Введение

Наряду с генной терапией, тканевой инженерией и регенеративной фармакологией клеточная терапия составляет одно из важнейших направлений новой еще развивающейся области медицины — регенеративной медицины. Хотя экспериментальные доклинические исследования по клеточной терапии в кардиологии начались еще в последнее десятилетие XX века [1, 2], интенсивное развитие это направление получило уже в XXI веке, что делает его еще очень молодым научным и медицинским направлением. Данный обзор включает мнения ведущих мировых ученых и авторов на проблемы и перспективы развития клеточной терапии в кардиологии, основываясь на последних достижениях фундаментальных исследований механизмов участия стволовых клеток в регенеративных процессах, и не сосредоточен на детальном анализе результатов клинических испытаний, который представлен в нескольких недавних обзорах [3, 4].

История и первое поколение клеточной терапии

Клинические исследования по клеточной терапии в кардиологии начались в 2001 г. с работ французского ученого Филипа Менаша, который использовал внутримиокардиальное введение больным с тяжелой постинфарктной сердечной недостаточностью скелетных миобластов — клеток, регенерирующих скелетные мышцы [5]. Введенные миобласты дифференцировались в сердце в поперечно-полосатые мышечные волокна, которые механически интегрировались в миокард, препятствуя ремоделированию левого желудочка, однако не интегрировались электрически, так как поперечно-полосатые мышечные волокна не экспрессировали коннексин-43. Это было причиной жизнеугрожающих желудочковых аритмий и требовало постановки имплантируемого кардиовертер-дефибриллятора. Метод не оказался достаточно эффективным для увеличения фракции выброса, но уменьшал постинфарктное ремоделирование левого желудочка [6]. Не получив широкого распространения, метод тем не менее дал импульс целому ряду других работ, связанных уже с клетками костного мозга. Этому также способствовали и значительные успехи клеточной терапии в гематологии. Еще в 1960-е годы было показано, что трансплантация всего одной гематопоэтической стволовой клетки может восстанавливать весь гемопоэз [7], и это положило начало клеточной терапии в гематологии. Позже по аналогии стали полагать, что клетки костного мозга обладают универсальными регенеративными свойствами, в том числе способны дифференцироваться в кардиомиоциты и восстанавливать миокард. В пользу этой гипотезы свидетельствовали ранние экспериментальные работы с трансгенными животными, у которых клетки костного мозга были помечены флуоресцентным белком. При моделировании у них инфаркта и мобилизации клеток костного мозга в сердце обнаруживались кардиомиоциты с этой меткой [8, 9], что трактовалось как дифференцировка клеток костного мозга в кардиомиоциты. Способствовало этим взглядам и изучение такого явления, как химеризм донорского сердца, когда при пересадке мужчине сердца женщины в нем обнаруживали клетки с y-хромосомой, что могло свидетельствовать об участии внесердечных клеток реципиента в регенеративных процессах в пересаженном сердце [10]. Эти работы очень быстро инициировали многочисленные небольшие клинические исследования так называемого первого поколения клеточной терапии нефракционированными мононуклеарными клеткам костного мозга (МНККМ). Первые работы по внутрикоронарной трансплантации МНККМ больным с острым инфарктом в Германии действительно показали весьма обнадеживающие результаты по уменьшению размера инфаркта, улучшению сократительной функции и перфузии миокарда [11], что инициировало более крупные контролируемые исследования. Однако их результаты у больных с инфарктом миокарда оказались уже менее оптимистичными [12, 13]. Нефракционированные МНККМ также не были эффективными у больных с сердечной недостаточностью как ишемического [14], так и неишемического генеза [15] в контролируемых исследованиях. Результаты самого большого метаанализа контролируемых исследований применения МНККМ оказались более чем скромными прежде всего в плане влияния на функцию сердца [16]. Это породило большое разочарование в возможностях клеточной терапии заболеваний сердца, причиной которого было не только отсутствие значимого улучшение функции сердца, но и нереалистичные ожидания, обусловленные бурной рекламной компанией в масс-медиа в начале 2000-х годов, недостаточная изученность механизмов действия стволовых клеток при трансплантации и жесткая ориентированность на тканезамещение за счет дифференцировки трансплантированных клеток в кардиомиоциты и клетки сосудов, а также недостаточная разработка на доклиническом этапе протоколов трансплантации.

Следующее поколение клеточной терапии

Второе поколение клеточной терапии включало использование клеток, получение которых требовало определенного процессинга в лабораторных условиях (рис. 1). К ним относились, прежде всего, мультипотентные мезенхимные стромальные клетки (МСК), получаемые из костного мозга, жировой ткани, пупочной вены. Также к этому поколению относится фракция CD34+ клеток периферической крови, извлекаемая при мобилизации из костного мозга при введении G-CSF и клетки из ткани сердца: кардиосфер и c-kit-позитивные прогениторные клетки сердца. Результаты клинических исследований со всеми этими клетками подробно описаны в обзоре 2022 г. Роберто Болли с соавт. [3]. Кратко останавливаясь на результатах клинических исследований по второму поколению клеточной терапии необходимо отметить, что наиболее перспективные результаты были получены при трансплантации мультипотентных МСК больным с хронической сердечной недостаточностью (ХСН). МСК являются крайне привлекательным типом постнатальных прогениторных клеток для клеточной терапии благодаря присущим им прорегенеративным свойствам. Помимо костного мозга МСК присутствуют во всех тканях и органах, занимая периваскулярный компартмент и формируя периваскулярную клеточную нишу. Они выполняют множество регуляторных функций, включая регуляцию ангиогенеза, воспаления и иммунных реакций, фибротических процессов, опосредуют регуляторное влияние нервной системы на тканевые компартменты резидентных стволовых клеток [17]. Основными характеристиками МСК являются специфический набор поверхностных маркеров (CD105+, CD90+, CD73+) при отсутствии гематопоэтических маркеров, хорошая адгезия к пластику и способность к мезодермальной дифференцировке в остеобласты, адипоциты, хондроциты и фибробласты [18]. Но особая привлекательность МСК как инструмента клеточной терапии, в частности в кардиологии, обусловлена несколькими свойствами, включающими относительную легкость выделения из тканей и экспансии в культуре, их антивоспалительные и иммуносупрессивные свойства, дающие возможность использования аллогенных клеток, полученных от молодых здоровых доноров, выраженные ангиогенные и антифиброзные свойства [19]. Несмотря на то что в нескольких ранних работах была показана способность МСК дифференцироваться в эндотелиальные клетки, скелетные миоциты и кардиомиоциты [20, 21], четкого подтверждения эти свойства МСК не получили [19] и основным механизмом их регенеративных эффектов сегодня признается паракринная активность и высвобождение внеклеточных везикул, что будет обсуждаться далее.

Рис. 1. Эволюция клеточной терапии в кардиологии.

МСК — мезенхимные стромальные клетки; ПКС — прогениторные клетки сердца; КМЦ — кардиомиоциты; иПСК — индуцированные плюрипотентные стволовые клетки; ЭСК — эмбриональные стволовые клетки; ФБ — фибробласты.

Весьма обнадеживающие и перспективные результаты были получены при трансэндокардиальной трансплантации МСК костного мозга в нескольких контролируемых клинических исследованиях у больных с ХСН. Рандомизированное двойное слепое плацебо-контролируемое исследование MSC-HF [22, 23] явилось первым хорошо организованным контролируемым исследованием, обеспечившем доказательства эффективности трансэндокардиальной (внутримиокардиальной) трансплантации МСК костного мозга при ишемической ХСН. Через 1 год после трансплантации была достигнута первичная конечная точка — значительное улучшение конечного систолического объема в сравнении с плацебо, помимо этого достоверно увеличивалась фракция выброса (ФВ) и улучшалось качество жизни [22], а через 4 года наблюдения отмечено значительное снижение случаев возникновения стенокардии в сравнении с группой плацебо [23]. В этом исследовании впервые была продемонстрирована прямая связь между эффектом и количеством введенных клеток и убедительно доказана большая эффективность более высоких доз. Это было отчасти подтверждено и в исследовании TRIDENT [24] при трансплантации аллогенных МСК костного мозга больным с ишемической кардиомиопатией, что позволило рекомендовать использование для трансэндокардиальной трансплантации не менее 100—150 млн клеток.

Следующий важный результат был получен в сравнительном исследовании эффективности аутологичных и аллогенных МСК костного мозга при ишемической (исследование POSEIDON) [25] и дилятационной кардиомиопатии (POSEIDON-DCM) [26]). В обоих исследованиях аллогенные МСК костного мозга, полученные от молодых здоровых доноров, оказались более эффективными, чем аутологичные клетки пациентов по таким параметрам, как уменьшение конечного диастолического объема, увеличение ФВ и дистанции 6-минутной ходьбы, улучшение качества жизни, уменьшение количества госпитализаций и случаев смерти, а также выраженности снижения уровня фактора некроза опухоли в крови. Эти результаты подчеркивают необходимость тщательного выбора как целевой группы пациентов, так и типа клеток и дозы. Самыми большими клиническими исследованиями по клеточной терапии ХСН явились контролируемые исследования IIb-III фазы ixCELL-DCM [27], CONCERT-HF [28] и DREAM-HF [29], в которых изучалась эффективность трансэндокардиальной внутримиокардиальной трансплантации клеток. В исследовании ixCELL-DCM у 109 пациентов с ишемической кардиомиопатией изучалась эффективность специфической фракции аутологичных мононуклеарных клеток костного мозга, содержащих МСК и макрофаги. В мультицентровом исследовании CONCERT-HF у 125 больных с ишемической ХСН оценивалась эффективность аутологичных МСК костного мозга, c-kit + прогениторных клеток сердца и комбинации этих клеток. И, наконец, в самом большом на сегодня мультицентровом исследовании DREAM-HF, включившем 537 пациентов с ишемической и неишемической ХСН в 55 североамериканских медицинских центрах, оценивалась эффективность трансплантации аллогенных МСК костного мозга. Во всех трех исследованиях, несмотря на различия в дизайне и клеточном материале, были получены весьма похожие результаты: отмечалось существенное уменьшение значительных сердечно-сосудистых событий (MACE) (сердечно-сосудистая и общая смертность, инфаркт миокарда, инсульт, госпитализации) с небольшими различиями по составу MACE, при отсутствии достоверного улучшения функции сердца. Результаты исследования DREAM-HF еще полностью не опубликованы и, возможно, будут предоставлены новые данные, которые повысят интерес медицинского сообщества к развитию технологий клеточной терапии заболеваний сердца. Одним из важнейших результатов этого исследования является длительность эффекта (30 мес) после однократной внутримиокрадиальной трансплантации МСК костного мозга.

Что касается гематопоэтических клеток костного мозга, то нельзя не упомянуть контролируемые исследования (фаза I, фаза II ACT-34, ACT-34 extension, фаза III RENEW) [30], показавшие эффективность трансэндокардиальной трансплантации селективной фракции аутологичных CD34+ клеток, получаемых путем афереза из периферической крови после мобилизации мононуклеарных клеток при введении G-CSF. Значительное увеличение общего времени нагрузки, уменьшение частоты стенокардии по сравнению с плацебо отмечено через 1 год, а через 2 года — снижение смертности и значительных сердечно-сосудистых событий (MACE). Представляя резюме основных результатов клинических исследований по клеточной терапии в кардиологии Роберто Болли с соавт. [3] констатируют следующее: все работы показали безопасность клеточной терапии; при остром инфаркте миокарда большинство исследований показали негативные результаты; наиболее перспективным типом клеток для лечения ХСН являются МСК из различных источников, причем эффекты могут сохраняться длительно даже после однократного введения клеток, более эффективными являются аллогенные клетки молодых здоровых доноров; наилучшая конечная точка для исследований по ХСН еще не определена и разные исследования показали улучшение по различным конечным точкам (функция ЛЖ, MACE, качество жизни); необходимы хорошо организованные исследования III фазы как для подтверждения эффективности, так и для определения наилучших конечных точек.

Механизм действия клеточной терапии и «клеточная терапия без клеток»

За последние 20 лет произошли существенные изменения взглядов на механизмы терапевтического действия клеточной терапии в сердце, и не только в сердце. Интенсивные экспериментальные исследования показали, что при применении стволовых или прогениторных клеток взрослого организма ни о каком тканезамещении введенными клетками речь идти не может просто в силу того, что используемые клетки не способны эффективно дифференцироваться в кардиомиоциты и включаться в структуру миокарда. Более того, они полностью исчезали через несколько недель после трансплантации [31, 32]. В качестве основного регенеративного механизма постнатальных стволовых клеток в сердце на первый план выходит паракринная активность, под которой первоначально понимали только секрецию широкого спектра биологически активных факторов [33, 34]. И, действительно, многочисленные исследования секретома постнатальных стволовых/прогениторных клеток показали наличие в нем широчайшего набора факторов, непосредственно участвующих в репаративных процессах в сердце, включая факторы роста, цитокины, интерлейкины, биоактивные липиды, протеазы, широкий спектр белков внеклеточного матрикса [35—37]. В ряде работ показана возможность воспроизведения регенеративных эффектов клеток, используемых для трансплантации, просто путем введения продуктов их секреции [38, 39]. Однако позже становится ясно, что регенеративные эффекты клеточной терапии связаны не только с секрецией растворимых факторов, но и со способностью клеток высвобождать внеклеточные везикулы, в частности, нановезикулы — экзосомы, осуществляющие горизонтальный перенос генетической информации между клетками [40, 41]. Открытие внеклеточных везикул как нового механизма обмена информацией, включая генетическую — одно из наиважнейших открытий последних десятилетий, за которое была присуждена Нобелевская премия по физиологии и медицине 2013 г. Это открытие позволило совершенно по-новому взглянуть и на механизмы регенеративных эффектов постнатальных стволовых клеток, рассматривая их не только, а в ряде случаев и не столько как непосредственных участников восстановления тканей за счет дифференцировок в ее клетки и интеграции в ткань, сколько как важнейших регуляторов и организаторов участия других клеток ткани в регенеративных процессах. Экзосомы стволовых клеток содержат широкий набор регуляторных молекул, включающий транскрипционные факторы, матричные РНК и регуляторные микроРНК, длинные некодирующие РНК, которые отвечают за регуляцию важнейших клеточных процессов. Перенос экзосом в клетки поврежденной ткани, включая резидентные прогениторные клетки, может запускать в них регенеративную программу: стимулировать пролиферацию, дифференцировку, подавлять апоптоз, модулировать иммунные реакции, фибротические процессы, секреторную активность [42, 43]. Так потенциально за счет высвобождения внеклеточных везикул, в частности нановезикул экзосом, стволовые клетки могут воздействовать на процессы, приводящие к истончению стенки левого желудочка и патологическому ремоделированию: подавлять излишнее воспаление, препятствовать развитию фиброза, подавлять апоптоз кардиомиоцитов, уменьшать митохондриальную дисфункцию и оксидативный стресс, уменьшать нарушение кальциевого метаболизма кардиомиоцитов и активировать эндогенные процессы регенерации. Это делает экзосомы стволовых клеток крайне привлекательным инструментом так называемой «клеточной терапии без клеток» [44, 45]. Как инструмент терапии, экзосомы даже более привлекательны, чем высвобождающие их клеток за счет целого ряда свойств. Они окружены мембраной, аналогичной клеточной, защищающей их содержимое от разрушения ферментами; присутствуют во всех жидкостях организма, проникают через все биологические барьеры, поэтому могут переносить свое содержимое на большие расстояния; продуцируются практически всеми клетками, низкоиммуногенны, что создает возможность аллогенного применения; могут длительно храниться, не теряют свойств при замораживании и размораживании; содержат широкий набор прорегенеративных молекул и могут легко модифицироваться под определенную цель (перенос лекарственного соединения, микроРНК, белковых молекул); могут использоваться для адресной доставки путем нацеливания на определенные клетки при модификации мембранных молекул; представляют собой «продукт с полки», готовый к использованию.

В недавних наиболее полных обзорах, посвященных исследованиям внеклеточных везикул при сердечно-сосудистых заболеваниях [46, 47], проанализировано 50 доклинических работ. Из них 46 на грызунах и 4 на крупных животных мини-свиньях и приматах по внутримиокардиальной трансплантации внеклеточных везикул стволовых клеток на моделях ИМ и ишемии-реперфузии. Внеклеточные везикулы получали от различных стволовых клеток, но в большинстве исследований от различных МСК, в том числе гипоксических и модифицированных АКТ, сиртуином-1, HIF-1alpha, SDF-1, нагруженных различными микроРНК и длинными некодирующими РНК. Обращает на себя внимание, что во всех работах как на мелких животных, так и на крупных были получены практически одинаковые результаты: увеличение фракции выброса и фракционного укорочения, уменьшение постинфарктного ремоделирования, стимуляция ангиогенеза, уменьшение размера инфаркта и постинфарктного фиброза, уменьшение апоптоза КМЦ, повышение пролиферации кардиомиоцитов, уменьшение воспаления.

Особо хотелось бы отметить две недавние работы, открывающие перспективы более широкого клинического использования экзосом. В исследовании J. Yao и соавт. [48] разработан минимально инвазивный способ введения экзосом МСК в фибриновом спрее в полость перикарда прямо на эпикард. Такой способ доставки экзосом оказался более эффективным в сравнении с внутримиокардиальными инъекциями как в отношении эффективности доставки экзосом в сердце, так и восстановления функции сердца, предотвращения постинфарктного ремоделирования, сохранения жизнеспособного миокарда и уменьшения размера инфаркта, что было продемонстрировано и на модели у мыши и у мини-свиньи. В другой работе внутривенное введение экзосом иммортализованных клеток кардиосфер крысам с моделью фиброза миокарда и недостаточностью с сохраненной фракцией выброса приводило к реверсии фиброза, уменьшению воспаления и значительно снижало процент индуцированной фибрилляции предсердий [49]. Учитывая возможность малоинвазивной доставки, технология использования эксзосом стволовых и прогениторных клеток в качестве инструмента регенеративной терапии в кардиологии представляется крайне перспективной. Здесь хотелось бы привести цитату (перевод с англ.) из обзора Silvestre and Menasche [50] о том, что «эволюция теории участия стволовых клеток в регенерации сердца может закончиться с разработкой бесклеточных технологий с множественными клеточными мишенями, включая кардиомиоциты», в чем, несомненно, есть доля правды. Однако эффективность применения препаратов на основе продуктов секреции и внеклеточных везикул прогениторных клеток еще необходимо доказать в клинических испытаниях. Хотя технология использования экзосом уже шагнула в клинические исследования, в кардиологии таких исследований пока крайне мало по сравнению с онкологией. На ClinicalTrail.gov зарегистрировано 2 исследования: Safety Evaluation of Intracoronary Infusion of Extracellular Vesicles Following Coronary Stent Implantation NCT04327635, США; и Treatment of Non-ischemic Cardiomyopathies by Intravenous Extracellular Vesicles of Cardiovascular Progenitor Cells (SECRET-HF) NCT05774509, Франция, которые завершаются в 2025—2026 гг.

Повышение выживаемости клеток. Доставка с помощью тканеинженерных конструкций

Если продукты секреции и экзосомы стволовых клеток отвечают за регенеративные эффекты клеток, то возникает естественный вопрос: почему же весь этот паракринный регенеративный потенциал не был в достаточной мере реализован, особенно в первом поколении клеточной терапии, иными словами, что мешает трансплантированным стволовым клеткам оказывать эффекты за счет секреции биологически активных факторов и высвобождения экзосом? Одна из основных причин — гибель большей части клеток при трансплантации их в виде клеточной суспензии через иглу, что использовалось во всех исследованиях по клеточной терапии. В ряде экспериментальных работ было убедительно показано, что количество клеток в миокарде падает в несколько раз уже через день после трансплантации и единичные проценты остаются через несколько дней при внутрикоронарном способе введения; несколько лучше ситуация при внутримиокардиальном введении, но через неделю в миокарде остается менее 8% от введенных клеток [51]. В то же время восстановление функции сердца после экспериментального инфаркта напрямую зависит от количества оставшихся в миокарде клеток [52]. Это отчасти объясняет и зависимость эффективности клеточной терапии ХСН от количества введенных МСК, показанную в клиническом исследовании MSC-HF [22, 23]. Другим подходом к повышению выживаемости и эффективности клеточной терапии может быть использование альтернативного способа трансплантации клеток — не в виде суспензии, а в виде различного рода тканеинженерных конструкций, сохраняющих поддерживающее жизнеспособность клеток микроокружение. Еще в конце 70-х годов прошлого века Реймондом Шоффилдом была сформулирована концепция ниши стволовой клетки [53], развитая в последующем во многих работах [54—56], показавших, что стволовые клетки не автономны, что они функционируют только в специальном микроокружении — клеточных нишах, которые контролируют, направляют и поддерживают жизнь и функционирование стволовых клеток за счет контактов с другими клетками и с внеклеточным матриксом, паракринными сигналами и везикулами окружающих клеток, метаболическими воздействиями. Перевод клеток в суспензию при трансплантации нарушает все эти сигналы и способствует уходу клеток в апоптоз (аноикис), дополнительное повреждение оказывает введение через иглу и, наконец, провоспалительное окружение в ткани поврежденного сердца не дает им необходимого для реализации регенеративных свойств рецептивного микроокружения. Для решения этой проблемы используется трансплантация клеток в составе гелей [57], вместе с другими типами прогениторных клеток [27, 28] или в составе тканеинженерных конструкций различной сложности, хотя бы отчасти моделирующих микроокружение клеточной ниши [58]. Мы использовали трансплантацию клеток в виде простых тканеинженерных конструкций — так называемых клеточных пластов (cell sheets), — образованных несколькими слоями клеток (МСК и/или васкулогенными прогениторными клетками сердца) и наработанным ими же внеклеточным матриксом. Пласты получали в специальных условиях культивирования на чашках, покрытых термочувствительным полимером [59]. Это позволяло эффективно без повреждений откреплять клеточные пласты просто при изменении температуры. В таких пластах клетки сохраняют контакты друг с другом через коннексины, пролиферируют, практически не уходят в апоптоз, вступают в дифференцировку в кардиоваскулярном направлении и активно синтезируют белки внеклеточного матрикса коллагены 1 и 3 типов и фибронектин [60]. Более того, в пластах значительно возрастает паракринная активность клеток [61]. При формировании конструкций из разных типов прогениторных клеток — МСК и васкулогенных прогениторных клеток сердца (ПКС) — мы наблюдали взаимное влияние клеток, отчасти моделирующее взаимоотношение в периваскулярной клеточной нише [62]. Так, МСК в составе комбинированной конструкции повышали пролиферацию и выживаемость ПКС за счет как паракринной активности, так и прямого межклеточного взаимодействия путем связывания лигандов системы Notch сигналинга — Jagged1 и DLL4, располагающихся на поверхности МСК, с рецепторами Notch на поверхности ПКС. Это способствовало инициации дифференцировки ПКС в эндотелиальном направлении. Таким образом, в пластах хотя бы частично сохраняется привычное клеточное микроокружение, поддерживающее их жизнеспособность и регенеративные свойства. При трансплантации клеток в виде таких пластов на эпикардиальную поверхность сердца крысы с моделью инфаркта выживает в течение 2—3 нед не менее 70% клеток, сохраняющих паракринную активность [63]. В зоне миокарда под трансплантатом наблюдается стимуляция ангиогенеза и пролиферации кардиомиоцитов за счет паракринной активности клеток пласта. Избирательно увеличивая паракринную активность за счет генетической модификации клеток, можно получать пласты с нужными свойствами [64], например, с ангиогенной активностью для стимуляции ангиогенеза в ишемизированных тканях. Так, в нашей совместной работе с коллегами из университета Тайпея мы получили пласты, гиперпродуцирующие активатор ангиогенеза VEGF. Эпикардиальная трансплантация таких пластов на область инфаркта у кролика позволила значительно улучшить перфузию миокарда и почти полностью восстановить фракцию выброса [65]). В другой работе мы получили пласты для стимуляции эндогенных регенеративных процессов, для чего модифицировали их вирусом, содержащим ген фактора стволовых клеток, который стимулирует хемотаксис эндогенных стволовых клеток [66]. Эпикардиальная трансплантация таких пластов на область инфаркта у крысы вызывала накопление эндогенных стволовых клеток в периинфарктной зоне и значительно стимулировала ангиогенез. Через месяц в опытной группе наблюдалось значительное увеличение зоны жизнеспособного миокарда в области левого желудочка, уменьшение индекса дилатации и увеличение толщины его стенки в области инфаркта. При этом фракция выброса достоверно возрастала, тогда как в контрольных группах этого не наблюдалось [66] (рис. 2). Столь существенное увеличение зоны жизнеспособного миокарда может быть следствием активации регенеративных процессов и подавления апоптоза кардиомиоцитов под влиянием паракринных сигналов из трансплантата. Если говорить о перспективах клинического применения этой технологии, то она уже сделала небольшой шаг в клинику: подобные пласты из прогениторных клеток сердца, полученных из эмбриональных стволовых клеток, были трансплантированы во время аортокоронарного шунтирования пациентам с тяжелой постинфарктной сердечной недостаточностью и фракцией выброса менее 30% [67]. Исследование показало выполнимость и безопасность такой трансплантации и тенденцию к улучшению функции сердца. Таким образом, эпикардиальная трансплантация стволовых и прогениторных клеток в виде клеточных пластов может представлять рациональную альтернативу введению клеточной суспензии, обеспечивая выживаемость клеток и их регенеративные эффекты за счет длительной паракринной активности и высвобождения везикул.

Рис. 2. Эпикардиальная трансплантация МСК-SCF клеточного пласта из генетически модифицированные МСК, гиперпродуцирующих фактор стволовых клеток (SCF), уменьшает постинфарктное ремоделирование сердца крысы.

а — срезы сердца, окрашенные по Маллори. Красное — жизнеспособный миокард. Синее — коллаген (фиброз). Группы: инфаркт (контрольная группа) — моделирование инфаркта без трансплантации клеточного пласта; +МСК — инфаркт с трансплантацией клеточного пласта из МСК; +МСК-SCF — инфаркт с трансплантацией клеточного пласта из МСК, гиперпродуцирующих SCF; б — количественный анализ морфометрических параметров левого желудочка: размер инфаркта; процент жизнеспособного миокарда; индекс расширения левого желудочка; толщина стенки в области инфаркта. Данные представлены как среднее + стандартное отклонение; (Mann—Whitney U-test). «*» указывают статистически значимые различия между группами; в — динамика фракции выброса левого желудочка (ЭхоКГ) до моделирования инфаркта, через 7 и 30 дней после инфаркта. «*» указывает достоверное различие между контрольной группой и группой с трансплантацией клеточного пласта из МСК, гиперпродуцирующих SCF; p=0,037.

В группах по 7—10 животных. Рисунок заимствован их статьи K. Dergilev и соавт. [66].

Замещение утраченных кардиомиоцитов: получение кардиомиоцитов из плюрипотентных стволовых клеток и методами прямого репрограммирования фибробластов

Кардинальное решение проблемы сердечной недостаточности со сниженной фракцией выброса возможно только с помощью технологий восполнения утраченных кардиомиоцитов. Что же есть сегодня в этой области? Прежде всего сейчас совершенно ясно, что ни один из видов постнатальных стволовых клеток не способен дифференцироваться в полноценные функциональные кардиомиоциты. Более или менее зрелые кардиомиоциты могут быть получены путем дифференцировки только из плюрипотентных клеток, каковыми являются эмбриональные стволовые клетки, получаемые из внутренней массы бластоциты, и пациент-специфические индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК), получаемые из соматических клеток пациента (фибробластов, мононуклеарных клеток крови) путем экспрессии в них транскрипционных факторов или микроРНК, экспрессированных в эмбриональных стволовых клетках [68] (рис. 3). Кардиомиоциты, образованные в результате дифференцировки ИПСК, являются пациент-специфическими и не подвергаются отторжению, в отличие от кардиомиоцитов, которые получены из эмбриональных стволовых клеток, требующих иммуносупрессивной терапии. Сегодня получение индуцированных плюрипотентных клеток проводится почти рутинно во многих лабораториях мира; разработаны достаточно эффективные протоколы дифференцировки в различные типы кардиомиоцитов, включая пейсмейкерные клетки, которые могут быть использованы для создания биологических пейсмейкеров [68—70]. Кардиомиоциты, получаемые из плюрипотентных клеток, широко используются в эксперименте для трансплантации в сердце и получения тканеинженерных конструкций, в том числе и конструкций в виде клеточных пластов [71, 72]. Эффективность восстановления функции сердца при трансплантации кардиомиоцитов, полученных из эмбриональных стволовых клеток (ЭКС) и ИПСК человека, была продемонстрирована на моделях инфаркта у нечеловекообразных приматов и мини-свиней. Графт из кардиомиоцитов, полученных из ЭСК человека, хорошо интегрировался в миокард примата, сопрягался электрически и механически с миокардом реципиента и не вызывал фатальных аритмий [72]. Клеточный пласт, полученный из кардиомиоцитов, дифференцированных из ИПСК человека, эффективно восстанавливал функцию сердца при трансплантации на зону инфаркта у свиньи [71]. Внутримиокардиальная трансплантация в желатиновом геле сфероидов, образованных кардиомиоцитами, полученными из ИПСК человека в сердце свиньи с моделью инфаркта не вызывали каких либо осложнений и эффективно восстанавливала функцию сердца [73]. Эффективность кардиомиоцитов, полученных из ИПСК и ЭСК, уже исследуется в клинике.

Рис. 3. Кардиомиоциты in vitro могут быть получены из плюрипотентных клеток.

В настоящее время инициировано 8 клинических исследований 1—2-й фазы по трансплантации кардиомиоцитов, полученных из плюрипотентных клеток больным с ХСН (A Study of iPS Cell-derived Cardiomyocyte Spheroids (HS-001) in Patients With Heart Failure (LAPiS Study) (LAPiS) NCT04945018, Japan; IPS Differentiated Cardiomyocytes Vein Transplantation for Chronic Heart Failure (IDCVTCHF) NCT03759405, China; Treating Heart Failure With hPSC-CMs (HEAL-CHF) NCT03763136, China; Treating Heart Failure With hiPSC-CMs NCT05223894, China; Allogeneic iPSC-derived Cardiomyocyte Therapy in Patients With Worsening Ischemic Heart Failure. NCT05566600, China; Human Embryonic Stem Cell-Derived Cardiomyocyte Therapy for Chronic Ischemic Left Ventricular Dysfunction (HECTOR). NCT05068674, USA; Clinical Trial of Human (Allogeneic) iPS Cell-derived Cardiomyocytes Sheet for Ischemic Cardiomyopathy. NCT04696328, Japan; Treating Congestive HF With hiPSC-CMs Through Endocardial Injection. NCT04982081, China). Вполне вероятно, что в ближайшем будущем мы будем иметь данные о возможности эффективного замещения утраченных кардиомиоцитов.

Другой способ получения кардиомиоцитов основан технологией прямого репрограммирования (трансдифференцировки) фибробластов в кардиомиоциты (минуя стадию плюрипотентных клеток) путем введения в них транскрипционных факторов или микроРНК, активных на более поздних этапах эмбриогенеза — в период активного кардиогенеза. Такая попытка была успешно предпринята в 2010 г. в Калифорнии [74]. С помощью вирусной экспрессии трех транскрипционных факторов, экспрессированных в эмбриональном сердце в период активного кардиомиогенеза, удалось из фибробластов сразу получить кардиомиоциты, названные индуцированными кардиомиоцитами. Несмотря на то что для прямого репрограммирования было разработано много репрограммирующих коктейлей, его эффективность в получении более менее зрелых кардиомиоцитов была недостаточно высокой [75, 76]. Работами последних лет эффективность прямого репрограммирования фибробластов в кардиомиоциты удалось повысить в сравнении с эффективностью репрограммирования первых работ с помощью сложных репрограммирующих коктелей, включающих помимо транскрипционных факторов и микроРНК, малые молекулы, эпигенетические модификаторы, противовоспалительные препараты (диклофенак) [77, 78]. Это дает надежды на разработку в обозримом будущем эффективной и безопасной технологии получения пациент-специфических кардиомиоцитов из фибробластов, минуя стадию плюрипотентных клеток. Но наиболее привлекательной является возможность перепрограммировать фибробласты сердца в кардиомиоциты in vivo прямо в формирующемся рубце с помощью прямого введения в сердце в вирусном векторе тех же транскрипционных факторов или микроРНК [79, 80]. Неожиданно эффективность репрограммирования in vivo оказалась существенно выше, чем in vitro: отмечено образование новых кардиомиоцитов, сокращение размера постинфарктного фиброза на 50%, улучшение функции сердца (ФВ) на 14%, что регистрировалось даже через 1 год. Вероятно, естественное микроокружение ткани сердца наряду с механическими воздействиями способствовали более эффективному перепрограммированию эндогенных фибробластов рубца в кардиомиоциты. Определенный шаг в сторону трансляции этой технологии в клинику был сделан в относительно недавних работах, показавших возможность перепрограммировоания фибробластов рубца в кардиомиоциты с помощью неинтегрирующихся вирусов, которые в отличие от ранее используемых ретровирусов могут применяться в клинике [81]. Оставался открытым вопрос о возможности репрограммирования фибробластов в кардиомиоциты не в формирующемся постинфарктном рубце, а в старом, уже давно сформированном рубце. Ответ на этот вопрос был получен совсем недавно. В работе H. Tani с соавт., опубликованной в Circulation в январе 2023 г. [82], была убедительно продемонстрирована возможность репрограммирования фибробластов в кардиомиоциты в старом рубце. Авторы использовали трансгенных мышей, у которых можно было вызвать гиперэкспрессию репрограммирущих факторов на этапе сформированного постирнфарктного фиброза путем введения тамоксифена. Было показано репрограммирование примерно 2% фибробластов в рубце в кардиомиоциты, что позволило существенно увеличить ФВ и уменьшить фиброз за счет конверсии профибротических фибробластов в неактивные фибробласты. Антифиброзный эффект прямого репрограммирования был обусловлен супрессией транскрипционного фактора Meox1, ключевого регулятора активации фибробластов. По своему потенциалу технология прямого репрограммирования фибробластов в каридомиоциты in vivo способна привести к революционным изменениям в лечении больных с сердечной недостаточностью, однако эти исследования пока находятся на экспериментальной стадии и еще слишком много вопросов остаются открытыми, требующими дальнейших экспериментальных исследований.

Заключение

Обобщая все вышеизложенное, следует подчеркнуть, что сегодня клеточная терапия занимает важное место среди развивающихся регенеративных технологий. Перспективы этой технологии в лечении заболеваний сердца связаны с разработкой способов трансплантации клеток, сохраняющих их жизнеспособность и регенеративные свойства (см. рис. 1). Это и трансплантация клеток в составе различных матриксов, в клеточных пластах, комбинаций нескольких типов клеток, поддерживающих друг друга паракринными механизмами, это и использование продуктов паракринной активности клеток — их секретома, экзосом, специально нагруженных целевыми микроРНК, и, наконец, использование кардиомиоцитов, полученных из плюрипотентных клеток для замещения утраченных кардиомиоцитов. Несомненно, перспективы эффективного восстановления функции сердца и утраченного миокарда связаны с развитием технологии тканевой инженерии сердца, связанной с использованием тканеинженерных конструкций из кардиомиоцитов, полученных из ИПСК, а также с развитием технологии прямого репрограммирования, особенно репрограммирования in vivo, хотя это уже не клеточная, а генная терапия.

Источник финансирования

Работа поддержана грантом РНФ №19-15-00384 «Исследование механизмов активации эпикарда при повреждении сердца и возможности стимулировать репаративный ангиогенез и репарацию миокарда после ишемического повреждения путем активирующих воздействий на эпикард» (рук. Е.В. Парфенова).

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.