Введение
Формирование представления о важной роли нарушения проницаемости кишечного барьера [1], который обладает способностью динамически реагировать на экзогенные и эндогенные факторы [2] и участвует в патогенезе многих заболеваний, способствовало повышенному интересу исследователей к неиммунному компоненту этого процесса, в том числе к белкам, влияющим на функционирование межклеточных плотных контактов (tight junctions — TJ). Один из таких белков — зонулин, человеческий гомолог продуцируемого Vibrio cholerae токсина Zot (zonula occludens toxin) [3, 4], изучение которого внесло важный вклад в понимание связи между нарушением проницаемости кишечного барьера и механизмами развития ряда заболеваний.
Нарушение целостности эпителиального пласта и увеличение его проницаемости способствуют адгезии большого количества различных антигенов и сенсибилизации организма к заболеваниям, ассоциированным с изменением плотности межклеточных TJ [4]. Можно выделить несколько групп таких заболеваний: хронические воспалительные заболевания кишечника: синдром раздраженного кишечника, болезнь Крона [5], некротизирующий энтероколит [6, 7] аллергические и аутоиммунные заболевания: целиакия [8—10], сахарный диабет 1-го типа [11, 12], аутоиммунный гепатит [13], системная красная волчанка [14], анкилозирующий спондилит [15], рассеянный склероз [16, 17], ревматоидный артрит (РА) [18]; заболевания, связанные с нарушением TJ при метаболической патологии: ожирение/резистентность к инсулину [19, 20], в том числе неалкогольная жировая болезнь печени [21], сахарный диабет 2-го типа [22, 23], синдром поликистозных яичников [24, 25]; острое повреждение легких [26], бронхиальная астма [3, 27], ишемическая болезнь сердца [28], системные инфекции — сепсис [29] и ВИЧ [30, 31], экологическая энтеропатия [32], а также аутизм [33] и другие психоневрологические заболевания.
Прорывом в понимании молекулярных механизмов регуляции кишечной проницаемости и ее роли в норме и при различных заболеваниях послужило открытие гомолога холерного токсина Zot зонулина, который стал первым и пока единственным известным белком млекопитающих, модулирующим функциональную активность TJ в основном за счет их ослабления, приводящего к увеличению проницаемости кишечной стенки [34]. Повышенная секреция зонулина обнаружена, в частности, после воздействия как патогенных и условно-патогенных, так и непатогенных штаммов бактерий [35].
Регуляторы кишечной межклеточной проницаемости
Пища переваривается в просвете кишечника в среде, образованной желчью, соком поджелудочной железы и ферментами, там же разлагаются антигены и микроорганизмы [36]. Структура кишечного просвета подвержена динамическим изменениям и определяется физическими, химическими и биологическими компонентами, такими как слизь, эпителиальные, секреторные и иммунные клетки, бактериальная микрофлора [37]. Функционирование интестинального эпителиального барьера (IEB) зависит прежде всего от наличия ряда межклеточных соединений, состоящих из апикального соединительного комплекса (AJC), включающего TJ, адгезионных соединений (AJ) и десмосом.
Основными регуляторами межклеточной проницаемости являются TJ [38], представляющие собой сеть белков, расположенных на вершине боковой мембраны эпителиальных клеток, впервые описанные в 1963 г. M.G. Farquhar и G.E. Palade [39]. Так, TJ состоят из трансмембранных белков, включая 2 класса клаудинов [40] (герметизирующие [41] и порообразующие [42—45]); интегральные белки, связанные с TJ, такие как фосфорилированный трансмембранный белок окклюдин [46, 47], соединительные молекулы адгезии [48], трицеллюлин [49], ангулины [50] и внутриклеточные цитоплазматические каркасные белки, в том числе белки семейства zonula occludens [51].
Белки zonula occludens (ZO-1 (˜220 кДа), ZO-2 (˜160 кДа), ZO-3 (˜130 кДа) относятся к семейству ассоциированных с мембраной гомологов гуанилаткиназы (MAGUK) и сконцентрированы на цитоплазматической стороне TJ в эпителиальных клетках [52]. Хотя эти белки имеют общие структурные и функциональные области, а также взаимодействуют с общими партнерами, они обладают важными функциональными особенностями, придающими им некоторые уникальные функции [53]. Каркасные белки ZO-1, -2, -3 имеют три домена PDZ и домен, подобный гуанилаткиназе (GUK): PDZ1 связывает C-конец клаудинов [51], а домен GUK взаимодействует с окклюдином [54]. C-концевые области ZO взаимодействуют с актином и служат каркасом, связывающим TJ тяжи с цитоскелетом [55—57]. Ассоциация цитоскелета со структурой TJ имеет решающее значение для регуляции и поддержания их функции [58]. Следует также указать на цитоплазматический белок цингулин с молекулярной массой 140—160 кДа, который играет структурную роль, связывая ZO-1, ZO-2, ZO-3, цитоскелетные белки [59] и сигнальный белок, участвующий в контроле пролиферации эпителия [14, 60]. Механизм регуляции ZO-1 осуществляется по PI3K/Akt сигнальному пути [61]. Особый интерес представляет белок ZO-2, продукция которого не только в нормальных, но и в опухолевых клетках зависит от ряда факторов. Так, например, известно, что TGF-β1 снижает экспрессию ZO-2 в клетках скиррозного рака желудка [62], а VEGF-A — в клетках аденокарциномы поджелудочной железы [63]. Витамин D3, напротив, индуцирует экспрессию ZO-2 в клетках колоректального рака (КРР) [64], а прогестерон — в клетках нормального эпидермиса экспериментальных животных [65].
Показано, что TJ связаны с микротрубочками и микрофиламентами цитоскелета. Важную роль в регуляции открытия/закрытия TJ играют микрофиламенты актина и миозина [66, 67], при этом миозин в основном участвует в регуляции сборки TJ [68, 69], в то время как актин связывается с цитоплазматическим каркасом белков [70]. Полимеризующие актин белки и регуляторы актина играют центральную роль в изменениях TJ [42].
Цитокины и межклеточные контакты
Исследования регуляции межклеточных TJ сосредоточены на их цитокин-опосредованной дисфункции при хронических воспалительных процессах, особенно тех, которые поражают слизистую оболочку кишки [71]. Пространственная ориентация эпителиальных клеток кишечника позволяет распознавать антигены на его апикальной стороне для обнаружения сигналов опасности и передачи этой информации в иммунные клетки, секретирующие цитокины. Презентация антигена на макрофагах человека также регулируется зонулином, который связан с изменением профиля цитокинов и сдвигом толерантности к аутоиммунитету [72].
Цитокины поддерживают гомеостаз кишечника, регулируя такие ключевые клеточные процессы, как гибель клеток, пролиферацию, молекулярный транспорт и воспалительные реакции на патогены [73]. Так, показано, что TNF-α связан с воспалительным заболеванием кишечника [74], болезнью «трансплантат против хозяина» [75], а также болезнью Крона [5], лечение которой анти-TNF-препаратами корректировало нарушение барьера, наблюдаемое в эпителии толстой кишки [74]. При этом механизм нарушения барьера TNF-α опосредуется киназой легкой цепи миозина (myosin-light-chain kinase — MLCK), а активация MLCK уменьшает проницаемость TJ как in vivo, так in vitro [76, 77].
IFN-γ увеличивает проницаемость кишечной стенки за счет изменения экспрессии и локализации белков TJ, а также перестройки цитоскелета [78]. IL-1β способствует усилению кишечного воспаления, тогда как IL-33 обладает как провоспалительными, так и противовоспалительными свойствами. Цитокины из семейства IL-1, такие как IL-1β и IL-18, играют решающую роль в поддержании гомеостаза в кишечнике [79]. Высвобождение этих двух цитокинов зависит от активации комплекса инфламмасом, при этом секреция IL-1β управляется различными стимулами, а IL-18 экспрессируется эпителием кишечника конститутивно [80]. Тем не менее поддержание баланса уровня IL-18 важно для целостности эпителия, так как гиперэкспрессия этого цитокина приводит к потере созревших бокаловидных клеток и повышенной восприимчивости к экспериментальному колиту. Известно, что IL-18 эпителиального происхождения может действовать непосредственно на рецепторы IL-18R1, экспрессированные на CD4 + Th17-клетках, а также на Foxp3+ регуляторных T-клетках (Treg), и может контролировать дифференцировку этих клеток как в норме, так и при воспалении [81]. В данном случае IL-18 представляет собой пример опосредованного цитокинами перекрестного взаимодействия, когда кишечный эпителий обучает иммунные клетки необходимому действию. IL-22, входящий в семейство IL-10, напротив, в первую очередь секретируется иммунными клетками и может напрямую влиять на кишечный эпителий через свои рецепторы [82]. IL-22 секретируется T-клетками и так называемыми врожденными лимфоидными клетками (innate lymphoid cells — ILC), не имеющими признаков T или B лимфоцитов. Относящиеся к ILC тканевые резидентные клетки Th1 и Th17 могут секретировать IL-22 под влиянием IL-6 и IL-23, секреция которых может ингибироваться TGF-β [83]. Кроме того, IL-12 и IL-17 могут активировать секрецию IL-22 клетками Th1. Клетки Th22, CD8+Т-клетки, γδ Т-клетки и NKT-клетки также могут продуцировать IL-22 в норме и при воспалении, например, при заражении Citrobacter rodentium [84]. Эти популяции клеток близко контактируют с эпителиальными клетками кишечника, гиперэкспрессирующими рецептор IL-22 (IL-22R1) [85]. При этом IL-22 активирует передачу сигналов через STAT3, способствующую выживанию эпителия во время бактериальной инфекции путем секреции антимикробных пептидов, таких как Reg3β и Reg3γ [86].
Пристальное внимание исследователей привлекают Толл-подобные рецепторы (Toll-like receptors — TLR), представляющие собой класс трансмембранных рецепторов распознавания образов (Pattern recognition receptors — PRR), которые играют важную роль в раннем врожденном иммунном ответе в кишечнике и необходимы для распознавания микробов и контроля иммунного ответа. Одним из членов семейства TLR является TLR2, распознающий консервативные паттерны как на грамотрицательных, так и на грамположительных бактериях и экспрессирующийся на многих типах клеток кишечника, включая эпителиальные [87]. Показано, что стимуляция TLR2 in vitro вызывает повышение трансэпителиального электрического сопротивления через активацию протеинкиназы C и транслокацию ZO-1 к комплексу TJ [61]. Бактерии взаимодействуют с эпителием кишечника через PRR, такие как TLR [88] и его адаптерный белок MYD88 [89], а также через NOD-подобные рецепторы [90].
Однако состав и стабильность интестинального эпителиального барьера (IEB) зависят не только от TJ, но и от взаимодействия AJ с десмосомами [91, 92]. AJ устанавливают межклеточные контакты, которые необходимы для созревания и поддержания TJ. Основным трансмембранным белком, участвующим в сборке AJ, является E-кадгерин [93], внутриклеточный домен которого связан с p120, бета-катенином и альфа-катенином, образуя комплекс, взаимодействующий с актиновыми филаментами [94].
Межклеточную механическую прочность контактам в эпителии придают десмосомы, в состав которых входят два подтипа трансмембранных кадгеринов, десмоглеины и десмоколлины. Эти белки, взаимодействуя с плакофилином и десмоплакином [95], могут связывать промежуточные волокна, обеспечивая устойчивость соединения к механическому напряжению, возникающему из-за перистальтического движения кишки [96].
Рецепторы, активируемые протеиназами (PAR), представляют собой парное семейство конъюгированных с G-белками рецепторов, активирующих протеолитическое расщепление их N-конца при обнаружении соответствующего лиганда. PAR2 находится на апикальной и базолатеральной сторонах энтероцитов [97]. Стимуляция базолатерального PAR2 приводит к увеличению проницаемости путем перераспределения ZO-1, окклюдинов и фактина [98]. Кроме того, A.M. Coelho и соавт. (2002) продемонстрировали, что in vivo апикальная стимуляция PAR2, активирующая пептид SLIGRL, вызывает дозозависимое увеличение проницаемости кишечника [99]. Показано, что стимуляция PAR1 также увеличивает кишечную проницаемость [100].
Зонулин и белки семейства зонулина
К числу ключевых эндогенных модуляторов межклеточной кишечной проницаемости относится зонулин. В настоящее время наше представление о биохимии и патофизиологии зонулина основано в большой степени на двух фундаментальных обзорах, выполненных A. Fasano и опубликованных в 2011 и 2020 гг. [3, 101]. В результате частых мутаций зонулина в процессе эволюции сформировалось семейство структурно и функционально родственных белков, названных «пептидами семейства зонулина», к которому относятся из-за своей идентичности зонулину предшественник гаптоглобина-2 (НР-2), известный как пре-гаптоглобин-2 (пре-НР-2), а также пропердин и другие белки из группы манноза-ассоциированных сериновых протеаз (mannose-associated serine protease — MASP), что доказывает роль этих белков в регуляции кишечной проницаемости [102].
Среди белков, относящихся к семейству зонулина, первым открыт пре-НР-2 [103]. Гаптоглобины относятся к группе белков, эволюционировавших из связанного с комплементом белка MASP. В результате мутации в каталитическом домене пре-НР-2 утратил функцию протеазы и приобрел новые свойства, в том числе способность модулировать TJ.
Зонулин — белок с молекулярной массой около 50 кДа — входит в число 40—50 белков, формирующих TJ между эпителиальными клетками, ограничивающими интенсивность межклеточного транспорта. Дезорганизация белковых комплексов, формирующих структуру TJ, приводит к нарушению проницаемости эпителиальных барьеров, в том числе в кишечнике. Увеличение проницаемости кишечного барьера способствует проникновению в кровоток патогенных агентов, стимулирующих развитие воспалительных и аллергических реакций [104, 105]. Зонулин, благодаря своей способности модулировать активность межклеточного транспорта, выполняет защитную роль против колонизации тонкой кишки микроорганизмами.
Секретируемый в просвет желудочно-кишечного тракта зонулин стимулирует PAR, а также рецепторы эпидермального фактора роста (EGFR), которые в свою очередь индуцируют сложный процесс «открытия» TJ, позволяя молекулам с молекулярной массой более 3,5 кДа преодолевать IEB.
Зонулин как маркер кишечной проницаемости при заболеваниях желудочно-кишечного тракта
В большинстве клинико-лабораторных исследований зонулин определяют в двух биологических средах (кал и кровь) [106—108]. Полагают, что выявление зонулина в крови может свидетельствовать о транспорте этого белка из просвета кишечника в подслизистый слой, между клетками кишечного эпителия, а в кале — о скорости его выработки в энтероцитах [109, 110]. На экспериментальной модели некротизирующего энтероколита показано, что концентрация зонулина в кале повышается одновременно с увеличением пропускной способности кишечника и сохраняется в течение 24 ч, возвращаясь к исходному уровню только через 48 ч [111].
Период полураспада зонулина в крови очень вариабелен и колеблется от 4 мин до 4 ч, поэтому возможен значительный разброс выявляемых концентраций маркера (от неопределимых до очень высоких) [7, 112]. В связи с этим некоторые авторы предлагают даже при оптимальном иммунном ответе для определения стабильности состояния кишечного барьера измерять вместо самого зонулина уровни антител к нему — IgA и IgG [7]. Другие исследователи рекомендуют использовать иммунодиагностические наборы, с помощью которых можно идентифицировать различные белки, структурно и функционально связанные с зонулином, предполагая существование семейства белков зонулина, а не только одного белка, регулирующего проницаемость кишечной стенки [113].
При нарушении проницаемости кишечного барьера в кровь могут попадать эндотоксины — продукты жизнедеятельности кишечных бактерий, поэтому диагностировать повышенную проницаемость можно, определяя иммунный ответ на компоненты микробиома кишечника, липополисахариды или бактериальные токсины в сочетании с определением IgM к зонулину и оценкой дисбиоза кишки.
Известно, что зонулин в основном секретируется эритроцитами, клетками печени, жировой ткани, мозга, иммунной системы, легких, почек и кожи, при этом он может захватываться макрофагами и клетками Браухича—Купфера в печени [7, 113]. Наиболее мощными стимуляторами секреции зонулина являются микроорганизмы (бактерии) и глютен [9]. Увеличивая кишечную проницаемость, зонулин способствует вымыванию бактерий из просвета кишки. Помимо энтероксинов, некоторые кишечные патогены, в том числе комменсальные, лабораторная Escherichia coli, вирулентная E. coli и Salmonella typhi вызывают высвобождение зонулина из кишечника при нанесении на апикальную поверхность энтероцитов. После высвобождения зонулина наблюдается повышенная проницаемость кишечника и выход ZO-1 из TJ комплекса [35].
Одним из триггерных белков, приводящих к выбросу зонулина, является глиадин [114, 115]. Нанесенный на апикальную поверхность энтероцитов глиадин вызывает высвобождение зонулина посредством активации хемокинового рецептора CXCR3, активируемого при взаимодействии с MyD88, и последующее увеличение проницаемости как на моделях клеточных культур, так и в исследованиях тканей кишки ex vivo, что опровергает мнение о влиянии глютена на секрецию зонулина как вредного компонента микроорганизмов [114, 116]. Следует отметить, что определенные домены глиадина оказывают в организме разные эффекты: пептид 31—43 — цитотоксическое действие, 57—89 (называемый 33mer) — иммуномодулирующее действие, 111—130 и 151—170 способны связывать CXCR3 и высвобождать зонулин, а 261—277 вызывает высвобождение интерлейкина IL-8 [116]. Показано, что секреция зонулина, зависимая от MyD88, способствует увеличению межклеточной кишечной проницаемости вследствие выхода белка ZO-1 из комплекса белков TJ [117]. Таким образом, «зонулиновый путь» обеспечивает механизм защиты от «смывов» микроорганизмов, поддерживая реакцию врожденного иммунитета на избыточный бактериальный рост и изменения микробиома в тонкой кишке, а также на дисбиоз.
Рецептор CXCR3 гиперэкспрессирован на апикальной поверхности энтероцитов у пациентов с болезнью Крона [116], что может объяснить увеличение экспрессии зонулина, обнаруженное в кишечных эксплантатах, полученных от пациентов с этим заболеванием при воздействии глиадина [9]. Несмотря на то что полный сигнальный каскад после связывания глиадина с CXCR3, приводящий к высвобождению зонулина, до конца не изучен, уже показана его зависимость от MyD88 — ключевой адаптерной молекулы в сигнальном пути TLR [116]. Глиадин также способен вызывать высвобождение зонулина и провоспалительных цитокинов из макрофагов, сходное с ответом, наблюдаемым после воздействия бактерий [115].
В связи с тем, что зонулин участвует в формировании TJ, повышенный уровень этого белка в крови рассматривают в качестве маркера кишечной проницаемости. Подтверждением этому можно считать изменение уровней зонулина в сыворотке крови в условиях, характеризующихся нарушением IEB, включая глютеновую болезнь, сахарный диабет 1-го типа и нечувствительную к глютену целиакию [1, 104, 118]. Модулирование кишечной проницаемости, в том числе активация зонулинового пути, является частью механизма регуляции гомеостаза слизистой оболочки кишки и может быть не связано с развитием патологического процесса, что показано в экспериментах на зонулин-трансгенных животных, которые оказались более восприимчивыми к колитам, вызванными химическими соединениями.
Исследования последних лет свидетельствуют о том, что нарушение проницаемости кишечного барьера предшествует развитию воспалительных заболеваний кишки. Транспорт антигенов из просвета кишки в кровоток стимулирует иммунный ответ, опосредованный цитокинами, которые в свою очередь способствуют нарушению проницаемости кишечного барьера, формируя замкнутый круг патологического процесса. Представление о зонулине как о маркере повышенной кишечной проницаемости служит основанием для проведения исследований по изучению его содержания в сыворотке крови и кале пациентов с воспалительными заболеваниями кишечника. Повышенные концентрации зонулина в крови и кале обнаружены при заболеваниях, в патогенезе которых основная роль отводится аутоиммунному процессу (болезнь Крона, сахарный диабет 1-го типа) и хроническому воспалению (метаболический синдром, запор) [109, 110, 119], при этом его уровни в сыворотке крови варьировали в широких пределах [12, 104, 118].
В пилотном исследовании, выполненном G.P. Caviglia и соавт. (2019), выявлено существенное возрастание сывороточного уровня зонулина у 118 пациентов с воспалительными заболеваниями кишки, среди которых у 86 выявлена болезнь Крона и у 32 — язвенный колит [120]. При этом различий в содержании зонулина между больными этих двух групп авторы не обнаружили. ROC-анализ показал высокую диагностическую точность при разделении пациентов с воспалительными заболеваниями кишечника и условно здоровых людей при пороговом уровне зонулина 14,2 пг/мл. Выявлена корреляционная взаимосвязь содержания зонулина в сыворотке крови с длительностью заболевания, но не с активностью патологического процесса и уровнем фекального кальпротектина. Не обнаружена связь сывороточного уровня зонулина и его содержания в кале. Основываясь на собственных данных и результатах других исследователей, авторы считают зонулин сыворотки крови более перспективным биологическим маркером, чем его содержание в кале.
Вместе с тем данные литературы о клиническом значении зонулина при гастроинтестинальных заболеваниях неоднозначны. Так, при обследовании 363 лиц, среди которых у 264 диагностированы функциональные и органические гастроинтестинальные заболевания, авторы [109] не выявили связи клинических проявлений с повышенным уровнем зонулина. Даже при язвенном колите, болезни Крона и целиакии указанная выше связь не обнаружена. Повышенный уровень зонулина сыворотки крови в данном исследовании коррелировал с индексом массы тела (QI), объемом талии, высоким уровнем артериального давления, гиперлипидемией и гипергликемией. Авторы объясняют полученные результаты возможной секрецией зонулина не только энтероцитами, но и многими другими клетками, в том числе жировой тканью, в связи с чем сывороточный уровень зонулина может отражать как увеличение кишечной проницаемости, так и степень его секреции другими органами.
Будучи неактивным предшественником гаптоглобина (HP), зонулин может играть роль не только маркера проницаемости, но и маркера вторичного воспаления. В литературе обсуждается сходство эффектов зонулина и HP, предшественником которого он является.
Проводятся клинические исследования зонулина у больных с ожирением, поскольку хорошо известна связь ожирения и его осложнений (сердечно-сосудистых заболеваний и артериальной гипертензии) с хроническим воспалением, в развитии которого заметную роль играет зонулиновый сигнальный путь [20]. Показана связь повышенного уровня HP с ожирением, высоким уровнем артериального давления, гипергликемией, метаболическим синдромом. Считается, что ожирение и метаболический синдром являются факторами риска развития системного воспаления слабой степени. При этом как зонулин, так и HP обладают способностью активировать систему комплемента и инициировать синтез С-реактивного белка [121]. Повышение уровня зонулина у пациентов с ожирением, ассоциированное с повышенной проницаемостью кишечного барьера и выходом в кровь эндотоксинов, провоцирующих сосудистое воспаление, характерное для таких пациентов, коррелировало с высоким потреблением калорий, белков, углеводов и натрия, а низкие уровни зонулина выявляли при повышенной продукции бутират-продуцирующих кишечных бактерий, которые, как известно, способствуют снижению кишечной проницаемости и менее выраженному воспалению [122, 123]. В связи с указанными выше данными некоторые авторы считают, что зонулин следует рассматривать в большей степени как маркер метаболических нарушений, чем как маркер кишечной проницаемости.
При исследовании связи уровня сывороточного зонулина с антропометрическими показателями и с кишечной проницаемостью у практически здоровых людей также выявлена корреляционная связь содержания зонулина с объемом талии и уровнем С-реактивного белка, но не с проницаемостью кишечного эпителия [121].
Показана биологическая роль зонулина и эффективность его использования в качестве биомаркера синдрома поражения печени при ожирении, так как у данной категории пациентов обнаружены повышенные концентрации зонулина в крови и кале [124, 125]. Анализ полученных результатов выявил прямую зависимость между тяжестью заболевания и концентрацией зонулина в крови. В то же время при циррозе печени отмечено уменьшение концентрации зонулина в сыворотке крови, связанное с повреждением функции синтеза белков в печени и не отражающее повышенную проницаемость кишечной стенки [126].
Известно, что первичный склерозирующий холангит часто ассоциирован с воспалительными заболеваниями кишки вследствие нарушения проницаемости кишечного барьера и влияния маркеров бактериальной транслокации на воспаление в билиарной системе. У пациентов с первичным склерозирующим холангитом по сравнению с контрольной группой существенно повышены уровни липополисахаридсвязывающего белка и растворимой формы CD14, но не зонулина, содержание которого даже снижено. При этом сочетание первичного склерозирующего холангита с воспалительными заболеваниями кишки не влияло на полученные результаты [127].
Глютен может стать агентом, вызывающим повышение проницаемости кишечника и уровня зонулина и у пациентов, не больных целиакией. Вызванная факторами окружающей среды кишечная дисфункция (Environmental enteric disfunction — EED) характеризуется потерей барьерной функции и повышенным бактериальным ростом в тонкой кишке, развитием воспаления низкой степени интенсивности с атрофией ворсинок и энтеропатией. Последствием этого заболевания может быть задержка физического и нейрокогнитивного развития ребенка, что подтверждается корреляцией высокого уровня зонулина и других барьерных белков с задержкой роста при EED.
Зонулин при аутоиммунных заболеваниях различной природы
Показано, что у пациентов с рассеянным склерозом наблюдается повышение проницаемости как кишечного, так и гематоэнцефалического барьеров (ГЭБ) [128]. У пациентов с поврежденным ГЭБ, по данным магнитно-резонансной томографии, концентрация зонулина существенно повышена, а базовый уровень маркера позволяет прогнозировать прогрессирование заболевания.
Дисбиоз (значительно пониженный уровень Clostridium leptum, связанный с повышенным уровнем E. coli), субклиническое воспаление кишечника, повышенная проницаемость кишечной стенки выявлены у 70% пациентов с анкилозирующим спондилитом (болезнь Бехтерева) (у примерно 10% из них в последующем разовьются клинические проявления) [129, 130], при котором в сыворотке крови обнаружены высокие уровни липополисахарида, интестинального белка, связывающего жирные кислоты, а также зонулина на фоне развития бактериального илеита. Несмотря на то что системное хроническое иммуноопосредованное заболевание анкилозирующий спондилит характеризуется преимущественно осевым и периферическим повреждением опорно-двигательного аппарата [131], выявлены внесуставные его проявления и среди них гастроинтестинальные, глазные, сердечно-сосудистые и легочные.
Негативное влияние нарушенного микробиома на иммунную систему и воспалительную регуляцию в кишечнике может способствовать развитию аутоиммунных заболеваний щитовидной железы (ЩЖ) [132], среди которых наиболее часто встречаются тиреоидит Хашимото с частотой выявления 10—12% [133—135] и болезнь Грейвса с распространенностью 1—1,5% [136, 137]. Дисбактериоз считают частой находкой при онкологических заболеваниях ЩЖ: анализ микробиома кишечника методом секвенирования на основе гена 16S рибосомной РНК показал, что его состав при новообразованиях ЩЖ изменен, при этом количество Neisseria и Streptococcus статистически значимо ниже, а Butyricimonas и Lactobacillus выше у больных раком ЩЖ (РЩЖ), что позволяет подтвердить клинический диагноз и в дальнейшем помочь в разработке потенциальных пробиотиков для терапии РЩЖ и узловых новообразований ЩЖ. Из-за повышенного воздействия патогенов на иммунные клетки кишечника последние усиленно продуцируют TNF-α и INF-γ, участвующие в воспалительных реакциях в кишечнике [138, 139], с одной стороны, и вовлеченные в патогенез указанных заболеваний ЩЖ — с другой [140—142].
В литературе представлены также данные об увеличении концентрации зонулина в плазме крови детей с нефротическим синдромом, независимо от лечения и уровня протеинурии. Однако вклад этого белка в механизм повреждения клубочкового аппарата почек должен быть изучен дополнительно [143].
Повышение уровня бактериальных токсинов, концентрации зонулина и провоспалительных цитокинов в сыворотке крови выявлено при различных психоневрологических заболеваниях: синдроме хронической усталости, аутизме, депрессии, шизофрении, болезни Паркинсона [144, 145]. В обзоре, выполненном L. Al-Ayadhi и соавт. (2021) [144], указано, что исследования пациентов с различным спектром аутичных нарушений (расстройства, связанные с аномальным развитием мозга, характерные для плохого социального взаимодействия и общения, ограниченного интереса и повторяющегося поведения пациентов) [146] выявили сопутствующие изменения микробиома (повышение содержания Clostridioides difficile, Candida albicans и снижение содержания Bifidobacterium, Lactobacillus), которые могут вызвать раздражение кишечника за счет изменения уровней бактериальных метаболитов, например, короткоцепочечных жирных кислот, липополисахаридов и бактериальных токсинов в крови и моче у детей с аутизмом. Кроме того, показано значение изменений уровней некоторых белков и низкомолекулярных метаболитов в качестве биомаркеров для раннего обнаружения повышенной кишечной проницаемости. Имеется в виду повышение содержания IL-6, TNF-α, INF-γ, кальпротектина, лизоцима, бета-крезола, пропионовой кислоты, альдегидов, производных индола и растворимого CD14 и снижение уровней зонулина и окклюдина.
Дисбактериоз и воспалительные заболевания кишечника (ВЗК) связаны и с повышенным риском развития болезни Паркинсона (БП) [147, 148]. Недавние исследования показали, что уровни фекальных маркеров воспаления кишечника, например, кальпротектина (обычно используется для диагностики и мониторинга ВЗК) и, возможно, маркеров проницаемости кишечного барьера, например, зонулина, у таких пациентов повышены [149, 150]. Воспалительные сдвиги иммунного профиля стула, сравнимые с таковыми при ВЗК, также описаны при БП [151]. L. Dumitrescu и соавт. (2021) установили, что дисбиоз кишечника превалирует у больных БП и может привести к воспалению и нарушению барьерной функции кишечника. При этом авторы выявили повышенные уровни зонулина и кальпротектина как в сыворотке крови, так и в кале больных БП по сравнению со здоровыми лицами [145].
Предполагается, что нарушения проницаемости кишечной стенки играют важную роль в процессе старения. Выявлено более высокое содержание зонулина у людей пожилого и старческого возраста, сочетавшееся с высоким уровнем провоспалительных цитокинов (TNF-α, IL-6). Все это коррелировало со снижением мышечной силы и физической активности, что косвенно свидетельствует о связи зонулин-зависимой кишечной проницаемости с системным воспалительным ответом и основными признаками старения организма человека. Это положение находит подтверждение в данных о более низком уровне зонулина и эндотоксемии у долгожителей, не имеющих тяжелых заболеваний, по сравнению с молодыми пациентами с острым инфарктом миокарда.
Зонулин в онкологии
Высказана гипотеза о том, что дисрегуляция сигнального пути зонулина может вносить вклад в патогенез различных заболеваний, связанных с нарушением межклеточных коммуникаций, в том числе злокачественной трансформации и метастазирования. Опубликованы лишь единичные исследования о роли зонулина при онкологических заболеваниях. Так, M. Skardelly и соавт. (2009) продемонстрировали увеличение тканевой экспрессии этого белка в глиомах, ассоциированное с повышенной экспрессией маркера c-kit, большей степенью злокачественности опухоли, а также с повреждением ГЭБ и тяжестью заболевания [152].
P. Dowling и соавт. (2007) использовали протеомную технологию для поиска биологических маркеров плоскоклеточного рака легкого. Среди прочих белков, уровень которых повышен в сыворотке крови пациентов, обнаружен и HP [153]. Аналогичные данные для аденокарциномы легкого, также полученные протеомным методом, представили S.H. Heo и соавт. (2007) [154]. Увеличение уровня HP обнаружено также при раке поджелудочной железы [155].
Имеются доказательства того, что пре-HP может быть более эффективным маркером, чем HP, и это показано на экспериментальной модели гепатомы [156]. В частности, доказана способность пре-HP увеличивать экспрессию VEGF и его рецептора VEGFR2, что свидетельствует об участии пре-HP наряду с HP в процессах ангиогенеза. Увеличение уровня модифицированных форм пре-HP в сыворотке крови показано и при раке молочной железы [157].
Следует отметить, что во всех этих исследованиях речь идет не об идентичном зонулину пре-HP-2, а непосредственно о HP или подобных ему пептидах. Таким образом, зонулин как маркер онкологических заболеваний практически не изучен.
Интестинальный барьер представляет собой динамическую систему, чувствительную к различным стимулам, таким как уровень секреции медиаторов воспаления, нейрональные и гормональные сигналы и особенности диеты. К гормональным сигналам условно можно отнести и зонулин, который модулирует состояние слизистой оболочки кишки, ослабляя прочность межклеточных контактов, что характерно для ранней стадии воспалительного процесса. Прочность интестинального барьера могут обеспечивать также другие пептиды, например, глюкагоноподобный пептид-2 и эпидермальный фактор роста (EGF). В регуляции кишечной проницаемости принимает участие также грелин, введение которого экспериментальным животным предотвращало повреждение интестинального барьера, вызываемое доксорубицином. В связи с этим актуальными представляются исследования, в которых изучают связь между сывороточными (циркулирующими) уровнями пептидов, кишечной проницаемостью и симптомами желудочно-кишечных расстройств у получающих химиотерапию пациентов с онкологическими заболеваниями.
F. Russo и соавт. (2013) провели исследование по определению в сыворотке крови пептидов, обеспечивающих межклеточные контакты, у больных раком легкого и кишечными расстройствами на фоне химиотерапии. Результаты определения пептидов сопоставляли с данными исследования проницаемости интестинального барьера на основе теста с лактулозой и маннитолом [158]. Изменение кишечной проницаемости оказалось ассоциированным с EGF и грелином, но не с зонулином, содержание которого в сыворотке крови пациентов с диареей и без диареи не различалось.
В обзоре, выполненном С.Н. Нарыжным и О.К. Легиной (2021), представлены данные о возможности использования пре-HP-2, то есть зонулина, в качестве биомаркера целого ряда патологических процессов, в том числе онкологических заболеваний. В работе этих же авторов продемонстрировано использование пре-HP-2 (зонулина) как биомаркера в диагностике глиобластомы [103].
Методические аспекты определения зонулина
Противоречивость результатов клинической значимости повышенного уровня зонулина в сыворотке крови и его способности отражать состояние барьерной функции кишечной стенки стали поводом для исследований по идентификации белка, определяемого коммерческими тест-системами для ИФА. Так, авторы [111, 159] отмечают, что некоторые коммерческие тест-системы не позволяют определить пре-HP, поскольку выявляемая концентрация маркера не коррелировала с генотипами HP у обследованных пациентов. На основании данных иммуноблоттинга, иммунопреципитации и масс-спектрометрии они считают наиболее вероятным белком, выявляемым с помощью исследованной тест-системы, пропердин, который условно причисляют к семейству белков зонулина.
M. Ajamian и соавт. (2019) также с использованием методов иммуноблоттинга, иммунопреципитации и масс-спектрометрии показали, что коммерческие тест-системы ИФА позволяют определить изо-формы HP, компонент комплемента С3 или пропердин, но не белки семейства зонулина [160]. Однако авторы признают, что результаты проведенных экспериментов не дают окончательного ответа о природе белков, определяемых методом ИФА. Кроме того, они не нашли совпадения и даже четкой корреляции результатов количественного определения зонулина двумя различными коммерческими ИФА системами. Поскольку в настоящее время имеются данные о вероятной роли С3 в формировании проницаемости кишечного барьера, и такую же функцию могут выполнять и некоторые белки из семейства HP, авторы справедливо делают вывод о необходимости проведения дальнейших исследований и осторожности при интерпретации данных, полученных при определении белков семейства зонулина методом ИФА.
В целом проблема специфичности наборов для ИФА содержания зонулина в сыворотке крови проанализирована в обзоре A. Fasano (2020). Основываясь на данных описанных выше исследований, автор предполагает, что в сыворотке крови присутствуют третичные и четвертичные структуры белков (мультимеры), и поэтому наборы, основанные на рекомбинантных белках, не способны определять собственно зонулин, но, возможно, позволяют выявлять другие белки семейства зонулина, которые пока неидентифицированы [101].
Лечение ингибиторами зонулина
Изучение механизмов нарушения кишечной проницаемости, в том числе с использованием сывороточного зонулина, формирует основу для поиска новых путей терапевтического воздействия на ВЗК, направленных на восстановление структуры и функции кишечного барьера, в комплексе с противовоспалительной терапией.
В связи с этим внимание исследователей привлекают ингибиторы продукции зонулина, в частности, пробиотики, влияющие на течение заболеваний. В дополнение к обычным методам лечения применяют несколько питательных веществ, в том числе коровье молозиво [161], яблочный пектин [162], витамины A и D [163], которые модулируют проницаемость эпителиального барьера, что сопровождается снижением уровня зонулина в сыворотке.
Имеются данные, свидетельствующие о способности пробиотиков модулировать проницаемость эпителиального барьера посредством снижения уровня сывороточного зонулина. Так, при проведении метаанализа девяти клинических исследований, включавших 496 пациентов и 443 здоровых лиц, получено подтверждение способности пробиотиков снижать уровень зонулина в сыворотке крови больных колоректальным раком (КРР) с метастазами и без метастазов в печени, при ожирении, неалкогольной жировой болезни печени, мигрени [164]. Однако анализ полученных результатов продемонстрировал высокий уровень гетерогенности данных отдельных исследований, обусловленный различиями в возрасте пациентов, длительности наблюдения, количестве обследованных лиц и характере заболевания. Например, у больных КРР с метастазами в печени уровень зонулина в послеопреационном периоде значительно выше, чем у пациентов без метастазов [165]. Продемонстрировано влияние пробиотиков на развитие послеоперационных инфекционных осложнений у больных КРР. На основании обследования 150 больных, 75 из которых получали плацебо, у пациентов, принимавших пробиотики, отметили существенно меньший уровень инфекционных осложнений в послеоперационном периоде, сочетавшийся со снижением проницаемости кишечного барьера и концентрации сывороточного зонулина [166]. По мнению авторов, эффект пробиотиков может быть связан с несколькими механизмами, среди которых способность лактобактерий активировать TLR2, локализованный на мембране клеток кишечного эпителия. Защитную роль пробиотиков объясняют также ингибированием p38 MAPK — Ser/Thr киназы, участвующей в усилении воспалительного ответа.
Частым осложнением химиотерапии при онкологических заболеваниях являются интестинальные отеки, отражающие повреждение всех отделов желудочно-кишечного тракта. В большей степени это касается тонкой кишки, но могут быть повреждены также пищевод, желудок и толстая кишка. Причина интестинального отека вследствие химиотерапии связана с нарушением проницаемости гастроинтестинального барьера из-за токсичного действия лекарственных препаратов на эпителиальные клетки слизистой оболочки кишки. Цитотоксические вещества повреждают круговорот кишечного эпителия, индуцируют слущивание ворсинок и увеличивают время контакта содержимого кишки с криптами. Эти изменения могут лежать в основе часто встречающихся при химиотерапии симптомов желудочно-кишечных расстройств — диареи и абдоминальных болей.
Использование ряда лекарственных препаратов (ингибиторов протонной помпы (ИПП), антибиотиков) при лечении хронических заболеваний желудочно-кишечного тракта дает ряд побочных эффектов, среди которых ассоциированный с ИПП дисбиоз и/или диарея, ассоциированная с антибиотиками. Количественное и качественное изменение микрофлоры толстой кишки (дисбиоз) при данных состояниях сопровождается выраженным воспалением и повышением проницаемости кишечной стенки. Поэтому при длительной пероральной терапии ИПП, как и при приеме антибиотиков, своевременное определение биомаркеров кишечной стабильности, среди которых существенное значение принадлежит неинвазивному методу оценки фекального зонулина, поможет прогнозировать риск развития грозных желудочно-кишечных осложнений [32, 167, 168].
Обсуждается применение специфического ингибитора зонулина ларазотида ацетата при целиакии [169]. Однако необходима доказательная база эффективности и безопасности этого препарата, т.е. имеются основания для проведения масштабных клинических исследований. Совсем недавно S. Di Micco и соавт. (2021) выявили, что фермент нового коронавируса 3CLpro, или основная протеаза (Mpro), играющая важную роль в репликации вируса, может служить мишенью для разработки антивирусных препаратов [170]. В результате поиска возможных путей влияния на вирус выяснилось, что ингибитор зонулина октапептид АТ 1001, или ларазотид ацетат, связывает каталитический домен (Mpro). Авторы провели исследование по выявлению антивирусной активности АТ 1001 и его производных и показали, что это может стать основой для разработки антивирусных препаратов нового поколения.
Заключение
Зонулин, человеческий гомолог холерного токсина Zot, играет ключевую роль в регуляции проницаемости кишечного барьера, модулируя и ослабляя прочность межклеточных TJ. Он, по-видимому, участвует в патогенезе многих воспалительных и аутоиммунных заболеваний не только кишечника, но и ряда других органов и тканей. В этой связи в последнее время зонулин рассматривают и активно изучают в качестве маркера кишечной проницаемости при различных заболеваниях. Вместе с тем данные литературы о клиническом значении зонулина при гастроинтестинальных заболеваниях и симптомах неоднозначны. По мнению ряда авторов, зонулин следует рассматривать в большей степени как маркер метаболических нарушений, чем как маркер кишечной проницаемости. В любом случае, определение зонулина в сыворотке крови и других биологических средах является полезным инструментом для диагностики, мониторинга, а возможно, и коррекции патологических процессов, связанных с нарушениями кишечной проницаемости, что должно быть изучено в дальнейшем.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.