Тромбоз глубоких вен (ТГВ) — одна из разновидностей венозных тромбоэмболических расстройств, третья из наиболее распространенных причин смерти от сердечно-сосудистых заболеваний после сердечных приступов и инсульта. У пациентов с ТГВ тромбоэмболия легочной артерии (ТЭЛА), рецидивирующие венозные тромбозы и посттромботический синдром являются основными осложнениями и причинами смерти [1]. Зачастую ТГВ протекает бессимптомно, поэтому прижизненная постановка диагноза затруднена. Считается, что заболеваемость ТГВ составляет 80 случаев на 100 000 населения в год. Риск возникновения ТГВ растет с возрастом, заболевание чаще развивается у лиц старше 40 лет [2].

Ранняя и точная диагностика ТГВ позволяет снизить смертность от его осложнений. Ультрасонография и флебография наиболее часто используются в диагностике ТГВ, в частности после оперативных вмешательств. Ультрасонография имеет определенные ограничения [3]. Контрастная флебография инвазивна и увеличивает риск осложнений, включая отрыв тромба, аллергические реакции и т. д., что также ограничивает ее применение. Поиск неинвазивных методов диагностики ТГВ в настоящее время сохраняет актуальность.

Недавние исследования показали, что биомаркеры, включая С-реактивный белок (CRP), D-димер и интерлейкин- (IL)-6, могут представлять ценность при ранней диагностике ТГВ [3, 4]. МикроРНК (miRNAs) являются эндогенными и некодирующими одноцепочечными РНК, состоящими из 18—22 нуклеотидов, которые ингибируют экспрессию генов, способствуя деградации их мРНК-мишеней (mRNAs) или ингибированию трансляции [5]. Доказано, что микроРНК играют существенную роль в различных биологических процессах, включая клеточный цикл, апоптоз, пролиферацию и дифференцировку, регулируя экспрессию около 90% всех генов человека [5]. Большая часть микроРНК экспрессированы внутри самих клеток. Однако во многих биологических жидкостях организма человека были обнаружены многочисленные микроРНК, называемые циркулирующими микроРНК [6]. Циркулирующие микроРНК могут быть секретированы из клеток в биологические жидкости человека в микровезикулах (экзосоах) или могут быть связаны с белками Ago2 [6]. Такие микроРНК устойчивы к воздействию нуклеаз, что делает их потенциальными биомаркерами. Профиль экспрессии циркулирующих микроРНК значительно изменяется (происходят аберрация или дерегулирование) при различных патологических состояниях и отличается от такового в здоровом организме.

Аберрантная экспрессия при ТГВ привлекла внимание исследователей. Обнаруженные изменения экспрессии микроРНК при ТГВ позволяют предположить возможность создания новых диагностических и прогностических маркеров. Анализ генов-мишеней микроРНК мог бы открыть новые горизонты в понимании патогенеза, диагностике и лечении ТГВ. В этой работе мы рассматриваем изменения экспрессии микроРНК и их целевых генов при ТГВ для лучшего понимания их функций и в целях использования их свойств в клинической практике.

Согласно данным литературы, микроРНК контролируют экспрессию нескольких ключевых факторов гемостаза (биогенез и функцию тромбоцитов, факторы свертываемости, антикоагулянтные механизмы и фибринолиз), это указывает на то, что дисрегуляция этих микроРНК может привести к нарушению гемостатического баланса и, соответственно, повышенному тромбообразованию или кровотечению.

Обнаружено, что в клеточной линии HuH-7 гепатоцеллюлярной карциномы происходит активация эндогенной miR-494−3p после терапии β-эстрадиолом (E2), что связано с прямым подавлением экспрессии белка S как на транскрипционном, так и на посттранскрипционном уровне [7]. В исследовании [8] показано, что miR-494−3p нацелен на множество генов-мишеней, включая киназные сигнальные молекулы, факторы транскрипции, регуляторы клеточного цикла, мембранные рецепторы, медиаторы воспаления и регуляторы репликации ДНК. В дополнение ко всему miR-494−3p нацелена на белок S, а miR-27 непосредственно подавляет экспрессию α-ингибитора пути тканевого фактора (TFP1) в клеточных линиях MCF-7 рака молочной железы, что доказывает протромботическую активность miR-27 и miR-494−3p [9].

Тканевый фактор (TF) является решающим фактором инициации коагуляции, и его сверхэкспрессия широко изучалась при онкологических заболеваниях человека, связанных с коагулопатией. Таким образом, неудивительно, что при активном изучении микроРНК-контроля TF было обнаружено, что 7 микроРНК непосредственно ингибируют экспрессию TF и проявляют активность в различных клеточных линиях опухолей. В частности, в клеточных линиях рака молочной железы miR-19 непосредственно контролирует экспрессию TF, а другие члены семейства данной микроРНК, miR-19a и miR-19b, ингибируют TF в клетках рака толстой кишки, а также эндотелиальных клетках и моноцитах соответственно [10—12]. Кроме того, S. Li и соавт. установили, что под влиянием miR-223 с повышенной экспрессией происходит снижение экспрессии TF и ингибирование экспрессии фактора некроза опухоли-α (TNF-α) in vitro и in vivo. Это исследование демонстрирует miR-223-опосредованное подавление экспрессии TF, указывая на новый молекулярный механизм контроля каскада коагуляции и предлагая новые подходы к подавлению [13]. Зависимость между miR-93, miR-106 и TF была замечена в клетках лейомиом, где подавление уровней экспрессии miR-93 и miR-106 и связанное с этим увеличение экспрессии TF способствовали воспалительным и обменным процессам в клетках опухоли [14]. Показано, что в эндотелиальных клетках микроциркуляторного русла человека miR-19a и miR-126 модулируют тромбогенность эндотелия посредством прямого ингибирования экспрессии и активности TF [15]. Изменения в уровнях экспрессии miR-19a и miR-126 были вызваны воспалительным стимулом TNF-α. Так выглядит механизм, опосредованный микроРНК, и стимулирующий тромбогенез при аутоиммунных нарушениях, таких как антифосфолипидный синдром (АФС). В моноцитах пациентов с АФС и системной красной волчанкой (СКВ) наблюдали значительно меньшие уровни экспрессии эндогенных miR-19b и miR-20a, чем у здоровых людей, при этом эти уровни обратно коррелировали с уровнем TF в соответствующих моноцитах. Таким образом, наблюдения показали роль miR-19b и miR-20a в состоянии гиперкоагуляции, наблюдаемом у пациентов с АФС и СКВ. Также обнаружено, что активация или ингибирование miR-20a в клетках THP-1 (моноцитарная клеточная линия человека, полученная от пациентов с острой моноцитарной лейкемией) влияли на прокоагулянтную активность на поверхности клеток [16]. Для микроРНК также была идентифицирована связь с ингибитором активатора плазминогена-1 (PAI-1), ключевого модулятора фибринолитического пути [17]. Недавно было выявлено увеличение экспрессии PAI-1 и образование тромбов, связанное с уменьшением экспрессии miR-30c у пациентов с сахарным диабетом 2-го типа [18]. Образование фибрина может находиться под контролем miR-409−3p, которая была идентифицирована через скрининг библиотеки микроРНК (miRNA library screen) в клетках HuH-7, непосредственно нацелена на изменение экспрессии β-полипептида фибриногена (FGB). При сверхэкспрессии miR-409−3p происходит уменьшение образования фибриногена в клетках HuH-7 [19]. Эти данные свидетельствуют о том, что рост и устойчивость тромбов могут быть подвержены микроРНК-опосредованной регуляции фибринолиза через PAI-1 и синтеза фибриногена.

В настоящее время молекулярные механизмы патогенеза ТГВ изучены не полностью, что значительно ограничивает создание новых диагностических и прогностических маркеров ТГВ. Поэтому для оценки диагностического потенциала опеределения циркулирующих микроРНК важно понимать механизмы влияния эндогенных микроРНК на патогенез ТГВ.

Процесс лизиса тромба и восстановление венозной стенки связаны с провоспалительными цитокинами, хемокинами и лейкоцитами. В своей работе C. Bao и соавт. [20] исследовали количество воспалительных клеток в стенке вен крыс с моделированным ТГВ нижних конечностей. Экспрессия PAI-1 повысилась одновременно с повышением количества воспалительных клеток, что указывает на то, что экспрессия PAI-1 влияет на воспалительный процесс при ТГВ. PAI-1 является ключевым ингибитором фибринолиза и играет важную роль в воспалительном процессе. В ходе эксперимента было обнаружено, что miR-335−5p подавляет экспрессию PAI-1 посредством ингибирования сигнального пути Toll-подобного рецептора 4 (TLR4) in vivo, важного компонента повреждения сосудистой стенки в условиях воспаления. Это указывает на то, что эта микроРНК может подавлять развитие и прогрессирование ТГВ. Q. Meng и соавт. [21] также обнаружили снижение экспрессии miR-495 в периферической крови пациентов с ТГВ, а применение miR-495 mimic (мимики или mimics — синтетические олигонуклеотиды, повышающие экспрессию целевой микроРНК) ингибировало тромбообразование в глубоких венах нижних конечностей посредством подавления STAT3 (преобразователь сигналов и активатор транскрипции 3) in vivo. STAT3 играет важную роль в окислительном стрессе, в клеточных функциях (кардиомиоциты, эндотелиальные клетки, клетки-предшественники) и ангиогенезе. В других работах было показано, что miR-126 и miR-483−3p способствуют реканализации тромбированных вен эндотелиальными клетками-предшественниками посредством подавления экспрессии генов PIK3R2 и SRF in vitro и in vivo. MiR-126 и miR-483−3p могут представлять собой потенциальные маркеры, значимые при диагностике, прогнозировании и определении возможных терапевтических мишеней у пациентов с ТГВ, но все это требует дальнейших исследований [21, 22].

Накопленные в последние годы знания свидетельствуют о том, что ТГВ тесно связан с фиброзным ремоделированием стенок вен, которое заключается в переключении фенотипа сосудистых гладкомышечных клеток (СГМК) с сократительного на синтетический, с пролиферацией СГМК, осаждением коллагена и повреждением внеклеточного матрикса (ВКМ) матриксными металлопротеиназами (MMP). Совсем недавно участие ММР вместе с ингибиторами металлопротеиназ в механизме ТГВ признано значимым и активно обсуждается. Например, K. Deatrick и соавт. [23] обнаружили, что у мышей с ТГВ, у которых отсутствует или снижена экспрессия MMP-9, увеличивается экспрессия TNF, белка хемоаттрактанта моноцитов 1 и PAI, в то время как экспрессия коллагена, IL-1 и TGF в стенке вен уменьшалась. Это указывает на то, что MMP-9 может играть роль в развитии фиброза стенки вены после ТГВ [23]. МикроРНК также контролируют экспрессию ММР. Кроме того, S. Franciscis и соавт. [24] сообщили, что высокий уровень MMP в плазме, включая MMP-1, -2, -3, -7, -8 и -9, наблюдали у пациентов с острым ТГВ и установили, что MMP и контролирующие их микроРНК могут быть специфическими биомаркерами ТГВ. В исследованиях P. Аi и соавт. [25] наблюдалось снижение экспрессии miR-411, в то время как экспрессия индуцируемого гипоксией фактора-1α (HIF-1α), а также экспрессия MMP-2 были увеличены в стенках вен и соответствующих СГМК, полученных от крыс с ТГВ. HIF-1α играет важную роль в клеточной пролиферации, миграции и дифференцировке, вазоконстрикции или вазодилатации, деградации ВКМ и ангиогенезе. Также был применен miR-411 mimic, где результат ясно показал, что miR-411 подавляет фиброз стенки вены при ТГВ у крыс.

Эндотелиальный оксид азота (NO) регулирует ряд физиологических процессов, таких как адгезия и агрегация тромбоцитов, что может повлиять на склонность или устойчивость к тромбозу. Имеются данные о том, что уровень экспрессии эндотелиальной синтазы оксида азота (NOS₃), которая играет важную роль в синтезе NO, был значительно снижен в клеточных линиях MVEC (культивированные эндотелиальные клетки микрососудистого русла) под воздействием сверхэкспрессии miR-195 и miR-582. Ингибирование miR-195 и miR-582 antagomirs (антагомиры — синтетические олигонуклеотиды, ингибирующие целевую микроРНК) в эндотелиальных клетках могло способствовать повышению экспрессии NOS₃, что указывает на то, что эндогенные miR-195 и miR-582 подавляли экспрессию NOS₃. То есть miR-195 и miR-582 вызывают дисфункцию эндотелия и, регулируя сосудистый гомеостаз, в конце концов могут привести к тромбообразованию в артериях и венах [26].

Эти исследования содержат информацию о взаимосвязи микроРНК с их генами-мишенями при ТГВ, что дает основу для будущих исследований микроРНК как биомаркеров и терапевтических мишеней.

В многочисленных исследованиях предпринимались попытки найти точные и ранние диагностические лабораторные биомаркеры при ТГВ. Однако на сегодняшний день плазменный D-димер является единственным хорошо зарекомендовавшим себя и клинически применимым биомаркером для идентификации ТГВ. Тест D-димера отражает уровень деградации фибрина. Отрицательный результат D-димера является убедительным доказательством для исключения ТГВ, но положительный результат имеет низкую специфичность и низкое положительное прогностическое значение для диагностики ТГВ [27]. Концентрация D-димера также может быть повышена при нетромботических нарушениях, включая диссеминированное внутрисосудистое свертывание (ДВС-синдром), инфекцию и инсульт [28]. В последние годы одним из наиболее перспективных новых биомаркеров называют растворимый P-селектин, который имеет более высокую специфичность, чем D-димер, в диагностике ТГВ [29]. Но все же D-димер и P-селектин отдельно или в комбинации не обладают высокой чувствительностью или специфичностью при диагностике ТГВ.

МикроРНК в качестве биомаркеров ТГВ менее изучены, хотя циркулирующие микроРНК могут оказаться более чувствительными и точными в диагностике ТГВ. За последнее время проведен ряд исследований, показавших, что циркулирующие микроРНК более предпочтительны в качестве биомаркеров, поскольку высокостабильны в биологических жидкостях человека, таких как кровь, могут быть обнаружены на ранних этапах развития заболевания, тогда как белковые структуры обнаруживают в крови только тогда, когда повреждение уже произошло. Кроме того, они играют роль практически во всех клеточных функциях [30, 31].

В своей работе Z. Li и J. Ni [32] продемонстрировали снижение экспрессии miR-26a в периферической крови пациентов с травмами костей и диагностированным ТГВ нижних конечностей. Кроме того, результаты настоящего исследования на клеточных культурах HUVECs (эндотелиальные клетки пупочной вены человека) показали, что miR-26a нацелена на протеинкиназу С-дельта (PRKCD) и ингибирует активацию сигнального пути ядерного фактора каппа-B (NF-κB), тем самым подавляя экспрессию цитокинов CCL2 (C-C motif ligand 2) и CCL7 (C-C motif ligand 7), ослабляя местный воспалительный ответ. Предыдущие результаты показали, что PRKCD активирует путь сигнала NF-κB и способствует экспрессии и высвобождению CCL2 и CCL7, которые способны рекрутировать воспалительные клетки при определенных поражениях, способствуя выделению местных воспалительных факторов, и усугублять воспалительный ответ [33, 34]. X. Wang и соавт. [35] обнаружили, что среди исследуемых 13 микроРНК в плазме крови экспрессия miR-424−5p была значительно выше, тогда как уровни экспрессии miR-136−5p были значительно ниже у пациентов с ТГВ по сравнению с пациентами без ТГВ. Уровень экспрессии циркулирующей miR-424−5p был связан с гиперкоагуляцией. Роль miR-136−5p и miR-424−5p в механизме ТГВ не была полностью понятна. Предыдущее исследование [36] показало, что miR-424 регулирует важные клеточные функции, включая дифференцировку, пролиферацию, клеточный цикл. Сообщалось, что miR-424 активируется после повреждения сосудистой стенки, а также регулирует ангиогенные факторы эндотелия путем нацеливания на рецептор-2 фактора роста эндотелия сосудов (VEGFR-2) и рецептор фактора роста фибробластов-1 (FGFR-1). Сверхэкспрессия miR-424 может уменьшить пролиферацию, миграцию эндотелиоцитов и формирование капиллярной трубки [37]. Как известно, регенерация и васкулогенез эндотелиоцитов способствуют образованию и разрешению тромбов. Изменение уровня экспрессии miR-424 при ТГВ соответствует его биологической функции.

В работе J. Qin и соавт. [38] систематически измеряли концентрацию 3 циркулирующих микроРНК (miR-582, miR-195 и miR-532) в сыворотке у пациентов с ТГВ после ортопедического хирургического вмешательства в контрольной группе. Было обнаружено, что экспрессия этих микроРНК была значительно повышена в сыворотке у пациентов с ТГВ. Кроме того, анализ кривой ROC показал сильную взаимосвязь между тремя микроРНК и ТГВ. Кроме того, X. Xie и соавт. [39] продемонстрировали связь между циркулирующей miR-96 и D-димером в плазме у пациентов с ТГВ после ортопедического вмешательства. Увеличенные уровни экспрессии miR-96 коррелировали с уровнями D-димера в плазме у пациентов с ТГВ после операции. Однако, хотя уровни экспрессии miR-96 были также увеличены в группе пациентов без ТГВ после операции, уровни экспрессии miR-96 не коррелировали с уровнями D-димера плазмы. Одновременное обнаружение повышенных уровней экспрессии miR-96 и D-димера может способствовать более точной диагностике ТГВ после операций.

В исследовании Z. Jiang и соавт. [40] была обнаружена высокая экспрессия циркулирующей miR-320b в плазме у пациентов с ТГВ по сравнению со здоровыми людьми. Анализ ROC-кривой показал, что циркулирующая miR-320b имеет диагностический потенциал с точностью 79% (чувствительность 69% и специфичность 90%) при ТГВ. Кроме того, повышенный уровень miR-320b в плазме коррелировал с уровнем D-димера. Примечательно, что семейство эндогенной miR-320 наиболее экспрессировано в тромбоцитах человека, тогда как циркулирующая miR-320b могла быть, возможно, через экзосомы перенесена в эндотелиальные клетки с контролем экспрессии молекул межклеточной адгезии 1-го типа (ICAM-1), что указывает на потенциальную роль действующих внеклеточных коммуникаций [41].

ТЭЛА, являясь серьезным осложнением ТГВ, относится к числу частых неотложных состояний и остается важной медицинской проблемой. Ранняя диагностика, основанная на изучении изменения экспрессии циркулирующих микроРНК, позволяет своевременно начать терапию и значительно улучшить прогноз больных с ТГВ. Ранее опубликованные исследования показали, что микроРНК могут быть потенциальными биомаркерами для диагностики ТЭЛА. Исследование X. Zhou и соавт. [42] продемонстрировало, что циркулирующая miR-28−3p в плазме у пациентов с ТЭЛА может использоваться в качестве неинвазивного и стабильного диагностического биомаркера. J. Xiao и соавт. [43] показали, что уровень экспрессии miR-134 в плазме был значительно повышен у пациентов с ТЭЛА по сравнению со здоровой контрольной группой, это указывает на то, что циркулирующая miR-134 может быть предиктором ТЭЛА у пациентов с ТГВ. Результаты другого исследования [44] показали, что количество циркулирующей miR-221 в плазме было также значительно увеличено у пациентов с ТЭЛА по сравнению со группой здоровых людей. Однако эти предварительные результаты требуют дальнейших исследований с более крупными выборками. В своей работе T. Kessler и соавт. [45] показали повышенный уровень экспрессии miR-1233 в сыворотке у пациентов с ТЭЛА по сравнению с контрольной группой. Они продемонстрировали, что высокий уровень экспрессии циркулирующей miR-1233 позволяет с высокой специфичностью (100%) и чувствительностью (90%) отличить пациентов с ТЭЛА от пациентов с острым инфарктом миокарда без подъема сегмента ST и от здоровых людей. Следовательно, этот параметр является многообещающим маркером для точной диагностики ТЭЛА. Концентрации циркулирующих miR-27a и miR-27b в плазме были значительно выше у пациентов с ТЭЛА по сравнению с контрольной группой. Анализ кривой ROC (AUC) для miR-27a и miR-27b у этих пациентов показал значения 0,784 и 0,707 соответственно. Комбинация miR-27a или miR-27b с D-димером значительно увеличивала диагностическую способность этого маркера при ТЭЛА [46].

В исследованиях последних нескольких лет показано, что микроРНК служат модуляторами гемостаза. Понимание механизма, с помощью которого микроРНК участвуют в развитии тромбоза, особенно важно, поскольку может быть применено в клинической практике. Циркулирующие микроРНК обладают огромным потенциалом как идеальные биомаркеры для использования в диагностике и прогнозировании венозных тромбозов. Тем не менее существует ряд ограничений, например недостаточное количество исследований, посвященных изучению циркулирующих в крови микроРНК при ТГВ, и небольшие размеры выборок. Другое ограничение проистекает из того, что тромбоз — это динамический процесс, который претерпевает влияние множества факторов, таких как первичные заболевания, время отбора проб и профилактическая антикоагуляция. Следовательно, существует клинически значимая гетерогенность среди исследуемых. Неизбежно возникают проблемы, связанные с тем, что одна микроРНК может иметь сотни генов-мишеней и один ген может быть мишенью множества микроРНК. Образование тромба в венозной системе является довольно сложным процессом, находящимся под контролем множества микроРНК. Очень важно, но чрезвычайно сложно определить точные механизмы, регулируемые конкретными микроРНК, поэтому необходимы дальнейшие исследования данной проблемы.

Информация о спонсорстве. Работа выполнена при финансовой поддержке гранта Республики Башкортостан молодым ученым от 5.02.19 №УГ-28.

Financing. The work was carried out with the financial support of the grant of the Republic of Bashkortostan to young scientists dated February 5, 2019.

Участие авторов:

Разработка дизайна исследования — И.Г.

Обзор публикаций — И.Г.

Анализ полученных данных — И.Г.

Написание текста рукописи — И.Г.

Редактирование текста статьи — О.Б.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflict of interest.

Сведения об авторах

Гареев И.Ф. — https://orcid.org/0000-0002-4965-0835; e-mail: ilgiz_gareev@mail.ru

Бейлерли О.А. — https://orcid.org/0000-0002-6149-5460

КАК ЦИТИРОВАТЬ:

Гареев И.Ф., Бейлерли О.А. Диагностический и прогностический потенциал микроРНК при тромбозах глубоких вен. Флебология. 2019;13(4):-324. https://doi.org/10.17116/flebo201913041

Автор, ответственный за переписку: Гареев И.Ф. —
e-mail: ilgiz_gareev@mail.ru

Автор, ответственный за переписку: Гаврилов С.Г. —
e-mail: gavriloffsg@mail.ru