Формирование опухолевых почкований (tumor budding) — наличие единичных опухолевых клеток или кластеров не более чем из 4 клеток в инвазивном крае — впервые заявлено как независимый прогностический фактор для ранних раков в 2016 г. и включено в обязательные характеристики опухоли толстой кишки в руководстве ВОЗ в 2019 г. [1]. Наличие опухолевых почкований в инвазивном крае ассоциировано с потерей межклеточных контактов опухолевыми клетками и повышением их подвижности, что отражает эпителиально-мезенхимальный переход, играющий важную и необходимую роль в инвазии и метастазировании опухоли [2]. В последнее время все больше исследователей склоняются к концепции значимости микроокружения опухоли для ее роста и прогрессии. Считается, что именно ремоделирование матрикса опухоли приводит к приобретению эпителиальными клетками «бессмертности» и изменению гено- и фенотипа, а не наоборот [3]. Одними из составляющих опухолевого микроокружения являются опухоль-ассоциированные фибробласты (CAF), для детекции которых описаны многие маркеры, в том числе подопланин (POD) [4].

Цель настоящей работы — оценка связей между формированием опухолевых почкований, отражающих инвазивный потенциал опухоли и являющихся неблагоприятным прогностическим фактором, и опухолеассоциированными фибробластами вокруг опухолевых почкований, экспрессирующими POD.

Материал и методы

На материале 43 случаев аденокарциномы толстой кишки проведено синхронное иммуногистохимическое исследование с антителами к подопланину (POD, Abcam, клон EPR22182) для выявления CAF и панцитокератину (PCK, Dako, кроличьи поликлональные) для достоверного контрастирования опухолевых почкований. Детекцию дуплексной метки осуществляли с помощью набора Double Stain IHC Kit: M&R on human tissue (HRP/DAB&AP/Red, Abcam ab210059) по методике, рекомендованной производителем. Оценку уровня экспрессии POD выполняли как количественным методом (путем цветоделения и подсчета площади метки в программе LAS X), так и полуколичественным методом (выраженная, умеренная, слабая или отрицательная реакция). Экспрессию POD оценивали непосредственно вокруг опухолевых почкований («горячая точка» по рекомендации [5]) и в инвазивном крае без опухолевых почкований (как для случаев, где опухолевых почкований обнаружено не было, так и для тех, где они были в другом поле зрения).

Внимание обращалось на веретеновидные клетки, расположенные в инвазивном крае опухоли (в том числе вокруг опухолевых почкований), которые потенциально могут являться CAF. Оценке подлежали не все веретеновидные клетки, к которым могут принадлежать и покоящиеся фибробласты, и активированные, и опухолеассоциированные, а лишь те фибробласты, которые экспрессировали POD, поскольку POD описан как маркер CAF. Учитывая гетерогенность CAF и большое количество маркеров, которые описаны для них, нельзя исключить потенциального сосуществования других, отрицательных к POD субпопуляций CAF в инвазивном крае (и вокруг опухолевых почкований) в каждом конкретном случае. Их оценка не входила в задачи настоящего исследования. Экспрессия POD, в норме наблюдаемая в эндотелии лимфатических сосудов, в настоящем исследовании не учитывалась.

Статистическую обработку данных проводили с использованием программного пакета Statistica 10 («StatSoft, Inc.», США). Для статистической обработки результатов использовались критерий Шапиро—Уилка для проверки гипотез о нормальном распределении полученных данных. Для установления значимости различий между группами по качественным признакам использовали анализ на основе таблиц сопряженности и критерий χ² Пирсона, между несколькими группами по количественным признакам — критерий Краскела—Уоллиса с последующим применением критерия Манна—Уитни для апостериорного попарного сравнения.

Результаты

В ходе исследования проведено сопоставление следующих показателей: выраженности реакции POD в CAF инвазивного края опухоли и (отдельно) вокруг опухолевых почкований — с наличием муцинозного компонента в опухоли; экспрессии POD в инвазивном крае с выраженностью реакции вокруг почкований; наличия опухолевых почкований с клинико-морфологическими характеристиками опухолей.

Экспрессия POD в CAF и наличие муцинозного компонента

Среди 43 случаев аденокарцином, включенных в работу, 11 в своем составе имели муцинозный компонент разной степени выраженности. Распределение уровня экспрессии POD в инвазивном крае с учетом наличия муцинозного компонента представлено в рис. 1. Почти в ¹/₂ случаев реакция POD оказалась отрицательной в обеих группах (рис. 2, б).

Рис. 1. Выраженность экспрессии POD в CAF в инвазивном крае в зависимости от наличия муцинозного компонента.

Рис. 2. Экспрессия POD в CAF в инвазивном крае. Иммуногистохимическое исследование с антителами к PCK (коричневый) и POD (красный), ×20.

а — опухолевые почкования вблизи инвазивного края, в окружающей строме реакция POD отрицательная; б — опухолевые почкования в инвазивном крае отсутствуют, в окружающей строме реакция POD отрицательная; в — опухолевые почкования в инвазивном крае, в окружающей строме реакция POD слабая; г — опухолевые почкования в инвазивном крае, в окружающей строме реакция POD выраженная.

Опухолевые почкования были обнаружены в 53,5% случаев (рис. 2, а). Экспрессия POD вокруг них также отличалась выраженностью (рис. 3).

Рис. 3. Выраженность экспрессии POD в CAF вокруг опухолевых почкований в зависимости от наличия муцинозного компонента.

Достоверных различий в выраженности экспрессии POD в зависимости от наличия муцинозного компонента в опухоли методом χ² выявить не удалось (p=0,678) ни для инвазивного края, ни для отдельно взятых опухолевых почкований. Однако в ходе работы было отмечено, что в большинстве аденокарцином с муцинозным компонентом наблюдалась выраженная экспрессия POD (рис. 4) непосредственно вокруг муцинозных комплексов и «озер слизи». Ввиду малочисленности выборки статистически эту закономерность подтвердить не удалось (p=0,181), однако полученное значение свидетельствует о возможно имеющейся статистической тенденции, и закономерность может быть подтверждена на большей выборке.

Рис. 4. Выраженность экспрессии POD в CAF в муцинозных аденокарциномах толстой кишки.

Иммуногистохимическое исследование с антителами к PCK (коричневый) и POD (красный), ×20; а, б — выраженная экспрессия POD вблизи скопления муцина.

Исследований, посвященных изучению POD в строме муцинозных аденокарцином, найти не удалось. Однако в работе S. Oe и соавт. [6] показана более высокая частота экспрессии POD в светлоклеточных аденокарциномах яичника по сравнению с другими гистологическими типами, что подтверждает потенциальный тропизм POD к опухолям, содержащим в составе полисахариды.

Сравнение экспрессии POD в CAF в разных зонах инвазивного края

При сопоставлении уровня экспрессии POD вокруг опухолевых почкований и в инвазивном крае в отсутствие почкований методом χ² были установлены значимые различия между группами (p<0,01). При апостериорной попарной проверке значимости различий были выявлены следующие факты (рис. 5):

Рис. 5. Сопоставление уровня экспрессии POD вокруг опухолевых почкований с уровнем экспрессии POD в инвазивном крае.

— реакция вокруг почкований (выраженная против умеренной) значимо различалась в группах опухолей с выраженной и умеренной реакцией в инвазивном крае (p=0,012);

— реакция вокруг почкований (умеренная против слабой) значимо различалась в группах опухолей с умеренной и слабой реакцией в инвазивном крае (p=0,017);

— реакция вокруг почкований (умеренная против отрицательной) значимо различалась в группах опухолей с умеренной и отрицательной реакцией в инвазивном крае (p=0,031).

Полученные различия свидетельствуют об отсутствии необходимости оценивать экспрессию POD именно вокруг опухолевых почкований и тропизма POD к опухолевым почкованиям.

Помимо полуколичественной оценки, для определения уровня экспрессии POD в инвазивном крае дополнительно применен метод количественного анализа с использованием цветоделения в программе LAS X. Проведенный статистический тест Краскела—Уоллиса (рис. 6) показал значимую выраженную связь (p=0,0016) между качественным и количественным показателем, что свидетельствует о том, что полуколичественный метод адекватен и корректен и может быть использован вместо более трудоемкого количественного метода.

Рис. 6. Распределение уровня экспрессии POD в CAF в зависимости от уровня экспрессии вокруг опухолевых почкований (для установления значимости различий использован критерий Краскела—Уоллиса).

Наличие опухолевых почкований и клинико-морфологические характеристики опухолей

В литературе [7, 8] встречаются противоречивые данные о характере статистической связи между наличием опухолевых почкований и метастазами в регионарных лимфатических узлах в раннем колоректальном раке, что, возможно, связано с нестандартизованной оценкой опухолевых почкований, так как протокол стандартизации принят только в 2016 г. [5]. Для установления взаимосвязей в настоящем исследовании был использован критерий χ². Обнаружены достоверная связь (p=0,023) между наличием опухолевых почкований и большей глубиной инвазии (T3—T4 по классификации TNM) и тенденция к связи (p=0,068) между наличием опухолевых почкований и метастазов в регионарных лимфатических узлах, но не их количеством (рис. 7).

Рис. 7. Клинико-морфологическая характеристика опухолей в зависимости от наличия опухолевых почкований.

Реакция POD в CAF и клинико-морфологические характеристики

Также была показана тенденция к наличию связи между выраженностью экспрессии POD вокруг опухолевых почкований и глубиной инвазии опухоли (p=0,088), но не наличием метастазов (рис. 8). Примечательно, что значимых связей между выраженностью экспрессии POD в инвазивном крае и клинико-морфологическими характеристиками обнаружить не удалось.

Рис. 8. Выявленные статистические связи между клинико-морфологическими характеристиками.

Синие стрелки — связи между наличием опухолевых почкований и глубиной инвазии/наличием метастазов в регионарные лимфатические узлы. Красный круг — зона экспрессии POD вокруг опухолевых почкований. Красные стрелки — статистические связи между экспрессией POD вокруг опухолевых почкований и глубиной инвазии/экспрессией POD в инвазивном крае.

Обсуждение

Учитывая корреляцию между уровнем экспрессии POD в инвазивном крае и вокруг опухолевых почкований, складывается впечатление не о прогностической значимости экспрессии POD вокруг опухолевых почкований, а о прогностической значимости наличия опухолевых почкований, что подтверждается результатами проведенного статистического анализа и соответствует данным ВОЗ [2]. Также отсутствие связи между экспрессией POD вокруг опухолевых почкований и наличием метастазов в лимфатических узлах свидетельствует об отсутствии прогностической значимости POD.

В литературе есть данные о прогностически неблагоприятном влиянии отсутствия экспрессии POD в колоректальном раке (сопряжено с наличием метастазов в лимфатических узлах и снижением безрецидивной выживаемости) [9]. В более позднем исследовании продемонстрирована высокая частота метастазирования в регионарные лимфатические узлы в группе субмукозных колоректальных раков с высокой экспрессией маркеров CAF и EMT (α-SMA, CD10, POD, FSP1, AEBP1, ZEB1 и TWIST1) [8]. Несмотря на отсутствие непосредственной прямой статистической связи между наличием метастазов в лимфатических узлах и экспрессией POD, достоверно более высокий уровень экспрессии POD в группе с большей частотой метастазирования косвенно свидетельствует о его неблагоприятном влиянии, что также характерно для многих злокачественных опухолей, в том числе аденокарциномы легкого, пищевода, инвазивного рака молочной железы [10—12]. Учитывая, что POD — один из маркеров CAF, выраженная экспрессия POD в инвазивном крае может свидетельствовать о высокой концентрации CAF в этих опухолях. Этот вывод особенно значим для муцинозных опухолей, где обнаружены более высокие значения POD вблизи «озер слизи», поскольку при данном гистологическом типе опухолевые почкования формируются редко и их оценка по рекомендациям ВОЗ затруднена [2].

Заключение

С помощью технологии дуплексной метки впервые изучена экспрессия POD в CAF вокруг опухолевых почкований в инвазивном крае аденокарциномы толстой кишки. Показано, что выраженность экспрессии POD в CAF вокруг опухолевых почкований не отличается от выраженности реакции в самом инвазивном крае опухоли (p<0,01), что исключает необходимость оценивать реакцию POD именно вокруг опухолевых почкований.

Выявленные связи между наличием опухолевых почкований и глубиной инвазии/наличием метастазов в регионарных лимфатических узлах подтверждают их прогностическое значение. Отсутствие статистической связи между уровнем POD в CAF вокруг почкований и глубиной инвазии/наличием метастазов свидетельствует об отсутствии прогностической роли подопланин-положительных CAF. Впервые описана более выраженная экспрессия POD в CAF вблизи муцинозных комплексов, однако причина и возможное клиническое значение остаются неясными.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — Н.А. Олейникова

Сбор и обработка материала — Н.А. Олейникова, О.А. Харлова

Статистическая обработка — И.А. Михайлов

Написание текста — Н.А. Олейникова

Редактирование — П.Г. Мальков, Н.В. Данилова

Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (РФФИ, грант «Перспектива» №19-315-60006) и с использованием оборудования, приобретенного по программе развития МГУ им. М.В. Ломоносова до 2020 г.