Введение
Биологические материалы для регенеративной хирургии — это донорские, в основном соединительные ткани, которые подвергнуты специальной физико-химической обработке с элиминацией из них клеточных элементов. Это делается с целью снижения антигенных свойств тканей и сохранения отдельных биопластических и физико-механических свойств [1]. Имплантация таких биоматериалов обеспечивает селективный рост тканей в такой зоне без рубцевания или их инкапсуляции, а также способствует обратному развитию некоторых дегенеративно-дистрофических и поствоспалительных фиброзных изменений в тканях [2—5]. В опытах на животных уже установлено положительное действие таких аллогенных биоматериалов (АБ) на репаративные процессы в коже после моделирования термических и химических ожогов [6, 7]. При этом АБ препятствовал процессам грубого рубцевания кожи и способствовал образованию под хорошо регенерирующим эпителием регенерата, очень схожего по строению с дермой кожи. Известно, что холодовая травма кожи приводит к тяжелым повреждениям всех ее слоев, что проявляется некротическими изменениями эпидермиса, дермы и даже гиподермы [8—10]. Влияние же АБ после холодовой травмы кожи пока не исследовано.
Цель исследования — выявить влияние АБ на процессы восстановления кожи экспериментальных крыс после моделирования холодовой травмы.
Материал и методы
В эксперименте использовано 36 нелинейных белых крыс-самцов 6-месячного возраста (масса тела 200—250 г). Мы соблюдали основные требования, изложенные в Правилах лабораторной практики (Приказ Министерства здравоохранения и социального развития российской Федерации от 23.08.10 №708н «Об утверждении Правил лабораторной практики»). Этические принципы обращения с лабораторными животными соблюдали в соответствии с Европейскаой конвенцией о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или или в иных научных целях. Криодеструкцию кожи спины крыс, лишенной волосяного покрова, моделировали при помощи плоскогубцев с гладкой поверхностью в течение 1 мин, используя эфирный наркоз. Инструмент предварительно помещали в жидкий азот (‒195,75 °C). «Губками» инструмента захватывали у крысы участок кожи площадью 0,5 см2. После моделирования холодовой травмы крыс разделили на 3 группы. В контрольной группе наблюдали за процессом спонтанного заживления раны. Крысам 1-й опытной группы (на 3-и сутки после воздействия холодом) в зоне травмы подкожно ввели диспергированный АБ, изготовленный из сухожилий крыс по технологии аллоплант (регистр. удост. №фср2011/12012 от 03.02.15). Предварительно АБ в количестве 5 мг разводили в 2 мл физиологического раствора и вводили животным по 1 мл. Во 2-й опытной группе введение АБ произвели аналогичным способом и в той же дозировке через 14 дней после криодеструкции кожи. Фрагменты кожи в зоне криодеструкции забирали на 7, 14, 21, 30-е сутки после введения АБ, в контрольной группе — в те же сроки после криодеструкции. Ткани были зафиксированы в 10% забуференном формалине по Лилли и залиты в парафин. Гистологические срезы были изготовлены на микротоме Leica (Германия). Окрашивание срезов проводили гематоксилином и эозином, а также пикрофуксином по методу Ван-Гизона и методу Маллори. Выполнены иммуногистохимические исследования. Согласно протоколу производителя, определяли экспрессию цитокина трансформирующий фактор роста TGF-b1. Использовали мышиные моноклональные антитела (Santa Cruz Biotechnology) и универсальную систему вторичной детекции для визуализации выявленного комплекса. Реакцию проводили в гистостейнере Leica BOND MAX (Leica, Германия). Дальнейшее окрашивание срезов проводили раствором гематоксилина, затем заключали в бальзам. С помощью микроскопа Leica DMD-108 (Германия) при увеличении в 400 раз считали клетки, экспрессирующие цитокин (всего по 20 полей зрения в каждой группе). Общую оценку зависимости численности клеток (экспрессирующих исследуемый цитокин) от времени, прошедшего после моделирования холодовой травмы, проводили при помощи рангового дисперсионного анализа по Краскелу—Уоллесу, а сравнение отдельных выборок — с применением критерия Манна—Уитни [11, 12]. Соответственно, для описания результатов использовали медианы (Me), квартили (Q1 и Q3), а при необходимости — границы вариации (min—max). Формирование базы данных и все расчеты осуществляли с применением программного пакета Statistica 10 [13].
Результаты и обсуждение
У крыс контрольной группы на 7-е сутки после криовоздействия в зоне поражения определялся обширный очаг некроза всех слоев кожи, подкожной клетчатки, вплоть до подлежащей мышечной ткани с диффузно-очаговой лейкоцитарной инфильтрацией (рис. 1, а). Просветы кровеносных сосудов в глубоких слоях кожи были расширены и заполнены форменными элементами крови. В прилежащих к очагам некроза участках встречались небольшие зоны формирования рыхлой васкуляризированной грануляционной ткани с круглоклеточной инфильтрацией, преимущественно лимфоцитами, что является свидетельством выраженной воспалительной реакции (см. рис. 1, б). Через 14 сут эпителий не восстанавливался, а на месте дермы определялась грануляционная ткань из рыхлой васкуляризированной ткани, инфильтрированной воспалительными клетками (см. рис. 1, в).
Рис. 1. Морфологические изменения кожи крыс контрольной группы после криодеструкции.
а — 7-е сутки. Некроз всех слоев кожи с вовлечением подкожной клетчатки и подлежащей мышечной ткани, диффузно-очаговая лейкоцитарная инфильтрация (окраска гематоксилином и эозином, ув. 100); б — 7-е сутки. Грануляционная ткань с круглоклеточной инфильтрацией (окраска гематоксилином и эозином, ув. 200); в — 14-е сутки. Отсутствие эпителиального слоя (стрелка) под струпом (С) (окраска по Ван-Гизону, ув. 100); г — 21-е сутки. Грануляционная ткань (окраска по Маллори. Ув. 200); д — 30-е сутки. Бе2ссосудистая плотная рубцовая ткань в зоне криодеструкции (окраска по Ван-Гизону. Ув. 40); е — 30-е сутки. Клеточные инфильтраты (стрелка) в соединительнотканном регенерате (окраска гематоксилином и эозином, ув. 200); С — струп на ране; Э — эпителиальный слой; ГТ — грануляционная ткань; Р — рубцовая ткань.
На 21-е сутки струп с раны отпадал, но новый эпителиальный слой был тонким и неровным по толщине с дистрофическими изменениями клеток. Под ним продолжала формироваться грануляционная ткань из тонких коллагеновых волокон, фибробластов, лимфоцитов, макрофагов и новообразованных сосудов с тонкими стенками (см. рис. 1, г). Обращала на себя внимание выраженная пролиферация фибробластических клеток, являющихся, как известно, источником синтеза коллагена. На 30-е сутки на ране определялся неравномерный по толщине эпителиальный слой, местами утолщенный, а местами, наоборот, очень тонкий. Дерму без дифференцировки на сосочковый и сетчатый слои представляла бессосудистая плотная ткань по типу фиброзного рубца с беспорядочно упакованными грубыми пучками коллагеновых волокон (см. рис. 1, д). В норме дермальный слой кожи выглядит как переплетающиеся между собой оформленные пучки четко очерченных коллагеновых волокон, ориентированных в трех проекциях и содержащих между собой кровеносные сосуды. В соединительнотканном регенерате придатки кожи в виде сальных и потовых желез, а также волосяные фолликулы не обнаруживали. Среди грубых толстых коллагеновых волокон местами продолжали выявляться участки незрелой грануляционной ткани с выраженной воспалительной инфильтрацией, свидетельствующей о хронизации процесса (см. рис. 1, е).
У крыс 1-й опытной группы (введение АБ на 3-й день после криодеструкции) на 7-е сутки под отпадающим струпом на всей поверхности раны уже выявлялась хотя и неширокая, но относительно ровная полоса нового эпителиального слоя (рис. 2, а). Под ним определялась зона грануляционной ткани. Она состояла из новообразованных очень тонких коллагеновых волокон, между которых определялись тонкостенные сосуды капиллярного типа и фибробласты (см. рис. 2, б). Фибробластическая реакция в формирующейся ткани была умеренно выраженной. В более глубоких слоях дермальной пластинки отечность пропадала, а кровеносные сосуды немного сужались. На 14-е сутки после введения АБ соединительнотканный регенерат становился более плотным, наблюдались признаки начала его ремоделирования или «созревания» ткани с формированием более толстых оформленных волокнистых элементов (см. рис. 2, в). Многие сосуды грануляционной ткани подвергались редукции. На 21-е сутки после введения АБ зона повреждения была покрыта ровным эпителиальным слоем. Под ним определялся соединительнотканный регенерат, состоящий из плотных пучков тонких коллагеновых волокон, среди которых выявлялось небольшое количество мелких капилляров (см. рис. 2, г). Через 30 сут после введения АБ дерма кожи в большей своей части была представлена волокнистой соединительной тканью. Между фуксинофильных пучков коллагеновых волокон определялись веретенообразные фибробласты (см. рис. 2, д). Строение в пучках коллагеновых волокон регенерата во многих участках было схоже с таковой дермы в здоровых участках кожи. Признаков воспалительных реакций в месте моделирования холодовой травмы и грубого рубцевания тканей не выявлено (см. рис. 2, е). Наряду с этим отмечены отдельные признаки регенерации дериватов кожи в виде пролиферации с периферии в соединительнотканный регенерат сальных желез и волосяных фолликулов.
Рис. 2. Морфологические изменения кожи крыс 1-й опытной группы (применение АБ через 3 суток после криодеструкции).
а — 7-е сутки после введения АБ. Десквамация струпа и формирование тонкого эпителиального слоя (стрелка) на грануляционной ткани (окраска гематоксилином и эозином, ув. 40); б — 7-е сутки после введения АБ. Формирование грануляционной ткани (окраска по Маллори, ув. 100); в — 14-е сутки. Формирующийся соединительнотканный регенерат под эпителием (окраска по Маллори, ув. 200); г — 21-е сутки (окраска по Ван-Гизону, ув. 200); д — 30-е сутки. Соединительнотканный регенерат на месте криодеструкции (окраска по Ван-Гизону, ув. 40); е — 30-е сутки. Отсутствие воспалительных инфильтратов, регенерация волосяных фолликулов и сальных желез (стрелка) в регенерате (окраска гематоксилином и эозином, ув. 100); С — струп на ране; Э — эпителиальный слой; ГТ — грануляционная ткань; СР — соединительнотканный регенерат.
Во 2-й опытной группе АБ применяли через 14 дней после криодеструкции кожи, при этом струп еще не подвергался десквамации и покрывал рану. Но через 7 последующих дней после введения АБ он отпадал, эпителиальный слой на ране присутствовал, но был тонким и неровным по толщине (рис. 3, а). Под ним определялись участки грануляционной ткани с тонкими коллагеновыми волокнами и небольшим количеством сосудов, а также уже сформировавшиеся похожие по структуре на рубцовую ткань более плотные участки. Сплетения пучков коллагеновых волокон в соединительнотканном регенерате несколько различались от таковых дермы в непораженных участках кожи, они были более однонаправленными, но признаков воспалительных реакций в тканях или грубого рубцевания не было. По краям регенерата местами определялись признаки регенерации отдельных волосяных фолликулов. Через 14 сут после введения АБ новообразованная соединительная ткань под эпителием также имела неоднородное строение (см. рис. 3, б). Участки с тонковолокнистой структурой чередовались с небольшими по площади очагами ткани, которые состояли из относительно толстых оформленных пучков коллагеновых волокон. К 21-м суткам ткань под эпителием становилась более «зрелой» и однородной по структуре (см. рис. 3, в). Через 30 сут после введения АБ сформировавшийся соединительнотканный регенерат под ровным слоем эпителия был представлен оформленной волокнистой соединительной тканью и состоял из плотно сложенных пучков извитых коллагеновых волокон и многочисленных фибробластов между ними (см. рис. 3, г).
Рис. 3. Морфологические изменения кожи крыс 2-й опытной группы (применение АБ через 14 суток после холодовой травмы).
а — 7-е сутки после введения АБ. Отсутствие струпа и формирование тонкого эпителиального слоя на грануляционной ткани (окраска гематоксилином и эозином, ув. 100); б — 14-е сутки после введения АБ. Неоднородная структура соединительнотканного регенерата (окраска по Ван-Гизону, ув. 100); в — 21-е сутки. Формирующийся плотный соединительнотканный регенерат под восстановившимся эпителием (окраска по Ван-Гизону, ув. 100); г — 30-е сутки. Сформировавшийся соединительнотканный регенерат, покрытый эпителием. Регенерация волосяных фолликул (стрелка) и сальных желез кожи (окраска гематоксилином и эозином, ув. 100). Э — эпителиальный слой; ГТ — грануляционная ткань; СР — соединительнотканный регенерат.
Полученные результаты гистологических исследований согласуются с данными иммуногистохимических исследований по выявлению в тканях противовоспалительного цитокина TGF-b. По современным представлениям TGF-b — это профибротический цитокин, играющий ведущую роль в патогенезе рубцовых преобразований в тканях [5, 6, 14, 15]. Считается, что этот ростовой фактор, обладающий рядом неоднозначных репаративных и иммуносупрессивных эффектов, прямо коррелирует с экспрессией фактора роста фибробластов FGF-1, способствующим усиленной пролиферации фибробластических клеток — главных источников синтеза коллагена при формировании коллагеновых волокон. В нашем опыте количество клеток, экспрессирующих цитокин TGF-β, довольно сильно зависело от времени, прошедшего после моделирования холодовой травмы. Эта зависимость проявляется в последовательном снижении численности таких клеток, которое гораздо отчетливее выражено в обеих опытных группах по сравнению с контрольной группой (рис. 4). В 1-й и 2-й опытных группах на всех этапах наблюдения значения достаточно близки и до срока 1 мес статистически значимо не различаются: на 7-й день Me составляет 41 (32,5, 3 57) клетку в 1-й группе и соответственно 37 (30, 57) клеток во 2-й группе (p>0,67), на 14-й день — 29 (24,5, 38) клеток в 1-й группе и 33,5 (24,5, 47,5) клетки во 2-й группе (p>0,30), на 21-й день — 22 (17, 26) клетки в 1-й группе и 24,5 (19, 31) клетки во 2-й группе (p>0,07). Но на 30-й день медианное значение числа TGF-β, экспрессирующих белок клеток в 1-й группе становится уже статистически значимо (p<0,002) ниже, чем во 2-й группе — 8,5 (7, 11) клетки против 12 (9, 17) клеток. В этот же срок число клеток этого типа в контрольной группе остается кратно выше — 44 (31,5, 57,5) клетки, так же как и в начале наблюдений на 7-й день — 100 (81, 127) клеток. Следовательно, на всем протяжении наблюдений количество экспрессирующих цитокин TGF-β клеток в контрольной группе остается существенно выше, чем в экспериментальных группах после введения АБ, где их количество снижается довольно радикально, причем в 1-й опытной группе с заметно большей интенсивностью. Отметим также, что в обеих опытных группах по мере удаления от момента нанесения холодовой травмы кожи кратно снижается внутригрупповая вариабельность количества таких клеток. Если на 7-й день границы вариации данного параметра в 1-й и 2-й группах составляли соответственно 24÷75 клетки и 14÷71 клетку, то через 1 мес — 4÷13 клеток и 6÷24 клетки.
Рис. 4. Количество клеток, экспрессирующих цитокин TGF-β, в контрольной и двух опытных группах (1-я и 2-я группы) в разные сроки после моделирования холодовой травмы и применения АБ.
По оси абсцисс сроки наблюдения — дни после холодовой травмы кожи (в контрольной группе) и дни после травмы и введения АБ в опытных группах (в 1-й группе — через 3 дня после травмы; во 2-й группе — через 14 дней после травмы). По оси ординат указано среднее количество на одно поле зрения микроскопа клеток, экспрессирующих цитокин TGF-β.
Установлено, что обычно уровень экспрессированного белка TGF-β прямо пропорционально коррелирует с выраженностью воспалительного процесса [16]. У контрольных животных мы выявили высокий количественный уровень данного цитокина, что также является одной из основных причин интенсивной пролиферации фибробластических клеток при формировании грануляционной ткани, которая приводит к фиброзу соединительнотканного регенерата в стадии ремоделяции. В данном случае мы наблюдали довольно длительную сохранность струпа и позднюю эпителизацию травмированной зоны кожи, что также не благоприятствует полноценному восстановлению стромы кожи. Можно полагать, что одним из решающих факторов благоприятного воздействия АБ на заживление раны кожи после холодовой травмы и ингибирование процессов грубого рубцевания тканей является более низкий уровень экспрессии клетками противовоспалительного цитокина TGF-b1.
У животных опытных групп при использовании АБ в отличие от животных контрольной группы во все сроки опыта на фоне относительно малой экспрессии противовоспалительного белка степень проявления воспалительных процессов была слабее. Уровень экспрессии TGF-b1 в 1-й опытной группе на 7-е сутки составил 41 (32,5; 57) клетку и во 2-й опытной группе — 37 (30; 57) клеток. Показатели были в 2,5—3 раза ниже, чем у животных контрольной группы в этот срок (p<0,001). У животных 1-й опытной группы десквамация струпа на созданной ране выявлялась уже на 7-е сутки после введения АБ, это происходило из-за ускоренной эпителизации раны. Так же, как в случае применения АБ при ожогах кожи, подкожное его введение животным в зоне холодовой травмы нивелирует интенсивность проявления признаков воспалительных процессов, что проявляется и умеренно выраженной фибробластической реакцией [6, 7]. Вследствие этого в отличие от контрольной группы, где происходит ускоренное грубое рубцевание грануляционной ткани, у животных опытной группы наблюдается образование более адекватного по строению соединительнотканного регенерата дермальной пластинки дермы кожи под восстановленным эпителиальным слоем [16].
Заключение
Восстановление эпителия и дермы кожи крыс в контрольной группе после холодовой травмы при высокой экспрессии фактора фиброза цитокина TGF-b сопровождается выраженной воспалительной реакцией с интенсивной пролиферацией фибробластов, приводящей к формированию несовершенного по своей структуре фиброзного рубца, покрытого неровным эпителиальным слоем. Использование диспергированного АБ через 3 сут в зоне холодовой травмы нивелирует проявление выраженных воспалительных процессов, способствует ускорению процессов эпителизации и раннему формированию грануляционной ткани, за счет экспрессии клетками более низкого уровня TGF-b1 вызывает умеренную фибробластическую реакцию, которая способствует образованию правильно упорядоченных коллагеновых волокон в дерме. Заживление пораженного участка кожи заканчивается формированием адекватного по структуре соединительнотканного регенерата под полностью восстановленным эпителием и с признаками регенерации дериватов кожи. После применения АБ через 14 сут в зоне уже формирующегося криогенного рубца в большей его части происходит заметная трансформация его в плотную волокнистую соединительную ткань с содержанием более однонаправленных пучков коллагеновых волокон нежели в дерме кожи, но признаков воспалительных реакций в тканях или грубого рубцевания не отмечается. Результаты, полученные в эксперименте над животными, вероятно, с известной долей условности можно экстраполировать на процессы при криовоздействии на организм человека.
Финансирование. Работа выполнена в рамках Государственного задания №056-00124-21-00, утвержденного 23.12.2020.
Участие авторов:
Концепция и дизайн исследования: Мусина Л.А. Лебедева А.И., Шангина О.Р.
Сбор и обработка материала: Мусина Л.А., Лебедева А.И., Шангина О.Р., Гареев Е.М.
Статистическая обработка: Гареев Е.М.
Написание текста: Мусина Л.А.
Редактирование: Лебедева А.И., Шангина О.Р.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Financing. The work was performed within the framework of State Task No. 056-00124-21-00, approved on 12/23/2020.
Authors’ contributions:
The concept and design of the study: Musina L.A., Lebedeva A.I., Shangina O.R.
Collecting and interpreting the data: Musina L.A., Lebedeva A.I., Shangina O.R., Gareev E.M.
Statistical analysis: Gareev E.M.
Drafting the manuscript: Musina L.A.
Revising the manuscript: Lebedeva A.I., Shangina O.R.