Прогресс медицины подразумевает применение высокотехнологичных средств диагностики, использование передовых методов лечения, разработку новых высокоэффективных лекарственных производных. Прорыв в создании терапевтических препаратов был вызван их молекулярным конструированием на основе белков и других высокомолекулярных соединений.
Рассмотрение белков как свернутых определенным образом цепей макромолекул показало наличие на их поверхности функциональных групп аминокислотных остатков, экспонированных наружу и пригодных для химической модификации с целью получения белковых производных с увеличенной стабильностью для практического использования. Настоящий обзор касается водорастворимых модифицированных белковых средств медицинского назначения.
Создание модифицированных белковых производных было инициировано в рамках концепции направленного транспорта лекарств [1]. Расширение границ этих исследований привело к формированию междисциплинарного изучения биоконъюгатов для медицинского применения [2—4].
Цель обзора — демонстрация перспективности разработки модифицированных ферментов для терапии нарушений разного генеза, в том числе кардиологического профиля.
Методы получения биоконъюгатов
Множество модифицированных форм биокатализаторов не могло появиться без разнообразных способов их получения. Первоначально использовалась химическая модификация, затем сайт-направленный мутагенез, их комбинация, формирование терапевтических наносистем, что способствовало накоплению значительного количества модифицированных белковых производных. Среди них со временем сформировалась группа конъюгатов антитело-лекарство. Для этого была разработана технология гликосвязывания (GlycoConnect), осуществляемая в две стадии [5]. Первую проводят ферментативным ремоделированием (триммингованием и мечением азидом) N-гликанового компонента, расположенного по позиции Asp-297 антител (изотип IgG). Вторую стадию последующего связывания лекарственного соединения с предобработанным антителом выполняют химическим методом быстрого присоединения (copper-free click chemistry). Полученные конъюгаты моноклональных антител демонстрируют высокую стабильность и эффективность, обещающие достижение их преимущественного терапевтического индекса. Конъюгированием антител с галактозой получали производные для изучения их применения в регионарной или системной иммунотерапии [6]. Конъюгаты галактоза-антитело не перекрывали две функции антител в дополнение к связыванию антигена, а именно цитотоксичность, опосредованную системой комплемента, и зависимую от антител клеточную цитотоксичность. Конъюгирование овальбумина и лизоцима с галактоманнаном (посредством реакции Мейларда) увеличивало антиоксидантный эффект овальбумина (благодаря повышению его липидной аффинности) и антимикробиальную активность лизоцима [7]. Значимость сохраняемой компонентами конъюгата активности (после его получения) определяет дальнейшую перспективу продолжения биомедицинского исследования нового белкового производного. Поэтому был предложен подход с реактивацией, потерянной конъюгатом при его приготовлении активности [8]. Сайт-направленным мутагенезом получали мутантную форму пирофосфатазы с заменой на остаток цистеина консервативного остатка Lys-148, расположенного вблизи активного центра фермента и экспонированного на молекулярной поверхности белка. Введенный остаток цистеина модифицировался п-хлормеркурибензоатом или поли (2-гидроксиэтил-метакрилатом), что вызывало явное снижение или полную потерю активности фермента. Она может быть в разной степени ренатурирована обработкой модифицированного белка восстанавливающими реагентами. Указанная обработка вызывает диссоциацию модификаторов (п-хлормеркурибензоатом или поли (2-гидроксиэтил-метакрилатом)) от фермента с восстановлением его активности. Таким образом, предлагается новая стратегия эффективного контроля белковой активности на разных уровнях сайт-специфического конъюгирования фермента с малыми молекулами и полимерами [8].
Следует отметить, что модификация бычьей панкреатической рибонуклеазы гидрофильным поли[N-(2-гидроксипропил)метакриламидом] позволила получить белковые конъюгаты (с классическим и звездчатым полимером), обладающие выраженной антиопухолевой активностью (на модели меланомы у мышей), реализуемой после 10 внутривенных введений доз 5 или 1 мг/кг (соответственно) [9].
Влияние низко-, высокомолекулярных, наноструктурных модификаторов на свойства ферментов и вопросы продвижения таких производных
Появление множества модифицированных ферментов лечебного назначения обусловлено многообразием используемых для их получения модификаторов и способов модификации (низко- и высокомолекулярных соединений, связывания ферментов друг с другом, создания наноансамблей). При этом перспектива объединения малых молекул и биологических лекарств затруднена необходимостью одновременного рассмотрения как их аналитических параметров, так и регулирующего законодательства для разрабатываемых конъюгатов антитело-лекарство [10]. Обсуждаются параметры идентичности проб производного для тестирования и контроля качества, эффект действенности конъюгатов, их гетерогенность, допустимость примесей, референсные стандарты, определение разных видов стабильности и др. Развитие технологий конъюгатов антитело-лекарство опирается на использование коротких связывающих (линкерных) молекул, присоединение к антителу от 3 до 7 молекул лекарства, безопасность получения целевых продуктов [11]. Сложность конъюгирования белков с синтетическими наноносителями может упрощаться использованием полиэтиленгликоль (ПЭГ)-функциональных наноструктур, связанных с биспецифическими антителами [12]. Двойная специфичность этих антител к метокси-ПЭГ-эпитопам и мишеням раковой патологии (как рецептор эпидермального фактора роста) приводит к тому, что они лучше накапливаются опухолевыми клетками в сравнении с ненацеленными наноматериалами.
Разнообразные методы модификации ферментов улучшают фармакологические свойства белков (увеличивают время их полужизни в кровотоке, накапливают в очаге поражения, «прививают» полезную сопутствующую лечебному действию активность и др.) и устраняют недостатки (сниженную стабильность in vivo, повышенную ингибируемость, заметную иммуногенность и др.). Метоксиполиэтиленгликоль п-нитрофенил-карбонат (с молекулярной массой 5 kDa) был использован для модификации лизоцима с сохранением его значимой остаточной активности (77%), молекулярной структуры, устойчивости к протеолизу и стабильности при 50 °C [13]. Сверхэкспрессия гиалуронансинтазы 3 способствовала ускоренному росту раковой опухоли панкреатической железы с избыточным внеклеточным накоплением гиалуронана [14]. Конъюгат пэгилированной рекомбинантной гиалуронидазы человека ингибировал эти изменения (наблюдалось снижение адгезии эпителиальных клеток) и подавлял опухолевый рост. Для повышения молекулярной гомогенности получаемого продукта (благодаря осуществлению специфического взаимодействия с Gln, представленным обычно одним или двумя остатками в аминокислотной цепи выбранного белка) предлагается метод ферментативного пэгилирования белков трансглутаминазой [15]. Систему направленной доставки цитостатиков получали на основе комбинации Zn-порфирин-циклодекстринового носителя и иммуноглобулинов, образующих супрамолекулярный координационный комплекс [16]. На мышиной модели С32 карциномы человека были показаны его терапевтические преимущества перед эффектом составляющих его компонентов. Новую иммуногенную систему для технологического производства вакцин получали ковалентным присоединением бычьего сывороточного альбумина к поли (N-изопропилакриламид-ко-акриловой кислоте) с использованием водорастворимого карбодиимида [17]. В зависимости от соотношения весовых концентраций альбумина и полимерного носителя образуется два типа конъюгатов: белок в плотном полимерном окружении в структуре частицы конъюгата или частицы конъюгата, имеющие более рыхлую структуру, в которой белок практически экспонирован в растворитель. Ковалентное присоединение низкомолекулярного гепарина к Cu, Zn-супероксиддисмутазе способствовало получению ферментного термостабильного конъюгата с резистентностью к действию низких и высоких значений рН среды и устойчивостью к трипсиновому протеолизу [18]. Для преодоления резистентности к действию рекомбинантной аргининдеиминазы при аргинин-ауксотрофическом раке использовали конъюгирование этого фермента с С-концом гепаринсвязывающего гемагглютининового белка адгезии через N-сукцинимидилпиридилдитиопропионат (SPDP) или рекомбинантным сочетанием компонентов [19]. В результате клеточный захват конъюгатов увеличивался, что восстанавливало эффективность лечения аргининдеиминазой на MCF-7-клетках. Подобные конъюгаты могут выступать как новый класс антиопухолевых ферментов с внутриклеточным механизмом действия, независимым от экспрессии аргининсукцинатсинтетазы. Для повышения внутривенной доставки L-аспарагиназы этот фермент ковалентно конъюгировали с жирными кислотами (с длиной цепи С12, С16 и С22) [20]. Конъюгированная аспарагиназа оказалась более резистентной к протеолизу, более стабильной при разных значениях рН и имела пролонгированное время полужизни в сравнении с нативной формой, что перспективно для биомедицинского исследования такого производного.
Интересный метод получения in vivo конъюгата альбумина с пептидным ингибитором продемонстрирован после модификации пептида 3-малеимидопропионовой кислотой [21]. Такая модификация придает пептиду способность взаимодействовать с тиольной группой альбумина посредством малеимида с образованием специфического 1:1 пептид-альбуминового конъюгата. Внутривенно введенный крысам модифицированный пептид оказался конъюгированным in vivo с эндогенным альбумином, открывая перспективу апробации указанного способа получения конъюгатов в самом организме с долгодействующим, безопасным и эффективным пептидным ингибитором. Это обещает достоверное снижение стоимости лечения, улучшенное воздействие на патологический процесс и повышение качества жизни пациента [21].
Разнообразные методы модификации ферментов (химических и генно-инженерных) позволили получить совокупность модифицированных белковых средств медицинского назначения. Ковалентное связывание ферментов с полимерами или малыми молекулами повышает стабильность [2, 3, 5, 13], время их удержания в кровотоке [14, 15, 17] и направлено против разнообразных патологий. Эффект первого уровня, т. е. определенный на начальных этапах последовательного изучения, проявляется благодаря многоточечному (мультиконтактному) взаимодействию белковой молекулы с модификатором. В результате модификации ферментов высокомолекулярными соединениями происходит протяженная «обшивка» их структуры полимерами, увеличивающая стабильность структуры ферментных производных. По центрам белковой модификации низкомолекулярными соединениями могут развиваться дополнительные взаимодействия, повышающие эффективность лечебного использования таких производных. Направленный мутагенез оптимизирует аминокислотный состав белковой цепи, а воздействие наноструктур способствует дозированному выделению активного начала и приданию терапевтическому производному новых полезных свойств. Достижение этого эффекта не имеет пока универсальных принципов осуществления и проверяется эмпирически. Для выявления общих правил конструирования лечебных ферментных средств применяются методы компьютерного моделирования. Экспериментальная оценка данных модификации ферментов связана с тем, что при этом может происходить как стабилизация биокатализатора, так и инактивация ферментов, вызванная воздействием агентов микроокружения (рис. 1).
Для снижения потерь ферментативной активности при модификации предлагаются мягкие методы ее проведения, регулирование активности на разных стадиях сайт-специфического конъюгирования [8] и проведение связывания компонентов in vivo (в самом организме) [21] с сохранением достоверной фармакологической активности лекарственного начала. Именно остаточная активность определяет перспективность разработки новых модифицированных белковых терапевтических средств.
Таким образом, использование разнообразных модификаторов направлено на сохранение ферментами их каталитически активной структуры для достижения достоверной и высокой лечебной эффективности этих производных. Обилие и широта накопленных результатов такой базы данных модификации ферментов позволяет целенаправленно использовать ее для получения конкретных производных биокатализаторов с тщательным контролем их иммунологических и токсичных свойств в рамках комплексных биофармацевтических разработок.
Возможность ликвидации и блокирования отмеченных выше клинических нарушений разрабатываемыми биохимическими средствами повышает значимость методов вычислительной химии в конструировании новых лекарственных производных высокомолекулярной природы.
Ферментные производные, противодействующие окислительному стрессу
Развитие многих патологий инициируется и сопровождается окислительным стрессом. Это обусловило интенсивное исследование и применение антиоксидантов, особенно в кардиологии. Наиболее эффективными являются антиоксидантные ферменты — супероксиддисмутаза (СОД), каталаза (КАТ), глутатионпероксидаза [3, 24]. Обнаружена связь между сосудистым воспалением, дисфункцией эндотелия, риском сердечно-сосудистых нарушений и окислительным стрессом [25]. Отмечаются патофизиологическая роль окислительного стресса при систолической и диастолической сердечной недостаточности [26], действие окислительного стресса как ключевого механистического медиатора при гипертензии [27]. Снижение окислительного стресса у пациентов с инфарктом миокарда с подъемом ST-сегмента на электрокардиограмме (STEMI) способствовало эффективности применяемой терапии [28].
Для усиления антиоксидантного эффекта против патологического действия окислительного стресса СОД и КАТ были модифицированы фолиевой кислотой посредством ее активации карбодиимидом. В результате увеличились захват модифицированных ферментов активированными макрофагами и активность биокатализаторов [29]. Повышение термостабильности СОД, ее устойчивости к действию экстремальных рН, трипсинолиза достигалось модификацией фермента низкомолекулярным гепарином [18]. Лечение диабетических крыс конъюгатами СОД с полимерами укрепляло антиоксидантный статус животных [30]. Достоверное снижение травматического мозгового поражения у мышей было достигнуто после введения конъюгата каталазы с антителами против молекулы межклеточной адгезии-1 (по сравнению с действием каталазы и антител по отдельности) [31]. Отмеченные подходы нацелены на получение модифицированных форм на основе антиоксидантного биокатализатора одного вида.
С развитием нанотехнологий для предупреждения и ослабления окислительного стресса стали предлагаться супрамолекулярные ансамбли с разной антиоксидантной активностью [32]. Они служат для доставки антиоксидантных ферментов, проявления эффекта собственной антиоксидантной активности и ограничения пространства антиоксидантных взаимодействий. Комбинации биомолекул в таких ансамблях обеспечивают их мультифункциональность, быстродействие и нацеленность на очаг поражения. Для предупреждения нейродегенеративных заболеваний предлагаются наночастицы с антиоксидантной активностью [33]. Это новый этап развития антиоксидантной терапии для предупреждения и лечения заболеваний, сопровождающихся окислительным стрессом.
Обнаружена КАТ- и СОД-активность антител (IgG) у пациентов с вторично-прогредиентной формой рассеянного склероза как компенсаторный ответ на снижение активности антиоксидантных ферментов в клетках больных с этим заболеванием нервной системы [34]. Подчеркнем значимость интервала эффективных доз антиоксидантов, поскольку обработка ими (в больших концентрациях) клеточных культур (мезенхимальные стволовые клетки эндометрия человека) на стадии G0/G1 клеточного цикла замедляет инициацию синтеза ДНК и блокирует клетки в поздней G1-фазе цикла без генотоксического эффекта [35]. При антиоксидантной обработке клеток на стадии синтеза ДНК происходит дозозависимое образование разрывов ДНК, замедление стадии синтеза и блокирование клеток в фазе G2/M. Отмеченный генотоксический эффект пролиферирующих клеток позволяет авторам вводить понятие антиоксидантного стресса, когда понижение физиологически обусловленного уровня активных форм кислорода в клетках с увеличенным уровнем антиоксидантов приводит к нарушению системного сигналинга и регуляции жизненно важных процессов.
Для нацеленной доставки СОД и КАТ к эндотелию используется специфический наноноситель PACkET [36]. КАТ, встроенная в PACkET, эффективно защищает эндотелиальные клетки от повреждения пероксидом водорода, смягчает отек легких и уменьшает инфильтрацию лейкоцитов на мышиной модели легочного поражения, вызванного эндотоксином. СОД, связанная с PACkET, смягчает индуцированную цитокинами провоспалительную активацию эндотелия и вызванное эндотоксином воспаление легких. Получение нанозима электростатическим связыванием СОД 1 с катионным блок-сополимером (поли (L-лизин)-поли (этиленгликоль)) с последующим ковалентным сшиванием комплекса натриевой солью 3,3’-дитиобис (сульфосукцинимидилпропионата) позволило получить производное, более эффективное (в сравнении с нативным ферментом) в снижении проявлений увеита у кроликов [37]. Результаты перспективны для потенциального лечения глазных воспалительных нарушений. Использование наноносителей оказалось продуктивным для повышения эффективности экспериментальной терапии как отдельными видами ферментов, так и их комбинациями.
Сочетанное применение антиоксидантных биокатализаторов более эффективно, чем по отдельности. Это обусловлено большей глубиной антиоксидантного действия комбинации ферментов и получением при этом вполне безопасных продуктов. Сопряженное действие СОД и КАТ ведет к нейтрализации супероксид-радикала и детоксификации пероксида водорода с образованием молекулярного кислорода и воды:
Конъюгирование СОД с КАТ через гликозаминогликан эндотелиального гликокаликса хондроитинсульфат привело к получению биферментного производного супероксиддисмутаза-хондроитинсульфат-каталаза (СОД-ХС-КАТ) внеклеточного действия [38]. Полученный конъюгат обладал сопряженной активностью антиоксидантных ферментов СОД и КАТ, связанных друг с другом через ХС, содержание которого в зонах атеросклеротического поражения сосудов заметно увеличивается, способствуя сродству биферментного производного к потенциальным очагам атеросклеротического и воспалительного поражения сосудистой стенки. Надмолекулярная структура СОД-ХС-КАТ определила его в разряд нанообъектов. Физические, химические, биологические свойства нанообъектов приобретают уникальный, а иногда и неожиданный характер, в частности из-за квантово-механического эффекта, привносимого этими структурами. Приобретенная биферментным конъюгатом надмолекулярная структура превращала его в наночастицу, свойства которой зависели от ее молекулярного размера. Производное СОД-ХС-КАТ ингибировало агрегацию тромбоцитов, индуцированную различными по механизму действия агентами (аденозиндифосфатом, серотонином, пептидным агонистом тромбинового рецептора), тогда как нативные СОД и КАТ, свободный ХС таким эффектом не обладали [38]. Вклад в ингибирование тромбоцитарной агрегации вносила и ферментативная активность СОД-ХС-КАТ, и приобретенная им наноструктура. В отношении агрегации тромбоцитов наноконъюгат СОД-ХС-КАТ проявил свойства наночастицы. Отмечалось и высокое антитромботическое действие производного: его эффективность проявлялась в дозах, на два порядка меньших, чем для нативных СОД и КАТ, и на порядок меньших для их модифицированных ХС-форм, введенных как по отдельности, так и в смеси. Важно подчеркнуть, что ковалентное конъюгирование СОД с КАТ обеспечивало одновременное присутствие СОД- и КАТ-активности в очаге поражения, что не достигалось при введении разнообразных смесей ферментных производных [39]. Повышенная выживаемость животных при эндотоксическом шоке у крыс (индуцированном внутривенным болюсом липополисахарида) наблюдалась при использовании биферментного конъюгата СОД-ХС-КАТ, причем не только при превентивном, но и при лечебном (введение терапевтика после введения липополисахарида) режиме его поступления в организм [40]. Эти результаты существенно расширяли границы потенциального медицинского применения ферментных производных, сходных с конъюгатом СОД-ХС-КАТ.
Интерес к получению многоферментных ансамблей имеет свою историю. Известно приготовление конъюгата трипсина и химотрипсина (в молекулярном соотношении 1:1) посредством их связывания N-сукцинимидилпиридилдитиопропионатом [41], что повышало устойчивость производного к трипсинолизу. Сходным образом конъюгировали энолазу с фосфоглицератмутазой [42]. Сшивкой глутаровым альдегидом получали конъюгат СОД-КАТ, проявивший защитное действие против ишемии (реперфузии) на изолированном сердце крысы [43]. Для защиты гемоглобина против воздействия свободных радикалов (при пересадке клеток с кислородной поддержкой посредством применения белкового производного) был получен конъюгат гемоглобина с антиоксидантными ферментами СОД и КАТ благодаря присоединению этих компонентов друг к другу с помощью дикарбоксиметилированного полиэтиленгликоля [44]. Полученный аддукт отличали высокое значение молекулярной массы (около 1000 kDa) и заметная остаточная активность СОД- (70%) и КАТ- (90%) компонентов. Для придания получаемым белковым ансамблям способности проникать в клетки стали использовать технологии генной и белковой инженерии. Соэкспрессией соединенных генов удалось получить трехфункциональный белковый конъюгат с активностью Mn-СОД, КАТ и способностью вхождения в клетки [45]. Рекомбинантный химерный белок, обладающий пероксидазной и СОД-активностью, проявил кардиопротекторные свойства на изолированном сердце крысы с модельным окислительным стрессом, вызванным пероксидом водорода [46, 47]. Кардиопротекторный эффект подтверждался нормализацией частоты сердечных сокращений, поддержанием контрактильной функции миокарда и предупреждением губительного действия окислительного стресса. Благодаря снижению уровня окислительного стресса у мышей (индуцированного ионизирующим излучением в летальных дозах 5—10 Гр) посредством внутривенного введения экзогенного пероксиредоксина-6 был продемонстрирован радиопротекторный эффект [48]. Значение фактора изменения дозы составило 1,45. Экзогенные пероксиредоксины обнаружили высокую эффективность защиты клеток костного мозга и быстрого восстановления форменных элементов крови после воздействия ионизирующего излучения. Представленные данные демонстрируют развитие подходов по внеклеточной и внутриклеточной защите от окислительного стресса модифицированными белковыми производными, полученными методами химического и биологического синтеза. Следует подчеркнуть тенденцию к заметному увеличению их молекулярных размеров и включению биокатализаторов в мультиферментные ансамбли.
Заключение
Исследование и разработка модифицированных производных белков медицинского назначения интенсивно ведутся для облегчения течения и устранения многих нозологий. Заметны достижения в изучении конъюгатов антитело-лекарство и мультиферментных ансамблей. После включения модифицированных биокатализаторов в клиническую практику тромболитической терапии [49], углубления исследований сосудистой стенки [50] заметнее стали успехи в биомедицинской разработке модифицированных ферментных антиоксидантов. Их отличают положительные результаты в коррекции метаболических нарушений кардиологического профиля. Исследования разных групп модифицированных ферментов и белков имеют тенденцию к увеличению молекулярных размеров изучаемых производных и соединению ферментов в мультикомпонентные комплексы и ансамбли.
Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (гранты 15−04−03584 и 18−015−00056) и Министерства здравоохранения Российской Федерации.
Автор заявляет об отсутствии конфликта интересов.
Максименко Александр Васильевич — д.б.н., проф., ведущий научный сотрудник отдела биоинженерных технологий и поддержки научных исследований Института экспериментальной кардиологии ФГБУ «НМИЦ кардиологии» Минздрава России; e-mail: alex.v.maks@mail.ru; тел.: +7(495)414-6025; факс: +7(499)726-3116