Введение

Рост заболеваемости эпителиальными опухолями кожи регистрируется во всех регионах мира. Чаще всего выявляется себорейный кератоз (СК), представляющий собой доброкачественную опухоль из кератиноцитов, заболеваемость которым в отдельных регионах мира составляет 79% в возрастной группе 26–50 лет и 100% у лиц старше 50 лет [1]. Рак кожи является самой частой злокачественной патологией в США. По данным Американского онкологического общества, ежегодно 5,4 млн случаев базально-клеточного (БКР) и плоскоклеточного (ПКР) рака диагностируется у 3,3 млн человек в США, причем 80% случаев приходится на БКР [2]. У светлокожих лиц, подвергающихся интенсивному ультрафиолетовому излучению, нередко первичный БКР и ПКР развиваются из актинического кератоза (АК), который представляет собой локальную внутриэпидермальную атипию кератиноцитов. Риск трансформации АК в инвазивную карциному варьирует в различных исследованиях, составляя от 0,1 до 20% [3].

Клаудины — семейство белков, являющихся составной частью плотных контактов клеток эпителия. Семейство состоит из 27 белков, основная функция которых заключается в формировании клеточного барьера и регуляции межклеточного взаимодействия [4]. В эпидермисе экспрессируются клаудины-1, -2, -4, -6, -7 [5]. Важную роль в процессе формирования эпидермального барьера играет клаудин-1 [5]. Мыши с дефицитом клаудина-1 умирали от массивной потери жидкости в течение 1 дня после рождения, несмотря на сохранность в полном объеме компонентов рогового слоя (белки и липидная прослойка) [6]. Аномальная экспрессия клаудина-6 в эпидермисе мышей также приводила к изменению барьерной функции [7]. Кроме того, клаудины активируют сигнальные белки, контролирующие клеточную пролиферацию, дифференцировку и полярность, действуя как многофункциональный комплекс [4]. Об участии клаудина-1 в процессе кератинизации свидетельствует формирование участков гиперкератоза на поверхности кожи мышей с его дефицитом [6]. Отсутствие клаудина-1 в результате гомозиготной мутации гена установлено у больных с синдромом неонатального склерозирующего холангита, который сопровождался ихтиозом [8]. Интенсивную экспрессию клаудина-4 вокруг роговых «жемчужин» наблюдали при ПКР кожи [9]. Изменение экспрессии плотных контактов, частью которых являются клаудины, отмечали при псориазе, что также свидетельствовало о вовлечении этих молекул в процессы кератинизации [10].

Плотные контакты и белки, их образующие, отвечают за адгезивное взаимодействие клеток между собой и с экстрацеллюлярным матриксом. Как правило, нарушение адгезионных взаимодействий сопровождает злокачественный рост, снижение адгезии приводит к инвазивному росту опухолей, повышению потенциала клеток к миграции и метастазированию. Однако роль клаудинов в этих процессах пока не до конца понятна. Сообщалось как об усилении экспрессии различных клаудинов, так и об ее снижении в опухолях, локализующихся в различных тканях. В опухолях кожи и слизистых оболочек наблюдали уменьшение экспрессии клаудина-1. При химическом канцерогенезе кожи мыши показана постепенная утрата экспрессии клаудина-1 в процессе развития опухоли под воздействием диметилбензантроцена и тетрадеканоилфорболацетата [11]. К 12-й неделе отсутствие иммунореактивности регистрировали в большинстве клеток базальных и супрабазальных отделов акантотических разрастаний эпидермиса, сохранялась мембранная экспрессия только в самых верхних его отделах [11]. Снижение экспрессии клаудина-1 наблюдали в клетках АК и ПКР по сравнению с нормальной кожей [12]. По мере увеличения плоскоклеточной интраэпителиальной неоплазии (SIN) в случаях лейкоплакии экспрессия клаудина-1 прогрессивно уменьшалась на мембране клеток, а при плоскоклеточной карциноме слизистой оболочки полости рта практически полностью отсутствовала [13]. Вероятно, уменьшение экспрессии клаудина-1 на поверхности плазматической мембраны ведет к снижению межклеточной адгезии и обмена сигнальными субстанциями, которые могли бы тормозить деление и миграцию клеток. Для дальнейшего выяснения роли калудина-1 в адгезионном взаимодействии опухолевых клеток представляются целесообразными сравнительные исследования его экспрессии в доброкачественных и злокачественных новообразованииях.

Цель исследования — изучение экспрессии клаудина-1 в доброкачественных и злокачественных опухолях кожи эпителиального происхождения.

Материал и методы

В работе использован биопсийный материал 51 опухоли кожи, полученный в период 2017–2018 гг. При гистологическом исследовании высокодифференцированный ПКР диагностирован в 9 случаях, БКР — в 11 (солидный тип — 5, инфильтративный — 3, солидно-микронодулярный — 2, солидно-аденоидный — 1), АК — в 11, СК — в 10, инвертирующий фолликулярный кератоз (ИФК) — в 10.

Иммуногистохимическое исследование проводили по стандартному протоколу с антителами к клаудину-1 (кроличьи поликлональные, разведение 1:50, «Cell Marque», США) с использованием автостейнера (Autostainer, «ThermoScientific», тип 480s), а при небольшом объеме ткани в биопсийных образцах — в ручном режиме. Депарафинирование срезов и восстановление антигенности проводили в буфере pH 9,0 в PT Module («ThermoScientific», Великобритания).

Выделяли следующие типы экспрессии клаудина-1: мембранный (равномерное распределение маркера по всей клеточной мембране), мембранно-редуцированный (распределение маркера на отдельных участках клеточной мембраны), цитоплазматический (распределение маркера в цитоплазме), мембранно-цитоплазматический (распределение маркера на мембране и в цитоплазме), мембранно-редуцированный цитоплазматический (распределение маркера на отдельных участках мембраны и в цитоплазме), отсутствие иммунореактивности.

Для обработки данных использовались методы определения средней величины±среднее отклонение, t-Стьюдента с поправкой для множественных значений.

Результаты

Экспрессия адгезивной молекулы клаудина-1 в нормальной коже определялась в шиповатом слое, где наблюдалось четкое мембранное окрашивание, представленное в виде сетки по контуру клеток. В базальном слое эпидермиса клаудин-1 не экспрессировался. По мере продвижения к роговому слою экспрессия клаудина-1 снижалась, а в роговом слое уже не определялась. Четкая мембранная экспрессия регистрировалась на клетках волосяных фолликулов, сальных желез, эккринных потовых железах.

В клетках ПКР клаудин-1 экспрессировался на мембране и в цитоплазме, в части клеток иммунореактивность отсутствовала (рис. 1). Сочетание мембранного типа экспрессии и отсутствия иммунореактивности наблюдали в 1 случае, мембранно-редуцированного и полного отсутствия иммунореактивности — в 2. В 1 случае наблюдали сочетание мембранного, мембранно-редуцированного и цитоплазматического типов экспрессии, в 2 — мембранного, мембранно-редуцированного и отсутствия иммунореактивности, в 2 — мембранно-редуцированного, цитоплазматического и отсутствия иммунореактивности. В 1 случае наблюдали мембранный, мембранно-редуцированно-цитоплазматический тип экспрессии и отсутствие иммунореактивности. При подсчете процентного соотношения типов экспрессии установлено, что 4600 (51,2%) клеток не имело иммунореактивности, мембранный тип экспрессии имело 1300 (14,4%) клеток, мембранно-редуцированный — 1900 (21,1%), цитоплазматический — 1200 (13,3%).

Рис. 1. Плоскоклеточный рак кожи (отрицательная иммунореактивность и мембранная экспрессия).

Иммуногистохимическое окрашивание с анителами к клаудину-1, ПАП-метод, докрашивание гематоксилином Майера. ×400.

В клетках БКР клаудин-1 экспрессировался на мембране и в цитоплазме, часть клеток клаудин-1 не экспрессировала (рис. 2). Отмечали следующее сочетание типов экспрессии: мембранного и цитоплазматического — 1 случай, мембранного и мембранно-цитоплазматического — 3, мембранного, цитоплазматического и отсутствие иммунореактивности — 1, мембранного и мембранно-редуцированно-цитоплазматического — 2, мембранного, мембранно-редуцированно-цитоплазматического и мембранно-цитоплазматического — 1, мембранно-редуцированного, цитоплазматического и мембранно-цитоплазматического — 2, мембранного, мембранно-редуцированного, цитоплазматического и мембранно-цитоплазматического — 1. Процентный подсчет типов экспрессии показал, что 4350 (39,5%) клеток имели мембранный тип экспрессии, цитоплазматический — 2790 (25,3%), мембранно-цитоплазматический — 2230 (20,2%), мембранно-редуцированно-цитоплазматический — 830 (7,5%), мембранно-редуцированный — 300 (2,7%), отсутствие иммунореактивности — 500 (4,5%).

Рис. 2. Базально-клеточный рак кожи (мембранно-цитоплазматическая экспрессия).

Иммуногистохимическое окрашивание с анителами к клаудину-1, ПАП-метод, докрашивание гематоксилином Майера. ×400.

В клетках АК определялась четкая мембранная экспрессия в шиповатом слое эпидермиса, отсутствие иммунореактивности в базальном слое (рис. 3). Подобная картина отмечена в 8 случаях АК. В 1 случае наблюдали отсутствие иммунореактивности в широких акантотических тяжах в базальном и надбазальных слоях, мембранная экспрессия появлялась только в верхних отделах шиповатого слоя. В 2 случаях в шиповатом слое наряду с мембранной экспрессией наблюдали единичные клетки, в которых маркер выявлялся в цитоплазме. Большинство — 4650 (84,6%) клеток АК экспрессировали клаудин-1 четко на мембране, в 800 (14,5%) клетках иммунореактивность отсутствовала, в 50 (0,9%) клетках была цитоплазматической.

Рис. 3. Актинический кератоз (мембранная экспрессия, отрицательная иммунореактивность в базальном слое эпидермиса).

Иммуногистохимическое окрашивание с анителами к клаудину-1, ПАП-метод, докрашивание гематоксилином Майера. ×400.

В клетках СК клаудин-1 экспрессировался четко на мембране в центре клеточных комплексов, в узкой зоне по периферии комплексов экспрессия отсутствовала (рис. 4). В 1 случае в центре комплексов регистрировали мембранную экспрессию в 30% клеток, мембранно-редуцированную — в 70%. В 1 случае экспрессия отсутствовала как в центре комплексов, так и по периферии, сохраняясь только на мембране клеток, локализующихся вокруг роговых кист. Большинство — 7410 (80,6%) клеток СК экспрессировали клаудин-1 на мембране, из них 6,5% имели мембранно-редуцированную экспрессию, иммунореактивность отсутствовала в 1940 (19,4%) клетках.

Рис. 4. Себорейный кератоз (мембранная экспрессия, отрицательная иммунореактивность по периферии комплексов).

Иммуногистохимическое окрашивание с анителами к клаудину-1, ПАП-метод, докрашивание гематоксилином Майера. ×400.

В 9 случаях ИФК наблюдали мембранную экспрессию клаудина-1 в центре комплексов, по периферии экспрессия не визуализировалась. В 1 случае в центре комплексов визуализировали мембранно-редуцированную, цитоплазматическую экспрессию и отсутствие иммунореактивности. На мембране клаудин-1 экспрессировали 7650 (79,7%) клеток, 240 (2,4%) — в цитоплазме, в 1790 (17,9%) клетках иммунореактивность отсутствовала.

Сравнительные исследования иммунореактивности в эпителиальных опухолях кожи показали, что при АК, СК и ИФК клаудин-1 преимущественно экспрессировался на мембране, данный тип экспрессии статистически значимо превышал цитоплазматический тип и отсутствие иммунореактивности (p<0,05). При ПКР и БКР половина клеток экспрессировала клаудин-1 на мембране, остальные характеризовались цитоплазматической экспрессией и отсутствием иммунореактивности. При ПКР достоверно чаще отсутствовала иммунореактивность (p<0,05), при БКР — экспрессия в цитоплазме (p<0,05). Экспрессия клаудина-1 на мембране достоверно отличает АК, СК и ИФК от ПКР и БКР (p<0,05).

Обсуждение

Роль клаудина-1 в процессе канцерогенеза до конца не понятна. Установлена его аномальная экспрессия (дисрегуляция) в раке легкого, молочной железы, толстой кишки, шейки матки, слизистой оболочки полости рта, меланоме и других опухолях [14]. Уменьшение интенсивности экспрессии клаудина-1 наблюдалось в клетках колоректального рака, при этом минимальной она была при III–IV стадии и ассоциировалась с низкой выживаемостью пациентов, хотя не была связана с уровнем инвазии и наличием регионарных метастазов [15, 16]. Клаудин-1-негативный фенотип рака молочной железы ассоциировался с увеличением частоты рецидивов и плохой выживаемостью пациентов [17]. Напротив, появление регионарных метастазов и рецидив опухоли ассоциировались с появлением клаудина-1 в инвазивных выростах рака слизистой оболочки полости рта [18]. Гиперэкспрессия клаудина-1 наблюдалась в раке шейки матки, причем она ассоциировалась с появлением метастазов в лимфатические узлы и плохим прогнозом выживаемости, который был лучше у пациентов с клаудин-1-негативными опухолями [19, 20]. В то же время интенсивная экспрессия клаудина-1 ассоциировалась с низким метастатическим потенциалом аденокарциномы легкого и свидетельствовала о более благоприятном прогнозе у этих больных [21].

Снижение интенсивности экспрессии молекул адгезии в злокачественных опухолях достаточно понятно. Именно потеря межклеточных связей приводит к инвазии и появлению метастазов. Сложнее понимание усиленной экспрессии этих молекул в ряде злокачественных образований. Вероятно, вовлечение различных сигнальных путей в неопластическую трансформацию может приводить либо к подавлению, либо к активации одинаковых генов в зависимости от вида ткани и органа.

Усиление экспрессии клаудина-1, -3, -5 ассоциировано с усилением экспрессии металлопротеиназы-2 и -9, что способствовало инвазии опухолевых клеток в окружающие ткани. Ингибирование клаудина-1 приводило к снижению активности металлопротеиназы-9 в раке толстой кишки [22].

В большинстве исследований злокачественных опухолей кожи говорится о снижении интенсивности экспрессии клаудина-1, вплоть до полного ее отсутствия при выраженной клеточной атипии. В нашем исследовании половина клеток ПКР не экспрессировала клаудин-1, а 13,3% клеток экспрессировали его в цитоплазме, при этом нормальная мембранная экспрессия регистрировалась только в 14,4% клеток. Уменьшение интенсивности мембранной экспрессии клаудина-1 в клетках ПКР по сравнению с нормальной кожей отмечали и ранее [23]. Есть также данные о выраженном снижении ее интенсивности в ПКР по сравнению с раком in situ и АК [9, 12].

В отличие от ПКР в БКР 40% клеток интенсивно экспрессировали клаудин-1 на мембране. Отсутствие иммунореактивности наблюдалось в единичных случаях (4% клеток), в то же время половина клеток экспрессировала клаудин-1 в цитоплазме как в чистом виде, так и в сочетании с мембранной экспрессией. Аномальная локализация клаудина-1 была описана ранее. Так, его ядерная локализация наблюдалась в клетках меланомы, где на его транслокацию влияло фосфорилирование протеинкиназы C [24]. Ядерная и цитоплазматическая экспрессия также обнаружена в клеточных линиях рака носоглотки, где она ассоциировалась со снижением способности к апоптозу [25]. Клаудин-1 экспрессировался в ядре и цитоплазме клеток колоректального рака [16]. Как правило, аномальная локализация адгезивных молекул в клетке совпадает с онкогенной трансформацией и пролиферацией [26].

АК представляет собой локальную интраэпидермальную атипию кератиноцитов, которая развивается на участках кожи, подверженных инсоляции. Пятая часть этих образований с течением времени трансформируется либо в ПКР, либо в БКР кожи. Ранее сообщалось о достоверном снижении интенсивности экспрессии клаудина-1 в клетках АК по сравнению с нормальной кожей, в то же время значимых различий характера его экспрессии в зависимости от степени дисплазии не наблюдали [12]. Другие авторы подтверждали снижение экспрессии клаудина-1 в клетках АК по сравнению с нормальной кожей и подчеркивали ее прогрессивное уменьшение в участках тяжелой дисплазии по сравнению с легкой и средней степенью тяжести [27]. В нашем исследовании в клетках АК четкая мембранная экспрессия регистрировалась в шиповатом слое эпидермиса, в базальном слое иммунореактивность отсутствовала. Только в 1 случае, который характеризовался дисплазией III степени, наблюдалось расширение зоны с отсутствием иммунореактивности в широких акантотических тяжах, мембранная экспрессия появлялась только в верхних отделах шиповатого слоя. Прогрессивное уменьшение интенсивности экспрессии клаудина-1 на мембране клеток коррелировало с увеличением плоскоклеточной интраэпителиальной неоплазии (SIN) в случаях лейкоплакии слизистой оболочки полости рта [13].

Более 80% клеток СК и ИФК четко экспрессировали клаудин-1 на мембране, занимая всю центральную часть клеточных комплексов. Два—три ряда клеток, локализующихся по периферии комплексов, его не экспрессировали.

Заключение

Установлены различия в особенностях экспрессии клаудина-1 в клетках доброкачественных и злокачественных эпителиальных опухолей кожи. Мембранная экспрессия клаудина-1 статистически значимо преобладала в АК, СК и ИФК по сравнению с ПКР и БКР (p<0,05). Половина клеток ПКР и БКР аномально экспрессировала клаудин-1: при ПКР достоверно чаще встречалось отсутствие иммунореактивности (p<0,05), при БКР — экспрессия в цитоплазме (p<0,05).

При АК определялась выраженная зональность распределения иммунореактивности (наличие в шиповатом слое и отсутствие в базальном) аналогичная нормальному эпидермису. Зональная экспрессия клаудина-1 также отмечалась в клеточных комплексах СК и ИФК: клетки, экспрессирующие клаудин-1, располагались в центре комплексов, клетки, в которых иммунореактивность отсутствовала, — по периферии. В комплексах ПКР и БКР наблюдалось хаотичное распределение клеток с различным типом иммунореактивности.

Работа проведена без привлечения дополнительного финансирования со стороны третьих лиц.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования: А.Н. Хлебникова, Т.Г. Седова

Сбор и обработка материала: Е.В. Селезнева, Л.Е. Гуревич, Т.Г. Седова

Статистическая обработка: Е.В. Селезнева

Написание текста: А.Н. Хлебникова, Т.Г. Седова

Редактирование: А.В. Молочков, А.Н. Хлебникова, Л.Е. Гуревич

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.