Введение
Ультрафиолетовое (УФ) излучение является частью общего спектра солнечного излучения и вступает в сложное комплексное взаимодействие с живыми организмами и биотканями. В краткосрочном периоде УФ-облучение способствует образованию в коже витамина D, обладает бактерицидным эффектом (как правило, УФ типа C), а при высоких дозах может приводить к формированию УФ-эритемы (солнечного ожога). При длительной экспозиции ультрафиолет потенциально индуцирует образование злокачественных опухолей, дегенеративные изменения кожи (фотостарение), иммуносупрессию [1]. Таким образом, изучение механизмов взаимодействия УФ-излучения с биотканями может помочь в разработке методов ранней диагностики УФ-индуцированных заболеваний кожи и назначению своевременного лечения таких дерматозов. Другим аспектом, диктующим необходимость исследования биологического воздействия УФ-облучения на организм человека, является широкое применение ультрафиолета различного спектра в качестве терапевтического агента в отношении многих дерматозов.
Процессы взаимодействия УФ-гамма-квантов различных энергий подробно описаны в ряде работ [2], но основное повреждающее действие ультрафиолета любого диапазона обусловлено прямым или косвенным (за счет генерации активных форм кислорода) повреждением ДНК, приводящим к разрыву ее цепи, запуску процессов репарации, контроля клеточного цикла, апоптоза, транскрипции и т.д. [3]. Накопление генетических изменений в совокупности с подавлением активности иммунной системы, вызванные действием ультрафиолета, могут стать причиной базально-, плоскоклеточного рака кожи и меланомы [4]. Так, описана УФ-индуцированная мутация в гене опухолевый супрессии p53 при плоскоклеточном раке. Кроме того, экзомный анализ выявил убедительные генетические доказательства прямой мутагенной роли УФ-излучения в патогенезе меланомы [5]. Потому УФ-излучение относят к канцерогенным факторам. Действие ультрафиолета также вызывает разрушение белков, образование более сложных биологических молекул с новыми физико-химическими свойствами и активных радикалов. В частности, действие ультрафиолета индуцирует выделение гистамина и ацетилхолина, которые при попадании в кровоток оказывают влияние на тонус сосудов, мышц, нервных волокон [1].
Научный и практический интерес, в частности, представляет изучение реакций кожи на хроническое УФ-воздействие. Длительное и повторяющееся УФ-воздействие является важным фактором, влияющим на характер и темпы возрастной дегенерации кожи. Фотостарение проявляется в виде сухости и истончения, замедления процессов регенерации кожи, связано с деградацией коллагена, эластина, гиалуроновой кислоты кожи [6]. В рутинной клинической практике выраженность фотостарения главным образом определяется визуально и по косвенным признакам, что является субъективным, связано с высокой вариабельностью получаемых показателей, ошибками в диагностике, а также с разрозненным сбором данных для клинических исследований. Неверное определение влияния ультрафиолета на кожу пациента может привести к неправильным клиническим решениям, увеличению сроков госпитализации и постановки правильного диагноза, а также затрат на лечение.
В научной литературе активно обсуждаются перспективы применения методов неинвазивной оптической диагностики для оценки выраженности и динамики развития УФ-индуцированного повреждения кожи и фотостарения. Оптическое излучение видимого и ближнего инфракрасного диапазонов, как и высокочастотное ультразвуковое излучение, позволяют проводить интроскопию кожи с высоким пространственным разрешением быстро и неинвазивно [7]. При этом степень фотостарения оценивается по структурным изменениям кожи, в частности, по изменению плотности и структур коллагеновых волокон, кератиноцитов, толщины эпидермиса и др. [8, 9]. E. Cinotti и соавт. [8] продемонстрировали применимость конфокальной микроскопии для дифференциальной диагностики ультраструктурных изменений кожи при фото- и хроностарении у 209 добровольцев в возрасте 74–81 года. Однако анализ таких данных субъективен, зависит от опыта и квалификации исследователя.
Лазерная флуоресцентная спектроскопия позволяет объективно и количественно оценить изменения в биохимическом составе тканей. Чаще всего в рамках исследования процессов фотостарения авторы изучают изменения спектров флуоресценции коллагена и эластина [10, 11], реже — триптофана [12].
Большое число работ посвящено объективной оценке фотостарения, между тем они сфокусированы в первую очередь на применении какого-либо одного оптического метода, анализируют ограниченное количество маркеров (в основном коллаген) анатомических зон и не предлагают новых методов постобработки и интерпретации полученных данных. Таким образом, комплексный анализ хронических УФ-индуцированных изменений кожи при помощи арсенала современных оптических методов с оценкой нескольких оптических маркеров, отражающих разные звенья патогенеза фотостарения, остается актуальным.
Цель исследования — анализ применимости коллагена и липофусцина как флуоресцентных маркеров для оценки УФ-индуцированных изменений кожи in vivo.
Материал и методы
В проспективное исследование вошли 44 участника евразийского происхождения со II фототипом кожи по Фитцпатрику, длительное время проживавших на территории одного региона (Москва и Московская область). Выделено 4 возрастные группы: 18–29 лет (средний возраст 25 лет, 3 мужчины и 8 женщин), 30–44 года (средний возраст 36 лет, 7 мужчин и 4 женщины), 45–59 лет (средний возраст 53 года, 5 мужчин и 7 женщин), старше 60 лет (средний возраст 66 лет, 4 мужчины и 6 женщин). Согласно усредненным результатам оценки по классификации Р. Глогау, участники 1-й группы преимущественно имели I стадию фотостарения (слабовыраженные мимические морщины, умеренные нарушения пигментации, отсутствие гиперкератоза), 2-й группы — II стадию (заметные мимические морщины, пальпируемые очаги гиперкератоза, желтоватый оттенок кожи, пигментные нарушения), а 3-й и 4-й — III стадию (выраженное фотоповреждение — статические мощины, дисхромии, телеангиэктазии, многочисленные пигментные пятна, выраженные очаги гиперкератоза). Все участники подписали добровольное информирование согласие на участие в исследовании. Критериями исключения из исследования: сахарный диабет, тяжелые сердечно-сосудистые заболевания (ишемическая болезнь сердца, в том числе стенокардия напряжения III–IV ФК, хроническая сердечная недостаточность III–IV ФК, инфаркт миокарда, инсульт в анамнезе, коронарная/каротидная реваскуляризация, заболевания периферических артерий), тяжелые нарушения ритма сердца (мерцательная аритмия, частая экстрасистолия и др.), диагностированные системные аутоиммунные заболевания, заболевания крови — тромбоцитопения, анемия (гемоглобин менее 90 г/л), беременность, заболевания кожи в стадии обострения, отказ от участия в исследовании.
Исследование проводили в несколько этапов: 1 — анкетирование, направленное на самостоятельное определение фототипа кожи и выявление критериев исключения из исследования; 2 — осмотр участников врачом-дерматовенерологом, сбор анамнеза, повторная оценка фототипа кожи, градация выраженности старения по классификации Глогау; 3 — исследование интактной кожи методом лазерной флуоресцентной спектроскопии в областях, подвергаемых хроническому УФ-воздействию; 4 — оценка среднего уровня меланиновой пигментации; 5 — статистический анализ полученных данных. Выбор для исследования точек, характеризующихся фотостарением, обусловлен выраженностью в них изучаемых УФ-индуцированных изменений. Исследуемые области подвержены инсоляции в течение жизни человека: лоб (в проекции фронтальных бугров — 3 точки), симметричные точки в области мочек ушей и скул.
Измерения методом лазерной флуоресцентной спектроскопии проводили с применением многофункционального комплекса лазерной диагностики ЛАКК-М (ООО НПП «ЛАЗМА»). В этом приборе осуществляется доставка лазерного излучения по волоконно-оптическому зонду, выходная мощность на дистальном конце которого не превышает 10 мВт. Лазерное излучение возбуждает флуоресценцию эндогенных флуорофоров в тканях, которая проявляется в спектре вторичного излучения от биоткани. Регистрируемый сигнал доставляется приемным волокном и отображается в режиме реального времени на мониторе. Описание схемы работы комплекса приведено в более ранней работе [13]. Длины волн возбуждающего флуоресценцию лазерного излучения (λe) составляли 365 нм (УФ) и 535 нм (зеленый диапазон). В спектрах анализировали следующие эффективные длины волн флуоресценции (λf): 420 и 455 нм — максимум флуоресценции коллагена и эластина; 480 нм — совокупность эндогенных флуорофоров: липофусцин, ФАД, жирные кислоты и др.; 580 нм — липофусцин. Для количественной оценки содержания флуорофоров использовали индекс тканевого содержания (ηf), вычисляемый по формуле:
,
где If — интенсивность флуоресценции на эффективной длине волны регистрации флуоресценции флуорофора, Ibs — интенсивность обратно рассеянного лазерного излучения, предварительно уменьшенная оптическим фильтром примерно в β=1000 раз.
Средний уровень меланиновой пигментации (меланиновый индекс) оценивали в области скул у каждого второго участника исследования (n=21) при помощи спектрофотометрического прибора «Спектротест» (НПП «Циклон-Тест», Фрязино Московской области) [14]. Пациентов разделили по тому же возрастному критерию на 4 группы: 18–29 лет (средний возраст 25 лет, 3 мужчины и 3 женщины), 30–44 года (средний возраст 37, 3 мужчины и 3 женщины), 45–59 лет (средний возраст 53 года, 4 мужчины и 4 женщины), старше 60 лет (средний возраст 68, 4 мужчины и 1 женщина).
Статистический анализ выполнен с помощью программы R studio Version 1.4.1106 (RStudio PBC, USA). Сравнение количественных переменных в нескольких группах проведено с помощью критерия Краскела—Уиллиса с последующими апостериорными попарными сравнениями с помощью критерия Данна с поправкой Бонферрони. Статистически значимым считали уровень p<0,05.
Результаты
Проведен анализ информативности оптических показателей, вычисленных по зарегистрированным спектрам флюоресценции, для оценки старения кожи. Для каждого из принимавших участие в исследовании добровольцев вычислены средние по локализациям (лоб, мочка уха, скула) значения пиков обратного рассеяния лазерного излучения, интенсивности на эффективных длинах волн регистрации флюоресценции коллагена/эластина и липофусцина, а также индексы тканевого содержания указанных флюорофоров. Эти оптические параметры использовали при сравнении 4 выделенных возрастных групп пациентов в рамках каждой из локализаций. Результаты статистического анализа приведены в табл. 1. Уровень значимости p<0,05, вычисленный по критерию Краскела—Уиллиса, свидетельствует о наличии различий хотя бы в 2 из 4 рассмотренных возрастных групп по исследуемому оптическому показателю.
Таблица 1. Результаты статистического анализа оптических параметров, p
| Параметр | Лоб | Мочка уха | Скула |
| Ibs(365) | 0,005 | 0,001 | <0,001 |
| If(420) коллаген и эластин | 0,087 | 0,061 | 0,002 |
| ηf(420) коллаген и эластин | 0,221 | <0,001 | <0,001 |
| If(455) коллаген и эластин | 0,392 | 0,172 | 0,007 |
| ηf(455) коллаген и эластин | 0,025 | <0,001 | <0,001 |
| If(480) липофусцин и др. | 0,543 | 0,277 | 0,016 |
| ηf(480) липофусцин и др. | 0,016 | <0,001 | <0,001 |
| Ibs(535) | 0,025 | 0,051 | 0,136 |
| If(580–585) липофусцин | 0,561 | 0,04 | 0,272 |
| ηf(580–585) липофусцин | 0,056 | 0,027 | 0,016 |
Примечание. Ibs(365), Ibs(535) — интенсивность пиков обратного рассеяния от УФ и зеленого лазеров; If(420) коллаген и эластин, If(455) коллаген и эластин, If(480) липофусцин и др., If(580–585) липофусцин — интенсивность флуоресценции эндогенных флуорофоров на эффективных длинах волн их регистрации; η(420) коллаген и эластин, ηf(455) коллаген и эластин, ηf(480) липофусцин и др., ηf(580–585) липофусцин — индексы тканевого содержания эндогенных флуорофоров.
Наличие статистически значимых различий по показателям ηf(455) коллаген и эластин, ηf(480) липофусцин и др. и Ibs(365) во всех 3 исследуемых локализациях говорит о возможности использования данных параметров для количественной оценки изменений в оптических свойствах кожи у пациентов разных возрастных групп. При более детальном рассмотрении обнаружено, что первые 2 показателя, характеризующие тканевое содержание коллагена с эластином и липофусцина с прочими эндогенными флуорофорами, растут с увеличением среднего возраста испытуемых (табл. 2).
Таблица 2. Результаты детального анализа тканевого содержания коллагена/эластина и липофусцина
| Параметр | Лоб | Мочка уха | Скула | |||
| до 30 лет | после 60 лет | до 30 лет | после 60 лет | до 30 лет | после 60 лет | |
| ηf(455) коллаген и эластин:: | ||||||
| медиана | 0,50 | 0,53 | 0,49 | 0,69 | 0,52 | 0,68 |
| интерквартильный диапазон | 0,48 0,52 | 0,49 0,66 | 0,48 0,53 | 0,61 0,72 | 0,51 0,56 | 0,59 0,73 |
| p при сравнении групп «до 30 лет» и «после 60 лет»: | 0,262 | — | <0,001 | — | <0,001 | — |
| ηf(480) липофусцин и др.: | ||||||
| медиана | 0,59 | 0,64 | 0,58 | 0,78 | 0,62 | 0,76 |
| интерквартильный диапазон | 0,55 0,61 | 0,56 0,74 | 0,54 0,62 | 0,70 0,81 | 0,59 0,65 | 0,69 0,81 |
| p при сравнении групп «до 30 лет» и «после 60 лет» | 0,120 | — | 0,008 | — | 0,006 | — |
Рост с возрастом индекса тканевого содержания флуорофоров, регистрируемых на длине волны 480 нм, является ожидаемой закономерностью. Значительный вклад в сигнал флуоресценции на данной длине волны создает липофусцин, который в процессе жизнедеятельности аккумулируется в перинуклеарном пространстве и лизосомах клеток. Интерес представляют собой данные, полученные для индекса тканевого содержания коллагена и эластина на длине волны 455 нм. На рис. 1 визуализированы показатели ηf(455) во всех 4 возрастных группах в исследуемых локализациях.
Рис. 1. Индексы тканевого содержания коллагена и эластина на эффективной длине волны регистрации флуоресценции 455 нм в точках фотостарения у пациентов из разных возрастных групп.
Указаны медиана и интерквартильный диапазон. Отмечены группы, в которых при попарных сравнениях обнаружены статистически значимые различия (p<0,05).
Наблюдаемый рост уровня ηf(455), общего для коллагена и эластина, может быть объяснен увлечением сигнала эластина из-за эластоза, возникающего на фоне длительного и повторяющегося УФ-воздействия. Следует отметить, что спектры флуоресценции данных маркеров дермального матрикса накладываются и взаимно влияют друг на друга. Известно, что эластоз характеризуется патологическим снижением производства функциональных эластиновых волокон и накоплением дегенеративного нефункционального эластина. Согласно исследованиям, избыточное производство и накопление измененных эластиновых волокон обусловлено механизмами альтернативного сплайсинга в гене, кодирующем эластин (ELN) [15].
Еще одним фактором, влияющим на спектр флуоресценции и, как следствие, на расчет индекса тканевого содержания коллагена и эластина, является вариабельность поглощающих и рассеивающих свойств кожи. Одним из основных хромофоров эпидермиса и дермы, определяющих их поглощающие свойства в УФ-спектральном диапазоне, является меланин [16].
В проведенном исследовании для изучения влияния уровня меланиновой пигментации на сигнал флуоресценции оценивали меланиновый индекс в области скул добровольцев (рис. 2).
Рис. 2. Динамика изменения показателя среднего уровня меланиновой пигментации скулы в зависимости от возрастной группы.
Приведены линейная аппроксимирующая кривая и среднеквадратичное отклонение.
В старших возрастных группах средний уровень содержания меланина в коже был выше. Вероятно, это связано с тем, что люди более старшего возраста, естественно, подвергались более длительному фоновому УФ-воздействию в течение жизни и у них отмечается компенсаторное гетерогенное накопление пигмента (выполняющего роль естественного фотозащитного фактора) и замедление его резорбции [17]. Между тем в ряде работ указано, что с возрастом в коже снижается количество функциональных меланоцитов, отмечается неравномерное распределение меланина, чередующееся с зонами гипопигментации [18, 19].
Поглощение оптического излучения меланином приводит к снижению интенсивности сигнала регистрируемых спектров флуоресценции (рис. 3).
Рис. 3. Примеры спектров флуоресценции у пациентов с разным средним уровнем меланиновой пигментации в области скулы.
Ibs(365) — пик обратного рассеяния от УФ-лазера, If(455) — пик флуоресценции коллагена, If(480) — пик флуоресценции липофусцина (преимущественно) и других флуорофоров.
Снижение интенсивности сигнала наиболее выражено на длинах волн, близких к пику обратного рассеяния от УФ-лазера, где меланин более активно поглощает оптическое излучение. При этом снижение пика флуоресценции менее выражено, что, согласно приведенной выше формуле, при вычислении индекса тканевого содержания приводит к завышению получаемых значений. Это обусловливает необходимость введения поправок на уровень меланиновой пигментации при оценке количественного содержания эндогенных флуорофоров методов ЛФС in vivo.
Обсуждение
В проведенном методом лазерной флуоресцентной спектроскопии исследовании нам удалось не только подтвердить ранее известные закономерности, связанные с накоплением липофусцина в клетках эпидермиса и дермы, но и обнаружить ряд ранее не описанных эффектов. В данной работе по спектрам эндогенной флуоресценции оценены индексы тканевого содержания 2 маркеров возрастной дегенерации кожи (коллагена и липофусцина) на разных длинах волн возбуждающего излучения, а также зарегистрирован средний уровень меланиновой пигментации для исследования его влияния на конечный результат оценки содержания флуорофоров.
В исследовании продемонстрировано, что флуоресценция коллагена (ηf(455)) и липофусцина (ηf(480)) статистически значимо выше у пациентов старшей возрастной группы. Липофусцин является хорошо известным маркером старения, в экспериментальных работах описана связь параметров его флуоресценции и биологического возраста тканей [17]. Следует отметить, что хроническое воздействие УФ-A на кожу также потенцирует накопление липофусцина в клетках. S.D. Lamore и соавт. в своем исследовании показали, что хроническое воздействие УФ-A на фибробласты человека может приводить к снижению ферментной активности катепсина-B и повышению лизосомальной флюоресценции за счет липофусцина [20].
Ранее в литературе сообщалось, что интенсивность флуоресценции коллагена имела обратную зависимость с возрастом [12, 21]. Это наблюдение объяснялось дегенерацией коллагеновых волокон и нарастающим эластозом в дерме в процессе фотостарения [15]. Между тем мы обнаружили рост индекса тканевого содержания коллагена у старших участников исследования и параллельное снижение интенсивности пика обратного рассеяния УФ-лазера. Данные результаты, вероятно, связаны с несколькими физиологическими факторами, усиливающими отражающие свойства кожи, — увеличением содержания меланина в процессе старения, что подтверждается ростом меланинового индекса (см. рис. 2), а также возрастным утолщением и усилением неоднородности рогового слоя эпидермиса [22].
Проанализировав данные оптической диагностики, полученные из разных анатомических зон, наиболее подверженных воздействию УФ-излучения в течение жизни, мы установили, что скуловая область и область мочки уха являются наиболее информативными точками с точки зрения оптической диагностики УФ-индуцированных изменений кожи (см. табл. 1). Меньшая информативность исследований в области лба, вероятнее всего, связана с обилием пор и комедонов, а также с небольшой толщиной эпидермиса и дермы в этой зоне, которая составляет около 1,2 мм [23], и близостью костной ткани, что оказывает значительное влияние на регистрируемый оптический сигнал. В области мочки уха обнаружены статистически значимые результаты, но по меньшему числу показателей, чем на скуле. Кроме того, ухо может не всегда подвергаться воздействию УФ-лучей в зависимости от образа жизни пациента. По совокупности этих факторов для дальнейших клинических исследований фотостарения может быть прежде всего рекомендована область скулы.
На основании полученных результатов можно сформулировать ряд выводов, которые могут в дальнейшем послужить основой для рекомендаций по диагностике фотостарения при помощи оптических методов: 1) сочетанный анализ индекса тканевого содержания коллагена и эластина, а также принятие во внимание эластоза как существенного фактора, влияющего на результат оптических измерений; 2) проведение нормализации/учет степени меланиновой пигментации исследуемой области; 3) проведение оптических измерений на коже скуловой зоны как наиболее информативной точки фотостарения.
Следует отметить, что исследование имеет ряд ограничений: малый размер выборки, отсутствие верифицирующего гистологического исследования у лиц из разных возрастных групп, а также невключение в сравнительный анализ точек хроностарения (кожа, обычно защищенная от УФ-воздействия). Кроме того, мы не проводили анализ сопутствующих факторов, влияющих на интенсивность фотостарения испытуемых (например, влияние хронических заболеваний, курения и профессиональных факторов).
Заключение
В проведенном пилотном исследовании при помощи лазерной флуоресцентной спектроскопии мы описали потенциальную применимость коллагена и эластина как флуоресцентных маркеров для оценки фотостарения у здоровых добровольцев. Обоснованы возможные причины наблюдаемого роста индекса тканевого содержания коллагена и эластина с увеличением среднего возраста группы, заключающегося в двух факторах: структурных изменениях, связанных с эластозом, а также ростом среднего уровня меланиновой пигментации. В дальнейшем планируется проведение исследований, в рамках которых оптические параметры кожи будут сопоставляться с конкретными клиническими проявлениями старения и данными морфологического исследования.
В перспективе полученные данные могут быть применены в клинической практике для неинвазивной количественной оценки выраженности фотостарения, выявления лиц с повышенным риском развития опухолей кожи, оценки эффективности фотозащитных мер и разработки профилактических anti-age программ.
Участие авторов:
Концепция и дизайн исследования: М.Б. Макматов-Рысь; М.А. Гуреева, Д.А. Куликов, Ю.В. Чурсинова; Д.А. Рогаткин; А.Н. Хлебникова;
Сбор и обработка материала: М.Б. Макматов-Рысь, А.А. Гержик; Е.Ф. Хынку; Ю.В. Чурсинова
Статистическая обработка данных: И.А. Разницына, А.А. Глазков; Ю.В. Чурсинова
Написание текста: М.Б. Макматов-Рысь, И.А. Разницына, А.А. Гержик; Е.Ф. Хынку
Редактирование: Ю.В. Чурсинова; М.А. Гуреева; А.Н. Хлебникова; Д.А. Рогаткин; Д.А. Куликов
Финансирование
Исследование выполнено при финансовой поддержке РФФИ в рамках научного проекта №20-32-70134.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Authors’ contributions:
The concept and design of the study: M.B. Makmatov-Rys, M.A. Gureeva, Yu.V. Chursinova, D.A. Rogatkin, D.A. Kulikov, A.N Khlebnikova
Collecting and interpreting the data: M.B. Makmatov-Rys, A.A. Gerzhik, E.F. Khynku, Yu. V. Chursinova
Statistical analysis: I.A. Raznitsyna, P.A. Glazkova, Yu. V. Chursinova
Drafting the manuscript: M.B. Makmatov-Rys, A.A. Gerzhik, E.F. Khynku, I.A. Raznitsyna
Revising the manuscript: M.A. Gureeva, A.N Khlebnikova, Yu. V. Chursinova, D.A. Rogatkin, D.A. Kulikov
Financing
The reported study was funded by RFBR, project number 20-32-70134