Онкологические заболевания остаются одними из основных в структуре причин смертности населения. Отмечено, что применение стандартных подходов к лечению в виде оперативного вмешательства в сочетании с адъювантной химиотерапией в некоторых случаях не только не позволяет получить ожидаемый положительный эффект, но и может привести к снижению общей продолжительности жизни части пациентов [1—3].

Развитие методов молекулярной диагностики позволило выявить группу пациентов с опухолями, имеющими особый молекулярный профиль, а именно наличие дефекта системы репарации неспаренных нуклеотидов ДНК. Кроме прогностического значения это дало возможность рассмотреть варианты персонализированного подхода к лечению с назначением иммунотерапии, которая не только максимально эффективна, но и единственно безопасна для данной категории пациентов.

Основные понятия

В процессе жизнедеятельности нормальные клетки организма проходят множество делений, что сопровождается многократной репликацией ДНК. Во время репликации спонтанно либо под действием различных внешних воздействий (ультрафиолет, рентгеновские лучи, химические соединения и т.д.) в каждой клетке организма возникают множественные повреждения и ошибки в синтезируемой цепи ДНК. Этот процесс не приводит к фатальным последствиям за счет функционирующих в норме систем репарации ДНК, которые обеспечивают генетическую стабильность. Одной из главных систем является система репарации неспаренных нуклеотидов ДНК (Mismatch Repair System — MMR), ключевую роль в функционировании которой играют четыре гена: MLH1 (mutL homologue 1), MSH2 (mutS homologue 2), MSH6 (mutS homologue 6) и PMS2 (postmeiotic segregation increased 2). Эти гены кодируют одноименные белки — MLH1, MSH2, MSH6, PMS2, которые существуют в виде гетеродимеров — MLH1-PMS2 и MSH2-MSH6.

В части опухолей происходит нарушение функционирования одного или нескольких из этих генов из-за спорадических или герминальных (наследственных) мутаций, что приводит к нарушению функционирования (дефициту) MMR — dMMR [4]. При этом следует отметить, что мутации в генах MLH1 и MSH2 способствуют протеолитической деградации белка-партнера в гетеродимере в отличие от мутаций в генах PMS2 и MSH6, которые сопровождаются деградацией только одноименного белка. Это происходит за счет того, что белки MLH1 и MSH2 могут образовывать гетеродимеры с другими белками системы репарации, такими как MSH3, MLH3, PMS1 [4].

В ДНК имеются участки, где нуклеотиды образуют повторы от 1 до 6 оснований, так называемые микросателлиты. В процессе репликации ДНК могут происходить изменения в данных последовательностях в результате инсерции оснований. В норме такие мутации устраняются системой MMR. При дефиците систем репарации происходит накопление таких изменений в микросателлитах, что приводит к возникновению состояния генетической нестабильности — генетической гипермутабельности, или микросателлитной нестабильности (Microsatellite Instability — MSI).

Таким образом, MSI является фенотипическим свидетельством того, что система репарации (MMR) не функционирует нормально. Опухоли, характеризующиеся наличием микросателлитной нестабильности, принято обозначать как MMR-дефицитные (dMMR/MSI-H).

Опухоли, не имеющие мутаций, генетически стабильные принято обозначать как MMR-профицитные (pMMR/MSS). Обозначение MSI-H (High) связано с выделением до недавнего времени высокого (high) и низкого (low) уровней микросателлитной нестабильности, основанных на количестве генов, подверженных мутации, определяемых методом ПЦР. В настоящее время, согласно рекомендациям ESMO от 2019 г., MSI-Low-опухоли включены в группу микросателлитно стабильных (MSS) [5].

Показания к проведению тестирования MSI

Любая опухоль с этим вариантом молекулярного патогенеза — микросателлитной нестабильностью — имеет тысячи мутаций в микросателлитных повторах и других участках генома. Образование столь большого количества неоантигенов приводит к относительно стереотипной реакции активации Т-лимфоцитов с последующей инфильтрацией ими опухоли. Механизмом ускользания опухоли от иммунного ответа в данном случае становится экспрессия клетками опухоли молекул контрольных точек, в том числе PD-L1, что создает возможность использования ингибиторов контрольных точек, таких как анти-PD1, для лечения данных больных. Анти-PD1-препарат блокирует взаимодействие лигандов контрольных точек с родственными им рецепторами на эффекторных клетках, что обусловливает мощный противоопухолевый эффект.

Таким образом, большая часть мутантных неоантигенов в MMR-дефицитных опухолях являются чувствительными к блокаде молекул контрольных точек вне зависимости от тканевого происхождения опухоли. Это позволило FDA 23 мая 2017 г., а затем и Росздравнадзору 1 мая 2019 г. зарегистрировать анти-PD1-препарат для лечения любой солидной опухоли с dMMR/MSI-H.

В то же время данный баланс MMR-дефицитных гипермутантных опухолевых клеток и иммунных клеток, ингибированных молекулами контрольных точек, вероятно, тормозит прогрессирование опухоли, обусловливая лучшую выживаемость данных пациентов по сравнению с больными, имеющими MMR-профицитные опухоли, в частности рак желудка и толстой кишки [1, 2]. Использование химиотерапии у больных MMR-дефицитным раком желудка или толстой кишки либо не приводило к эффекту, по данным одних исследователей, либо вызывало быстрое прогрессирование и преждевременную смерть пациентов с dMMR/MSI-H [1, 2, 6, 7]. Авторы объясняют это разрушением иммунного барьера вокруг раковых клеток химиотерапевтическими препаратами и провоцированием диссеминации опухоли [2]. Таким образом, чрезвычайно важно исследовать MMR/MSI при аденокарциномах желудка и толстой кишки на биопсийном материале до принятия решения о назначении химиотерапии. Особенно это значимо для рака желудка, когда назначение предоперационной химиотерапии, согласно клиническим рекомендациям, утвержденным Миндравом РФ (2018 г.), необходимо, начиная с 1b-стадии, и вслепую она может быть назначена тем пациентам, которым химиотерапия противопоказана.

Надо отметить, что, по данным литературы [8], dMMR/MSI-H может встречаться практически в любой солидной опухоли. Мы в своих исследованиях, помимо опухолей с частой локализацией, таких как рак толстой кишки, рак желудка, эндометрия, выявляли dMMR/MSI-H при анапластическом раке щитовидной железы, плоскоклеточном раке пищевода, мелкоклеточном раке легкого, аденокарциноме легкого, глиобластоме, метастазе без первично-выявленного очага, уротелиальном раке.

Методы определения MMR/MSI

Определить MMR/MSI можно тремя методами, используя иммуногистохимическое исследование, ПЦР-исследование, секвенирование нового поколения (NGS). Согласно рекомендациям ESMO 2019 г., первым методом в определении MSI/MMR является иммуногистохимия (рекомендация A, сильная степень консенсуса 8,7/10). ПЦР — это метод второй линии в случае получения сомнительных результатов при иммуногистохимии (рекомендация B). Однако панель экспертов ESMO рекомендует использовать оба метода для определения MMR/MSI при метастатическом колоректальном раке и других опухолях из спектра синдрома Линча при рассмотрении вопроса о применении иммунотерапии.

NGS может стать методом выбора для тестирования MMR/MSI и других мутаций всех типов опухолей (рекомендация C, очень сильная степень консенсуса 9/10), основное ограничение — малая доступность метода [5].

Определение MMR/MSI иммуногистохимическим методом

ИГХ-исследование является наиболее простым и доступным методом определения MMR/MSI. Для проведения тестирования могут использоваться как биопсийные, так и операционные образцы.

Основные преимущества проведения исследования на образцах биопсии:

— адекватная фиксация материала, что обеспечивает сохранность антигенных структур;

— получение информации о MMR/MSI-статусе опухоли на дооперационном этапе с целью дальнейшего планирования лечения.

Основные преимущества проведения исследования на операционных образцах:

— больший объем материала, возможность выбора наиболее подходящего фрагмента для исследования;

— наличие внутреннего контроля;

— снижение вероятности получения ложноотрицательного либо ложноположительного результата при гетерогенности опухоли.

ИГХ-метод определения MMR/MSI заключается в детекции белков системы репарации с помощью специфической реакции антиген—антитело. При постановке данной реакции используются антитела к четырем основным белкам системы MMR: MSH2, MSH6, PMS2, MLH1. При возникновении мутации в каком-либо из генов системы MMR происходит деградация соответствующего белка и, следовательно, специфическая реакция между антителом и антигеном не происходит. Это проявляется отсутствием ядерного окрашивания в клетке (рис. 1, а). Напротив, в клетках MMR-профицитных опухолей, а также в нормальных клетках тканей организма будет отмечаться позитивная ядерная реакция при использовании всех четырех антител (рис. 1, б).

Мутации в гене MLH1 связаны с протеолитической деградацией одноименного белка и белка-партнера PMS2 (рис. 2), так же, как и мутации в гене MSH2 связаны с деградацией белков MSH2 и MSH6. В то же время мутации в генах PMS2 и MSH6 могут не приводить к потере белка-партнера.

Рис 1. Иммуногистохимическое определение статуса MMR (белок MLH1).

а — аденокарцинома толстой кишки с признаками dMMR/MSI-H. Отсутствие экспрессии MLH1 в опухолевых клетках при позитивном внутреннем контроле; б — аденокарцинома толстой кишки без признаков dMMR/MSI-H. Сохранная экспрессия MLH1 в опухолевых клетках при позитивном внутреннем контроле.

Рис. 2. Эндометриоидный рак эндометрия, иммуногистохимическое определение статуса MMR.

а — отсутствие экспрессии PMS2; б — отсутствие экспрессии MLH1; в — сохранная экспрессия MSH2; г — сохранная экспрессия MSH6.

Сложности с интерпретацией ИГХ-исследования связаны главным образом с получением ложноположительных результатов, которые зачастую обусловлены преаналитическими проблемами, такими как неадекватная фиксация тканей (рис. 3). Окрашивание в клетках опухоли может не только полностью отсутствовать, но и становиться аберрантным, представленным цитоплазматической, точечной или перинуклеарной реакцией. В этом случае необходимо ориентироваться на реакцию во внутреннем контроле. При этом в случае получения сомнительных результатов следует провести тестирование статуса MMR/MSI другими методами.

Рис. 3. Ошибки в интерпретации исследования системы MMR. Нарушение в протоколе фиксации/проводки материала.

Другой проблемой иммуногистохимической оценки статуса MMR является гетерогенность dMMR/MSI-H в различных клонах клеток опухоли. Проявляется это в том, что часть опухоли оказывается позитивной на белок MMR, а в другой части раковые клетки теряют его (рис. 4). По данным литературы [9], такая проблема преимущественно характерна для рака эндометрия и редко встречается при других локализациях. Однако наши наблюдения показали, что гетерогенность статуса MMR может наблюдаться в опухолях любых локализаций.

Рис. 4. Гетерогенность экспрессии маркеров системы MMR.

Позитивная реакция в части опухоли на PMS2 (справа). В другой части отмечается потеря экспрессии PMS2 (слева).

Молекулярное исследование MSI методом ПЦР

Молекулярное определение MSI методом ПЦР рекомендовано в случаях с неопределенными результатами ИГХ-исследования, а также при потере только одной субъединицы гетеродимера. В настоящее время рекомендуется использование панелей D5S346, D2S123, D17S250, BAT25, BAT26 или BAT-25, BAT26, NR-21, NR-24, NR-27, которые обладают более высокой чувствительностью и специфичностью. Наличие MSI определяется как потеря стабильности в двух или более микросателлитных маркерах из пяти.

В целом по точности определения MSI иммуногистохимический метод сопоставим с ПЦР-исследованием при аденокарциномах толстой кишки [10]. При опухолях других локализаций сведения разнятся и предпочтение, вероятно, следует отдавать иммуногистохимии или NGS.

Секвенирование нового поколения (NGS)

Секвенирование нового поколения представляет собой наиболее чувствительный и специфичный молекулярный тест для оценки MSI. Основным преимуществом секвенирования является возможность одновременного выявления помимо микросателлитной нестабильности других мутаций, определяющих подход к терапии, таких как KRAS-мутации при колоректальном раке, EGFR-мутации при немелкоклеточном раке легкого и BRCA1- и BRCA2-мутаций при раке молочной железы и раке яичников. Таким образом, NGS может являться методом выбора при тестировании любых злокачественных опухолевых процессов. Ограничениями исследования NGS является его высокая стоимость вкупе с низкой доступностью и отсутствием финансирования со стороны ОМС на настоящий момент, а также невозможность определения гетерогенности опухоли.

Ключевые вопросы тестирования MMR/MSI при раке эндометрия:

1. Когда необходимо тестировать MMR/MSI при раке эндометрия?

Ответ: согласно классификации ВОЗ 2019 г., исследования MMR, p53, POLE должны выполняться для выделения молекулярных подтипов рака эндометрия в момент постановки диагноза. Так как исследование POLE в настоящее время мало доступно, то POLE может не исследоваться в случае рака эндометрия с низким и промежуточным риском с гистологией низкой степени злокачественности (low grade).

2. Почему еще необходимо исследовать MMR/MSI, p53 при раке эндометрия?

Ответ: данные исследования повышают аккуратность диагностики опухоли низкой и высокой степени злокачественности, повышают выявляемость смешанного рака эндометрия.

3. Почему нельзя изолированно исследовать p53 без MMR?

Ответ: выявление dMMR в раке эндометрия является признаком эндометриоидной дифференцировки, в то время как определение мутации p53 в клетках с dMMR не становится признаком p53-мутантного молекулярного подтипа.

Собственные клинические примеры

Клинико-морфологическое наблюдение 1

Пациентка 58 лет. Аденокарцинома желудка, pT4N1 (III стадия).

Лечение выполнено в объеме дистальной резекции желудка, неоадъювантная полихимиотерапия не проводилась. При гистологическом исследовании выявлена низкодифференцированная аденокарцинома с умеренной инфильтрацией лимфоидными клетками (рис. 5). При проведении иммуногистохимического исследования на белки MMR была установлена негативная реакция в опухоли на PMS2 и MLH1 (рис. 6), сохранная экспрессия MSH2, MSH6. Также ИГХ-исследование показало высокий уровень экспрессии PD-L1 как в опухолевых, так и иммунных клетках. Несмотря на метастаз в регионарном лимфатическом узле, принято решение о наблюдении без назначения адъювантной химиотерапии. В настоящее время отмечается 3-летний безрецидивный период.

Рис. 5. Наблюдение 1. Низкодифференцированная аденокарцинома желудка с признаками dMMR/MSI-H.

Отмечается умеренная инфильтрация лимфоидными клетками. Окраска гематоксилином и эозином, ×200.

Рис. 6. Наблюдение 1. Иммуногистохимическое исследование белков системы MMR и определение уровня экспрессии PD-L1.

В опухолевых клетках отсутствие экспрессии: а — MLH1; б — PMS2; в — высокий уровень экспрессии PD-L1.

Клинико-морфологическое наблюдение 2

Пациентка 63 лет. Низкодифференцированная аденокарцинома желудка, рТ3N2. В конце 2018 г. выполнено комплексное лечение (операция + химиотерапия), исследование MMR/MSI не проводилось. В апреле 2019 г. отмечено прогрессирование в виде метастазов по брюшине, плевре. При иммуногистохимическом исследовании выявлено отсутствие экспрессии PMS2, MLH1 (рис. 7).

Рис. 7. Наблюдение 2. Низкодифференцированная аденокарцинома желудка с признаками dMMR/MSI-H.

а — микроскопическая картина опухоли, окраска гематоксилином и эозином; б — отсутствие экспрессии PMS2 в опухолевых клетках.

Заключение

Исследование dMMR/MSI-H имеет важное предиктивное значение для большинства солидных опухолей. Для определения dMMR/MSI-H методом выбора является иммуногистохимическое исследование, которое необходимо проводить при раке желудка, толстой кишки на биопсийном материале перед планированием лечения пациента.

Данная публикация подготовлена при финансовой поддержке компании «Эйсай». Авторы несут полную ответственность за содержание публикации и редакционные решения.

This publication has been prepared with the financial support of Eisai. The authors are solely responsible for the content of the publication and editorial decisions.