митральной позиции после 2 сут функционирования в ходе реоперации вследствие тромбоза биопротеза (женщина 64 лет); 5) участок средней мозговой артерии с аневризмой, извлеченный в ходе операции (мужчина 38 лет); 6) внутренняя грудная артерия быка, применяемая для артериальной реконструкции (КемАнгиопротез, НеоКор).

Исследование выполнено в соответствии со стандартами надлежащей клинической практики (Good Clinical Practice) и принципами Хельсинкской декларации. Протокол исследования одобрен локальным этическим комитетом НИИ КПССЗ. До включения в исследование от всех пациентов получено письменное информированное согласие.

После извлечения образцы тканей помещали в забуференный (рН 7,4) 10% водный раствор формалина (BioVitrum, Россия), фиксировали в течение 24 ч в формалине (2 смены раствора формалина по 12 ч каждая), затем биоматериал постфиксировали 1% тетраоксидом осмия в 0,1M фосфатном буфере в течение 12 ч, окрашивали 2% тет-раоксидом осмия в бидистиллированной воде в течение 48 ч. Далее образцы обезвоживали в серии спиртов возрастающей концентрации (50, 60, 70, 80 и 95% этанол, все по две смены, каждая смена по 15 мин), окрашивали 2% уранилацетатом (Electron Microscopy Sciences, США) в 95% этаноле (5 ч), обезвоживали 99,7% изопропанолом (BioVitrum, Россия) в течение 5 ч и ацетоном (Реахим, Россия) 1 ч, пропитывали смесью ацетона с эпоксидной смолой Epon (Electron Microscopy Sciences, США) в соотношении 1:1 (6 ч). Потом образцы переносили в свежую порцию эпоксидной смолы (на 24 ч) и далее проводили ее полимеризацию в емкостях FixiForm (Electron Microscopy Sciences, США) при 60 °С. После этого образцы в эпоксидных блоках подвергали шлифовке и полировке на установке TegraPol-11 (Struers, США). Контрастирование цитратом свинца проводили по Рейнольдсу в течение 7 мин путем нанесения раствора на поверхность шлифованного образца с последующей его отмывкой бидистиллированной водой. Далее напыляли на полированную поверхность эпоксидных блоков углерода (толщина покрытия 10—15 нм) с помощью вакуумного напылительного поста (EM ACE200, Leica). Визуализацию структуры образцов при помощи СЭМ в обратно-рассеянных электронах проводили на электронном микроскопе Hitachi-S-3400N (Hitachi, Япония) в режиме BSECOMP при ускоряющем напряжении 10 кВ.

На цифровых микрофотографиях идентифицировали макрофаги, нейтрофилы и тучные клетки, определяли их локализацию и взаимодействие между собой и с другими элементами ткани.

Результаты

При использовании малого увеличения (×50—100) для изучения образцов отмечали хорошую визуализацию структуры объекта. В частности, в стентированной артерии идентифицировались фрагменты стента, окруженные плотной волокнистой соединительной тканью, к которой со стороны просвета сосуда прилегал широкий слой неоинтимы (рис. 1, а). Наблюдали плотную волокнистую соединительную ткань в составе неоинтимы, в которой можно было выделить несколько слоев (рис. 1, б). Слой, примыкающий к просвету сосуда, имел более высокую электронную плотность и состоял из концентрически расположенных волокон и клеток соединительной ткани (см. рис. 1, а). Затем следовал слой, обладающий низкой электронной плотностью и состоящий из диффузно-расположенных клеток со светлой цитоплазмой и ядрами, содержащими ядрышки (см. рис. 1, б). Под ним вблизи элементов стента находился слой, имеющий обильное кровоснабжение, вероятно, вследствие выраженной неоваскуляризации (см. рис. 1, б). Граница контакта плотной соединительной ткани с клетками была хорошо различима и имела неровную поверхность (см. рис. 1, б). Далее в сторону адвентиции следовал слой рыхлой волокнистой соединительной ткани с большим количеством полостей и кровеносных сосудов (см. рис. 1, а).

Рис. 1. Фрагмент стентированной внутренней сонной артерии, полученный в результате повторной каротидной эндартерэктомии вследствие рестеноза (а, б), ксеноаортальный биопротез клапана сердца, извлеченный из митральной позиции после 2 сут функционирования (в), аневризма средней мозговой артерии (г).

В ксеноаортальном биопротезе клапана сердца со сроком эксплуатации 2 сут наблюдали неравномерность электронной плотности: максимальную отмечали в середине образца, в остальных участках электронная плотность варьировала в широких пределах (рис. 1, в).

При среднем увеличении (×500 раз) во фрагменте стентированной внутренней сонной артерии и средней мозговой артерии с аневризмой отмечали значительное улучшение детализации структуры объекта (рис. 1, б, г): были хорошо различимы ядра клеток, их форма, расположение хроматина, границы клеток, структура межклеточного матрикса. При этом увеличении в аневризме средней мозговой артерии выявлено большое количество разнообразных клеток соединительной ткани (см. рис. 1, г). Внутри адвентиции артерии регистрировали большое количество кровеносных сосудов малого диаметра и типичного строения (см. рис. 1, г). Повышение увеличения позволяло детализировать внутриклеточные структуры, благодаря чему можно было достоверно идентифицировать различные типы клеток (рис. 2). Среди них определялись макрофаги, нейтрофилы и тучные клетки (см. рис. 2).

Рис. 2. Макрофаги в составе удаленного стента выводного отдела правого желудочка при тотальной коррекции тетрады Фалло (а, б), макрофаги в составе атеросклеротической бляшки сонной артерии (в), вакуолизированные макрофаги в составе рестенозирующей неоинтимы атеросклеротической бляшки сонной артерии (г), макрофаги с большим количеством лизосом в составе рестенозирующей неоинтимы атеросклеротической бляшки сонной артерии (д).

В образце стентированного сосуда выводного отдела левого желудочка у ребенка с тетрадой Фалло выявлен участок воспаления с преобладанием в инфильтрате макрофагов (см. рис. 2, а, б). Макрофаги имели типичное строение: в их цитоплазме отмечали присутствие большого количества фагосом и лизосом. Поверхность клеток имела многочисленные складки, ядра были неправильной формы (см. рис. 2, а, б). Макрофаги располагались на поверхности, обращенной в просвет сосуда, и образовывали один несплошной слой. Кроме того, большое количество макрофагов находилось в глубоких слоях образца (см. рис. 2, а, б). Вокруг макрофагов наблюдали обширные участки деструкции ткани (см. рис. 2, а, б).

В составе атеросклеротических бляшек структура макрофагов была аналогична наблюдавшейся у мононукле-арных фагоцитов в составе стентированного сосуда (см. рис. 2, в). Они образовывали небольшие клеточные скопления, состоящие из клеток с различным соотношением содержания фагосом и лизосом (см. рис. 2, в). Вблизи скопления макрофагов также выявляли очаги деструкции тканей (см. рис. 2, в). В атеросклеротических бляшках внутренней сонной артерии отмечали наличие двух морфологически различных видов макрофагов c преобладанием в цитоплазме светлых липидных включений (см. рис. 2, г) и осмиофильных лизосом (см. рис. 2, д). Весьма характерно, что представленные макрофаги всегда образовывали скопления только с морфологически сходными клетками и никогда не формировали смешанных скоплений (см. рис. 2, г, д).

Макрофаги с преобладанием светлых везикул всегда располагались в виде скоплений. Клетки имели округ-лую форму, большая часть цитоплазмы была заполнена округлыми везикулами различного размера (см. рис. 2, г). По периферии клеток присутствовал слой цитоплазмы, не содержащей везикул (см. рис. 2, г). В отдельных клетках количество везикул было относительно небольшим (в таком варианте цитоплазма имела более высокую электронную плотность) (см. рис. 2, г). Часто внутри скопления клеток этого вида наблюдали наличие внеклеточного материала с высокой электронной плотностью (см. рис. 2, г).

В участках, содержащих макрофаги с большим количеством лизосом, внутри скопления между клетками отсутствовали плотные межклеточные контакты (см. рис. 2, д). Лизосомы были многочисленны, обладали высокой осмиофильностью и равномерно заполняли весь объем цитоплазмы (см. рис. 2, д). Количество прозрачных везикул было значительно ниже, чем лизосом, и они диффузно располагались в цитоплазме (см. рис. 2, д). Для ядер этих клеток характерно отсутствие плотных скоплений хроматина (см. рис. 2, д).

В образцах с аневризмой средней мозговой артерии также находили большое количество макрофагов, которые локализовались вблизи vasa vasorum. Среди этих макрофагов можно было условно выделить макрофаги с преобладанием лизосом и везикул, но в отличие от ранее рассмотренного материала они не образовывали плотных клеточных скоплений. Расположение клеток было диффузным и макрофаги обоих представленных выше видов могли соседствовать друг с другом.

Среди изученных образцов наибольшее количество нейтрофилов наблюдали в составе ксеноаортального биопротеза клапана сердца (рис. 3, а—г).

Рис. 3. Нейтрофилы в створке ксеноаортального биопротеза клапана сердца (а, б, в, г) и аневризмы средней мозговой артерии (д).

Нейтрофилы локализовались вблизи поверхности створок, проникая в них на глубину, составляющую четверть толщины створки (см. рис. 3, а—г). Следует отметить явно выраженную фрагментацию волокон межклеточного матрикса в составе створок биопротеза (см. рис. 3, а—г). Максимальную фрагментацию наблюдали на периферии створки, ближе к центральной ее области сохранность внеклеточного материала была выше (см. рис. 3, а—г). Вблизи нейтрофилов отмечали выраженные очаги полной деструкции волокон межклеточного матрикса (см. рис. 3, а—г). В составе ядер нейтрофилов определялось от одного до пяти сегментов (см. рис. 3, а—г). При большом увеличении (×5000 раз) хорошо выявлялись типичные для этого вида гранулоцитов гранулы: небольшое количество крупных первичных и большое количество мелких вторичных (см. рис. 3, г). В образце сосуда с аневризмой нейтрофилы наблюдали вблизи кровеносных сосудов адвентиции в областях, где присутствовали макрофаги (рис. 3, д).

Тучные клетки обнаруживали в составе внутренней грудной артерии быка, а также во фрагменте стентированной внутренней сонной артерии, аневризме мозговой артерии (рис. 4, а—д). Во внутренней грудной артерии быка тучные клетки не контактировали друг с другом и располагались рядами (см. рис. 4, а, б). Эти клетки имели большое количество полиморфных по содержимому и размерам гранул (см. рис. 4, а, б). В сосуде со стентом тучные клетки образовывали небольшие группы (см. рис. 4, в, г). В области аневризмы мозговой артерии тучные клетки наблюдали вблизи сосудов адвентиции в виде отдельных клеток, находящихся в участках, содержащих другие иммунокомпетентные клетки (см. рис. 4, д). Особенностью этих клеток было расположение гранул преимущественно на одном из полюсов клетки, вследствие чего ядра локализовались эксцентрично (см. рис. 4, д).

Рис. 4. Тучные клетки во внутренней грудной артерии быка (а, б), атеросклеротической бляшке сонной артерии (в, г) и аневризме средней мозговой артерии (д).

Обсуждение

Из-за большой гетерогенности тканей в составе сердечно-сосудистой системы и причин возникновения воспаления в них клиническое течение заболеваний кровеносной системы очень разнообразно. Идентифицированные в данном исследовании иммунокомпетентные клетки являются объективным критерием воспаления. Макрофаги тесно связаны с процессами деструкции и последующей регенерации тканей [12, 13], соотношение количества нейтрофилов и лимфоцитов является признанным критерием характеристики воспаления [14, 15], в то время как тучные клетки обладают регуляторной функцией и локально координируют деятельность всех клеток в зоне воспаления [16, 17].

После стентирования сосудов стент по истечении определенного времени покрывается слоем неоинтимы [18]. В изученном образце стентированной сонной артерии эндотелиальный слой отсутствовал и наблюдалась деструкция стенки сосуда при участии макрофагов, которые локализовались поверхностно и не проникали вглубь плотной волокнистой соединительной ткани внутреннего слоя неоинтимы. Причина развития этого процесса неизвестна, но можно предположить гидродинамическое повреждение сосудистой стенки током крови. Признаков инфекционного процесса (инфекционных агентов, сегментоядерных лейкоцитов и др.) в данном образце не выявлено. В образце атеросклеротической бляшки отмечали наличие макрофагов, которые по морфологическим признакам являются пенистыми клетками. При этом среди макрофагов наблюдали два морфологически различных фенотипа — с преобладанием везикул или лизосом.

Наибольшее количество нейтрофилов отмечено в створках биопротезов клапана сердца. Помимо нейтрофилов в образце присутствовали отдельные макрофаги. Нейтрофилы локализованы вблизи разрушенных волокон межклеточного матрикса, что служит доказательством их участия в деструкции ксеноматериала биопротеза клапана. Обширные области деструкции ткани через 2 сут после имплантации биопротеза свидетельствуют о высокой активности нейтрофилов. Кроме того, наличие в составе створок биопротеза нейтрофилов различной степени зрелости свидетельствует об их усиленной мобилизации для участия в процессе деструкции. Возможной причиной столь стремительной деструкции материала биопротеза может являться системное воспаление в предоперационном периоде [19]. Лаброциты, обнаруженные в стенке при аневризме мозговой артерии, находились вблизи мелких сосудов стенки артерии совместно с макрофагами, что может указывать на активные деструктивные процессы, происходящие в изучаемом участке.

В отношении тучных клеток в составе внутренней грудной артерии быка можно предположить, что они были иммобилизованы во время технологического процесса ее химической обработки для дальнейшего применения для артериальной реконструкции. В таком виде эти клетки не способны к дегрануляции и активному выделению вазоактивных веществ в межклеточное пространство. Вероятно, иная ситуация характерна для тучных клеток, находящихся в составе стентированного сосуда и с атеросклеротическими бляшками. Локализация этих клеток вблизи мелких сосудов адвентиции позволяет предположить, что тучные клетки оказывают вазоактивное действие.

Отметим, что представленный метод пробоподготовки и микроскопии тканей является новым и интерпретация данных основана на визуальном анализе цифровых фотографий или наблюдении изображения при работе с электронным микроскопом. Необходимо дальнейшее исследование традиционных объектов с использованием разработанного метода и накопление данных о структуре клеток и межклеточного вещества. Для увеличения надежности идентификации структур необходимо сочетать предлагаемый метод с иными современными видами электронной микроскопии.

Заключение

Оригинальный метод длительной постфиксации и окрашивания тетраоксидом осмия с последующим окрашиванием уранилацетатом в процессе обезвоживания, заливкой ткани в эпоксидную смолу, дальнейшей шлифовкой и полировкой образца, контрастированием цитратом свинца и сканирующей электронной микроскопией в обратно-рассеянных электронах позволяет достоверно идентифицировать иммунокомпетентные клетки в тканях системы кровообращения.

Работа выполнена при поддержке комплексной программы фундаментальных научных исследований СО РАН в рамках фундаментальной темы НИИ КПССЗ №0546-2015-0011 «Патогенетическое обоснование разработки имплантатов для сердечно-сосудистой хирургии на основе биосовместимых материалов с реализацией пациент-ориентированного подхода с использованием математического моделирования, тканевой инженерии и геномных предикторов».

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — Р.А. Мухамадияров, А.Г. Кутихин

Сбор и обработка материала — Р.А. Мухамадияров, И.В. Мильто, А.Г. Кутихин

Статистическая обработка — А.Г. Кутихин

Написание текста — Р.А. Мухамадияров, И.В. Мильто, А.Г. Кутихин

Редактирование — Р.А. Мухамадияров, И.В. Мильто, А.Г. Кутихин

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflicts of interest.

<