Изучение иммуногистохимических показателей в эпидермисе и дерме при применении средств для регенерации кожи

Авторы:
  • Т. Н. Королькова
    ФГБОУ ВО «Северо-Западный государственный медицинский университет им. И.И. Мечникова» Минздрава России, Санкт-Петербург, Россия
  • Н. В. Калмыкова
    ФГБУ «Всероссийский центр экстренной радиационной медицины им. А.М. Никифорова» МЧС России, Санкт-Петербург, Россия
  • Е. В. Круглик
    Клиника пластической хирургии и косметологии «VIP Clinic», Калининград, Россия
  • Е. В. Зиновьев
    ГБУ «Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт скорой помощи им. И.И. Джанелидзе», Санкт-Петербург, Россия
Журнал: Клиническая дерматология и венерология. 2019;18(4): 460-468
Просмотрено: 642 Скачано: 296

Использование деструктивных методов в косметологии довольно распространено. Важным аспектом является продолжительность реабилитации пациента после выполненной процедуры. В связи с этим изучение средств, способных ускорить процесс регенерации поврежденного участка кожи, представляет собой актуальное научно-практическое направление в косметологии.

В основе заживления неглубоких ран лежит инициация воспалительной реакции, опосредованная факторами роста, цитокинами и хемокинами, эпителизация за счет сохранившихся придатков кожи и краевого эпидермиса, что в итоге приводит к полному и быстрому восстановлению кожи с незаметными рубцами или без них [1, 2].

Известно, что при использовании различных цитокинов, факторов роста, покрытий для ран процессы регенерации протекают быстрее. Наше внимание привлекли препарат на основе эпидермального фактора роста (ЭФР) и покрытие, состоящее из гиалуроновой кислоты и коллагена (ПГКК).

ЭФР относится к цитокинам и полипептидам, состоит из 53 аминокислот, присутствует во всех клетках тканей организма и регулирует их рост. ЭФР управляет ростом клеток эпителия, эндотелия и фибробластов, улучшает пролиферацию тканей, регулирует хемотаксис. В нормальных условиях содержание факторов роста в организме человека относительно невелико и стабильно. Однако при повреждениях в полости раны возрастает количество рецепторов, чувствительных к ЭФР, что приводит к повышению его концентрации и миграции клеток из неповрежденных тканей в пораженные участки. Поврежденная поверхность в короткие сроки выстилается клетками, что способствует заживлению кожи и слизистых оболочек без образования рубцов, препятствует развитию раневых инфекций и значительно сокращает сроки заживления [3].

На заживление ран положительно влияют различные раневые покрытия. Оптимальные повязки или покрытия должны обеспечить защиту раны от дальнейшей травмы, гарантировать влажную внутреннюю поверхность покрытия, абсорбировать или удалять избыток экссудата, предотвращать загрязнение и обеспечивать среду, способствующую реализации естественных защитных механизмов [4].

Цель исследования: изучить иммуногистохимические показатели кожи в ответ на применение препарата с ЭФР и покрытия, включающего гиалуроновую кислоту и коллаген.

Материал и методы

Обследована группа из 8 пациентов, получавших лечение в Ленинградской областной клинической больнице по поводу ограниченных глубоких ожогов. Пациентам была показана аутотрансплантация кожи (с участков здоровой кожи с бедер и ягодиц). После взятия материала регенерация донорских участков происходила с помощью различных препаратов. Пациентов распределили в четыре группы: 2 пациента на донорские участки кожи получали наружно препарат на основе ЭФР (GeneTime, ООО «НовоНексус», Китай), 2 пациента — покрытие ПГКК (материал гистоэквивалент-биопластический G-Derm/ДЖИ-ДЕРМ, ООО «Джи-Групп», Россия), 2 пациента — сочетание ЭФР с ПГКК, 2 пациента (контроль) — крем дермазин («LEK», Словения). Через 7 дней выполняли взятие материала из регенерированной зоны.

Иммуногистохимические исследования образцов кожи проводили на криостатных срезах по ранее описанной методике [5]. Криостатные срезы толщиной 5 мкм фиксировали абсолютным ацетоном, высушивали и окрашивали антителами с целью выявления экспрессии маркеров пролиферации (Ki67), антиапоптоза (Bcl-2), рецептора к эпидермальному фактору роста (EGFR) и антигену гистосовместимости (HLA-DR). В работе использовали следующие антитела: Anti-Ki-67 («Bio Genex», США), Anti-Bcl-2 («Dako», Дания), Anti-EGFR («Bio Genex», США), Anti-HLA-DR («Diagnostic Bio Systems», США). Иммуногистохимическое исследование проводили с использованием набора полимера Super Sensitiv TM Polimer HRP IHC Detection Systems («Bio Genex»). Результат реакции проявляли хромогеном диаминобензидином (DAB), препараты окрашивали гематоксилином. Готовые гистологические препараты фотографировали. По отдельности проводили съемку эпидермиса и дермы.

Фотографии обрабатывали с применением программы Морфология 5.0, где выделяли области скопления белка — иммуногистохимического маркера, в зависимости от характера маркера выполняли морфометрию. Для Ki67 подсчитывали количество меченых клеток в поле зрения микроскопа, для Bcl-2 и EGFR — оптическую плотность, HLA-DR — доля окрашенной площади в препарате (в %).

cтатистическую обработку результатов проводили в программе Statistica 6.1. Соответствие показателей иммуногистохимического исследования нормальному распределению оценивали с помощью критерия Колмогорова—Смирнова. Для выявления различий между группами был проведен однофакторный дисперсионный анализ (ANOVA). Внутригрупповые различия выявляли с использованием апостериорных критериев, в частности критерия Тьюки (Tukey HSD). Достоверность различий принимали на уровне р≤0,05.

Результаты

Однофакторный дисперсионный анализ (ANOVA) сравнения четырех групп показал, что применение местных лечебных средств влияет на все исследованные маркеры эпидермального слоя кожи: Ki67 (F=25,1; р≤0,001), HLA-DR (F=76,9; р≤0,001), Bcl-2 (F=17,5; р≤0,001), EGFR (F=5,4; р≤0,01). (табл. 1).

Таблица 1. Изменчивость маркеров эпидермиса под влиянием местных лечебных средств. Показатели однофакторного дисперсионного анализа Примечание. Здесь и в табл. 2: SS — сумма квадратов отклонения от среднего, df — степени свободы, MS — средний квадрат, F — критерий Фишера, p — уровень значимости.

Анализ дермального слоя в группах показал, что проведенные процедуры влияют на маркеры Ki67 (F=9,2; р≤0,001), EGFR (F=110,4; р≥0,001), HLA-DR (F=70,3; р≤0,001), но не отражаются на Bcl-2 (F=0,48; р>0,05) (табл. 2).

Таблица 2. Изменчивость маркеров дермы под влиянием местных лечебных средств. Показатели однофакторного дисперсионного анализа

Результаты сравнивали между указанными группами. Через 7 дней раневого заживления во всех вариантах можно наблюдать процессы активной пролиферации в коже. Меньше всего пролиферирующих клеток (маркер Ki67) в эпидермисе отмечено при использовании ЭФР+ПГКК (табл. 3, рис.

Таблица 3. Показатели маркера Ki67 в коже, количество меченых ядер (Mean + SEM) Примечание. * — р≤0,05; ** — р≤0,01; *** — р≤0,001, различие достоверно по сравнению с группой, пролеченной ПГКК; ^ — р≤0,05; ^^^ — р≤0,001, различие достоверно по сравнению с группой, пролеченной дермазином.
1).
Рис. 1. Показатели маркера Ki67 в эпидермисе донорской раны (ув. 250) на 7-й день после терапии: спреем с ЭФР (а); покрытием с ГКК (б); сочетанием спрея с ЭФР и ПГКК (в); дермазином (г).
Больше всего пролиферирующих клеток было при использования ПГКК и дермазина (различия достоверны). Показатели пролиферации при использовании отдельно ЭФР занимают среднюю позицию и достоверно не отличаются от других групп.

В дерме также сохраняется выявленная разница, но с более выраженными различиями между группами, в группах с использованием ЭФР (ПГКК +ЭФР или только ЭФР) пролиферация достоверно ниже, чем в группе дермазина и ПГКК.

По маркеру Bcl-2 межгрупповые сравнения вы-явили достоверные отличия в эпидермисе в группах применения ЭФР (табл. 4, рис.

Таблица 4. Показатели маркера Bcl-2 в коже, оптическая плотность (Mean + SEM) Примечание. Здесь и в табл. 5, 6. * — р≤0,05; ** — р≤0,01; *** — р≤0,001, различие достоверно по сравнению с группой, пролеченной препаратом ЭФР; ^ — р≤0,05; ^^ — р≤0,01; ^^^ — р≤0,001, различие достоверно по сравнению с группой, пролеченной дермазином.
2).
Рис. 2. Показатели маркера Bcl-2 в эпидермисе донорской раны (ув. 250) на 7-й день после терапии: спреем с ЭФР (а); покрытием с ГКК (б); сочетанием спрея с ЭФР и ПГКК (в); дермазином (г).
Значение показателя содержания антиапоптотического маркера Bcl-2 при применении только ЭФР достоверно выше, чем при использовании ЭФР+ПГКК или только ПГКК. При использовании дермазина маркер в эпидермисе на этом сроке не выявлен.

В дерме статистически значимых различий по этому маркеру между группами не наблюдается.

По маркеру HLA-DR достоверные отличия выявлены в группах применения ЭФР (табл. 5, рис.

Таблица 5. Показатели маркера HLA-DR в коже, доля площади в % (Mean + SEM)
3).
Рис. 3. Показатели маркера HLA-DR в коже донорской раны (ув. 250) на 7-й день после терапии: спреем с ЭФР (а); покрытием с ГКК (б); сочетанием спрея с ЭФР и ПГКК (в); дермазином (г).
Значение показателя в эпидермисе при использовании только ЭФР достоверно выше, чем при использовании ЭФР+ПГКК или только ПГКК. В группе использования дермазина маркер HLA-DR не выявлен.

В дерме, напротив, при ЭФР содержание маркера наименьшее, а при применении дермазина показатели HLA-DR наибольшие и эти различия статистически значимы. Разницы между группами ПГКК и ПГКК+ЭФР по HLA-DR не выявлено.

По маркеру EGFR в эпидермисе наибольшие значения выявлены в группе применения ЭФР (табл. 6, рис.

Таблица 6. Показатели маркера EGFR в коже, оптическая плотность (Mean + SEM)
4)
Рис. 4. Показатели маркера EGFR в эпидермисе донорской раны (ув. 500) на 7-й день после терапии: спреем с ЭФР (а); покрытием с ГКК (б); сочетанием спрея с ЭФР и ПГКК (в); дермазином (г).
и эти показатели достоверно выше, чем при использовании ЭФР+ПГКК или только ПГКК, но не отличаются от показателей в группе дермазина.

В дерме не обнаружено разницы в содержании маркера между вариантами ЭФР и ПГКК и дермазина, однако выявлено полное отсутствие экспрессии рецептора на этом сроке в группе совместного использования ЭФР+ПГКК.

Обсуждение

По данным литературы, антиапоптозный белок Bcl-2 экспрессируется преимущественно в зонах, содержащих пролиферирующие клетки или клетки с большой продолжительностью жизни, он оказывает гомеостатическое влияние на численность клеточной популяции [6]. Экспрессия Bcl-2, повышая устойчивость клеток к гибели по механизму апоптоза, защищает эндотелий, мигрирующие стволовые клетки и фибробласты от высокоактивных продуктов цитотоксических клеток и макрофагов в месте воспаления [7, 8].

Факторы роста семейства EGF, продуцируемые в коже макрофагами и кератиноцитами, осуществляют важные функции в эпителизации раневой поверхности. Эти аутокринные лиганды прикрепляются к EGFR на кератиноцитах и инициируют механизм последующего каскада, поддерживая пролиферацию, миграцию кератиноцитов и реэпителизацию [9]. Уменьшение экспрессии EGFR на поверхности клеток и подавление передачи сигналов EGFR может быть ключевым фактором в патогенезе хронических ран [1].

Иммуногистохимический анализ показал, что существуют некоторые закономерности, выявленные при окраске на маркеры HLA-DR, Bcl-2 и Ki67 в эпидермисе и дерме, которые не противоречат физио-логическому течению процессов регенерации в коже. Наименьшие показатели пролиферативной активности эпидермиса в группах с применением ЭФР, которые сопровождаются увеличением содержания Bcl-2, могут свидетельствовать о постепенном смещении баланса от пролиферации к дифференцировке эпидермиса, о восстановлении эпителиального слоя. В пользу процессов восстановления при применении ЭФР свидетельствует также рост HLA-DR-маркеров в эпидермисе. Данные показатели близки по своим значениям к показателям нормальной интактной кожи, установленным нами ранее [5].

Напротив, наибольшие показатели пролиферации клеток эпидермиса при применении дермазина, при невозможности выявить маркер Bcl-2, может свидетельствовать о затягивании фазы пролиферации. Самые высокие показатели HLA-DR в дерме при использовании дермазина также свидетельствуют об активном воспалительном процессе в наблюдаемые сроки.

Мы высказали предположение о наличии некоторого влияния методов лечения на иммуногистохимические показатели регенерирующей донорской раны.

Покрытие ПГКК сохраняет влажную среду в ране, необходимую для естественного заживления. При использовании только ПГКК в эпидермисе и в дерме количество пролиферирующих клеток (Ki67) наиболее высокое по сравнению с другими группами, однако их показатель дифференцировки (Bcl-2) низкий. Через 1 нед после использования ПГКК в дерме иммунокомпетентных клеток (HLA-DR) в 3 раза больше, чем в эпидермисе, а экспрессия маркера EGFR ниже в эпидермисе по сравнению с дермой. Можно предположить, что ПГКК не препятствует развитию воспалительного процесса в коже при лечении.

Использование ЭФР на донорских участках кожи позволяет сохранить пролиферативную активность клеток и повысить их устойчивость к апоптозу, способствует миграции иммунокомпетентных клеток в эпидермис.

Лечение ПГКК+ЭФР сохраняет пролиферативную активность клеток, в дерме поддерживает воспалительный процесс и в большей степени сохраняет устойчивость клеток к апоптозу, чем при использовании только ПГКК, влияет на регенераторную активность в эпидермисе.

Малое количество пациентов не позволяет нам делать окончательные выводы, но настраивает на дальнейшую работу в изучении вопросов, связанных с регенерацией кожи.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — Т.Н. Королькова

Сбор и обработка материала — Е.В. Круглик, Е.В. Зиновьев, Н.В. Калмыкова

Статистическая обработка данных — Е.В. Круглик, Н.В. Калмыкова

Написание текста — Е.В. Круглик, Т.Н. Королькова

Редактирование — Т.Н. Королькова

Authors’ contributions:

The concept and design of the study — T.N. Korolkova

Collecting and interpreting the data — E.V. Kruglik, E.V. Zinovyev, N.V. Kalmykova

Statistical analysis — E.V. Kruglik, N.V. Kalmykova

Drafting the manuscript — E.V. Kruglik, T.N. Korolkova

Revising the manuscript — T.N. Korolkova

Сведения об авторах

Королькова Т.Н. — https://orcid.org/0000-0001-7190-411X

Калмыкова Н.В. — https://orcid.org/0000-0003-4435-1884

Круглик Е.В. — https://orcid.org/0000-0002-2249-5441

Зиновьев Е.В. — https://orcid.org/0000-0002-2493-5498

КАК ЦИТИРОВАТЬ:

Королькова Т.Н., Калмыкова Н.В., Круглик Е.В., Зиновьев Е.В. Изучение иммуногистохимических показателей в эпидермисе и дерме при воздействии средств для регенерации кожи. Клиническая дерматология и венерология. 2019;18(4):-467. https://doi.org/10.17116/klinderma201918041

Автор, ответственный за переписку: Королькова Т.Н. —
e-mail: tnkor@mail.ru

Список литературы:

  1. Behm B, Babilas P, Landthaler M, Schreml S. Cytokines, chemokines and growth factors in wound healing. JEADV. 2012;26(7):812-820. https://doi.org/10.1111/j.1468-3083.2011.04415.x
  2. Коррекция рубцов. Под ред. Арндта К.А.; ред. серии Дж.С. Доувер; Пер. с англ. под общей редакцией Виссарионова В.А. М.: ООО «Рид Элсивер»; 2009.
  3. Рюмин Д.В. Эпидермальный фактор роста — спрей «GENETIME» в лечении эрозивных и эрозивно-язвенных баланитов и баланопоститов. Вестник последипломного медицинского образования. 2010;2:66-72.
  4. Thomas S. Hydrocolloid dressings in the management of acute wounds: a review of the literature. Intern Wound J. 2008;5:602-613. https://doi.org/10.1111/j.1742-481x.2008.00541.x
  5. Королькова Т.Н., Гома С.Е., Калмыкова Н.В. Иммуногистохимическое исследование кожи после мезотерапии пептидами и препаратом на основе нуклеиновых кислот. Клиническая дерматология и венерология. 2018;17(3):22-31. https://doi.org/10.17116/klinderma201817322
  6. Введение в молекулярную биологию канцерогенеза: Уч. пос. / А.А. Новик, Т.А. Камилова, В.Н. Цыган; Под ред. Шевченко Ю.Л. М.: ГЭОТАР-МЕД; 2004:103-130.
  7. Ярилин А.А. Основы иммунологии. М.: Медицина; 1999.
  8. Печерский А.В., Печерский В.И., Асеев М.В., Дробленков А.В., Семиглазов В.Ф. Некоторые аспекты процесса регенерации, осуществляемой посредством плюрипотентных стволовых клеток. Цитология. 2008;50(6):511-520.
  9. Oda K, Matsuoka Y, Funahashi A, Kitano H. A comprehensive pathway map of epidermal growth factor receptor signaling. Mol Syst Biol. 2005;1:2005.0010. https://doi.org/10.1038/msb4100014