Введение

В 2021 г. закончился очередной межэпидемический период, и в Российской Федерации зарегистрирован рост заболеваемости сифилисом на 39,4% по сравнению с 2020 г. Современный эпидемический период характеризуется рядом негативных тенденций, в том числе наличием раннего и позднего нейросифилиса с развитием серьезных осложнений: атрофии зрительных и слуховых нервов с развитием слепоты и глухоты, инсультов, прогрессивного паралича, спинной сухотки. Значительная вариабельность клинических проявлений, бессимптомное и малосимптомное течение на ранних стадиях существенно затрудняют диагностику нейросифилиса. Выполнение люмбальной пункции и исследование цереброспинальной жидкости (ЦСЖ) — необходимая процедура для установления диагноза и контроля эффективности терапии нейросифилиса. Лабораторное подтверждение поражения центральной нервной системы (ЦНС) при сифилисе остается актуальной проблемой. Классическое подтверждение диагноза основывается на обнаружении реагиновых антител в ЦСЖ с помощью различных нетрепонемных тестов (НТТ), однако специалисты отмечают их недостаточную чувствительность [1]. При отрицательных результатах НТТ повышенное содержание лейкоцитов и белка в ЦСЖ в отсутствие других возможных причин расценивается как вероятный нейросифилис. Недостаточная диагностическая точность существующих критериев обусловливает необходимость дальнейшего совершенствования ликвородиагностики нейросифилиса.

Основой ликвородиагностики является детекция иммуновоспалительной реакции в ЦНС. Несмотря на то что верификацию интратекального синтеза иммуноглобулинов давно уже применяют в неврологии для диагностики воспалительных заболеваний [2], в случае нейроинфекций всегда возникает вопрос об активности процесса, особенно если пациент получил этиотропную терапию, так как невозможно исключить остаточный характер данного синтеза.

В последние годы в качестве индикаторов текущей активности воспалительного заболевания ЦНС интенсивно изучаются различные цитокины, и для одного из них, который имеет название хемокин (C-X-C мотив) лиганд 13 (CXCL13), накоплено достаточное число подтверждающих доказательств [3]. Доказана роль данного В-клеточного хемоаттрактанта в эктопическом лимфонеогенезе в местах острого и хронического воспаления, в том числе в ЦНС [4]. В настоящее время CXCL13 активно изучают в качестве потенциального маркера активности инфекционных (нейросифилис, нейроборрелиоз, клещевой энцефалит, ВИЧ-инфекция, трипаносомоз) и неинфекционных (рассеянный склероз, лимфома) заболеваний ЦНС [3, 5]. Показана его значимость в развитии интратекального гуморального иммунного ответа при нейросифилисе [6].

Цель исследования — разработка диагностической модели, дополняющей существующие процедуры диагностики нейросифилиса, на основе биомаркеров, связанных с интратекальным гуморальным иммунным ответом.

Материал и методы

В исследование включены 237 пациентов, серопозитивных по сифилису, проходивших ликвородиагностику в лаборатории Уральского НИИ дерматовенерологии и иммунопатологии (Екатеринбург) в 2008—2021 гг. Все пациенты проконсультированы неврологом и подписали информированное добровольное согласие. Парные образцы ЦСЖ и крови собраны в один день. Часть ЦСЖ и сыворотки крови использовали для проведения стандартных тестов, утвержденных приказами Министерства здравоохранения РФ для диагностики нейросифилиса, остатки образцов аликвотировали и хранили при температуре –80°C. После завершения процесса набора образцы ЦСЖ и крови подвергли углубленному исследованию.

Критерии включения в исследование: ВИЧ-отрицательный статус, отсутствие анамнестических указаний на вероятность клещевых инфекций, наличие полноценных анамнестических данных об основном заболевании, достаточный объем биологических образцов.

Содержание альбумина, иммуноглобулинов G, A и M в ЦСЖ и сыворотке крови измеряли с помощью автоматизированной иммунохимической нефелометрии с использованием анализатора BN Prospec (Siemens, Германия). Оценку наличия интратекального синтеза общих иммуноглобулинов (ИТС Ig) проводили по методологии, предложенной H. Reiber для неврологической практики [7]. Функциональное состояние гематоликворных барьеров оценивали с помощью коэффициента альбумина с учетом возрастной нормы [7].

Концентрацию CXCL13 в ЦСЖ определяли с использованием xMAP-технологии на флуоресцентном анализаторе Luminex 200 (наборы Merck Millipore, США) и иммуноферментного анализа на анализаторе Lazurite (наборы Cusabio, США). За верхний предел референтного интервала взято максимальное значение концентрации, полученное у лиц с отсутствием психиатрической, неврологической, офтальмологической, отологической симптоматики, с нормальным ликвором, со специфической/дополнительной терапией в анамнезе, отрицательной или низкой позитивностью реакции микропреципитации в крови (n=17).

Клинико-анамнестические, серологические данные и результаты стандартной ликвородиагностики взяты из историй болезни. Проанализированы следующие ликворологические тесты: 1) цитологическое исследование клеток, 2) определение белка, 3) НТТ — реакция микропреципитации или тест быстрых плазменных реагинов.

Сравнение качественных признаков проводили с использованием критериев χ² или Фишера с корректировкой уровня значимости для выявления существенно различных пар при множественном сравнении с помощью процедуры Холма—Бонферрони. При сравнении долей внутри групп применяли Cochran (Кохран) Q-тест. Для сравнения связанных выборок использовали парный t-критерий. Для всех статистических критериев ошибка первого рода устанавлена равной 0,05. Нулевую гипотезу (отсутствие различий) отвергали, если вероятность (p) не превышала ошибку первого рода.

Результаты

В результате комплексного анализа лабораторных показателей выделено пять типов состояния ЦСЖ по отношению к наличию признаков, характеризующих интратекальный гуморальный иммунный ответ (рис. 1): тип 1 («индуцирован») — повышенный уровень в ЦСЖ CXCL13 при отсутствии доказанного ИТС Ig; тип 2 («активный») — повышенный уровень в ЦСЖ CXCL13 и доказанный ИТС Ig; тип 3 («персистентный») — нормальный уровень в ЦСЖ CXCL13 и доказанный ИТС Ig; тип 4 («сомнителен») — нормальный уровень в ЦСЖ CXCL13 и повышенное содержание общих иммуноглобулинов в ЦСЖ без доказательства ИТС Ig; тип 5 («отсутствует») — отсутствие любых признаков интратекального гуморального иммунного ответа.

Рис. 1. Определение выделенных типов интратекального гуморального иммунного ответа. (+) — есть отклонение, (–) — нет отклонения.

Интратекальный общий синтез Ig определяли с использованием методов H. Reiber [7]. Показателем дисфункции гемато-ЦСЖ барьера был повышенный коэффициент альбумина ЦСЖ/кровь.

На рис. 2 отображены данные по частоте выявления определенных типов интратекального гуморального иммунного ответа у различных категорий обследованных пациентов. Наибольшие отличия наблюдались по типам 1 и 2. У больных вторичным сифилисом доля типа 1 составила больше половины всех случаев — 7 (54%) из 13, тогда как у остальных пациентов такой вариант либо не выявлялся, либо был представлен единичными случаями. Тип 2 являлся преобладающим для больных скрытыми поздними и неуточненными формами сифилиса — 41 (66%) из 62 и встречался достоверно чаще, чем у пациентов с терапией сифилиса в анамнезе, за исключением проходивших контрольное исследование после лечения нейросифилиса. Доли типов 3 и 4 в сравниваемых категориях статистически не различаются. Различия по типу 5 при множественном сравнении достоверны только в отношении отдельных групп, однако доля этого типа статистически значимо выше у пациентов с лечением неневрологического сифилиса в анамнезе по сравнению с нелечеными пациентами — 43 (35%) из 117 против 11 (15%) из 75 (p=0,004).

Рис. 2. Частота выявления определенных типов интратекального гуморального иммунного ответа у различных категорий серопозитивных по сифилису пациентов (n=237).

Определение типов см. на рис. 1. Поздний скрытый сифилис включает неуточненный сифилис. *, **, *** — p<0,05 (χ² с поправкой Холма—Бонферрони).

Для изучения взаимосвязи типов ЦСЖ с клиническими и лабораторными особенностями пациентов использованы данные пациентов при первом обращении с исключением повторных обращений (табл. 1). При множественном попарном сравнении статистически значимые различия получены лишь в отдельных случаях. Однако наблюдается сходство между типами 1 и 2, объединяемыми общим признаком повышенного содержания в ЦСЖ CXCL13, и между типами 3, 4, 5, при которых такое повышение отсутствует. При сравнении объединенных групп различия достоверны по всем сравниваемым признакам. С типом 1 чаще встречались мужчины (73% против 51%; p=0,002), они старше (45±11 лет против 38±11 лет; p=0,000), чаще имели какие-либо клинические проявления (59% против 20%; p<0,000), в том числе неврологические и психиатрические, реже низкие (и чаще средние и высокие) титры реакции микропреципитации в крови (27% против 74%; p<0,000).

Таблица 1. Клинические и лабораторные особенности пациентов при первом обращении (n=207)

Примечание. В скобках указаны проценты. М — среднее значение. Определение типов см. на рис. 1. * — p<0,05 (χ² с поправкой Холма—Бонферрони).

В табл. 2 представлены сведения по результатам тестов ликвородиагностики, полученным у обследованных, включены только случаи с полным набором данных (выполнены все три теста). Позитивные результаты НТТ и цитоз ассоциированы с типом 2, поскольку встречались главным образом при этом типе. Между тем повышенный уровень белка в значительной доле присутствовал не только при типе 2, но еще и при типах 1 и 4, статистически значимо чаще, чем при типе 5. При рассмотрении комбинаций тестов также отмечены некоторые различия. При типе 2 частота выявления тех или иных отклонений значительно выше по сравнению со всеми другими типами, а случаи, удовлетворяющие всем трем критериям, имели место почти исключительно при этом типе. При типе 4 среди других вариантов отклонений преобладало изолированное повышение уровня белка.

Таблица 2. Результаты тестов ликвородиагностики нейросифилиса (n=222)

Примечание. Полные данные доступны только для 222 пациентов. Определение типов см. на рис. 1. Прочерк — результаты теста не удовлетворяют критерию. * — p<0,05 (χ² с поправкой Холма—Бонферрони).

Дополнительно по типам в отдельных категориях пациентов проанализировано соответствие результатов классическим критериям нейросифилиса: подтвержденного (позитивный ЦСЖ НТТ, независимо от наличия симптомов) или возможного (ЦСЖ цитоз и/или гиперпротеинархия + типичная симптоматика в отсутствие других причин).

С типом 1 из 7 больных вторичным рецидивным сифилисом только у 1 (14%; 95% ДИ 0,3—58%) пациента (с жалобами на головную боль) выявлен небольшой (9 кл/мкл) цитоз. Еще у 2 больных отмечены клинические проявления в виде астенического синдрома и тиннитуса/вертиго при нормальном содержании клеток и белка.

С типом 2 наблюдались выраженные отличия в зависимости от наличия специфической терапии в анамнезе. Так, ЦСЖ всех 33 (95% ДИ 89—100%) нелеченых больных скрытыми поздними и неуточненными формами сифилиса соответствовала критериям либо подтвержденного (³/₄ случаев), либо возможного (¹/₄) нейросифилиса. У пациентов с возможным нейросифилисом в 5 из 8 случаев (в том числе в 2 случаях изолированного повышения уровня белка) клиническая значимость отклонений подтверждалась наличием выраженной специфической неврологической и психиатрической симптоматики, а у 3 бессимптомных пациентов наблюдался довольно значительный цитоз (17 кл/мкл, 19 кл/мкл, 76 кл/мкл) в сочетании с повышенным уровнем белка. Среди получавших в прошлом специфическую/дополнительную терапию классическим лабораторным критериям соответствовали только 10 (42%; 95% ДИ 22—63%) из 24 случаев (p<0,000), при этом диагноз нейросифилиса подтверждался в 7 случаях позитивным НТТ, а в 3 случаях — цитозом в сочетании с клиническими проявлениями. В 14 случаях (в том числе в 3 случаях с клиническими симптомами) классические лабораторные критерии не позволили подтвердить наличие иммуновоспалительного процесса в ЦНС.

В группе с типом 3 только у 2 пациентов, проходящих контроль терапии нейросифилиса, сохранялась позитивность НТТ.

С типом 4 у 7 пациентов, ранее лечившихся по поводу сифилиса, возможность нейросифилиса (умеренное (0,526—0,712 г/л) повышение белка у 6 пациентов и незначительный (6 кл/мкл) цитоз у 2 пациентов) не подтверждалась наличием клинической симптоматики (5 бессимптомных случаев, 1 хронический мезотимпанит, 1 нейропатия малоберцового нерва). В группе с типом 5 ситуация была аналогичной: 3 бессимптомных случая ранее лечившихся пациентов с небольшим цитозом (7—8 кл/мкл) и 1 случай позднего скрытого сифилиса с цитозом 56 кл/мкл нейтрофильного характера (97% нейтрофилы, 3% лимфоциты).

На рис. 3 представлена динамика изменения уровней в ЦСЖ CXCL13 и относительных интратекальных фракций Ig до и после полноценного курса терапии нейросифилиса в УрНИИДВиИ у 16 пациентов, среднее значение срока выполнения контрольной пункции составило 1,6±0,7 года. Наблюдалось значительное снижение величин показателей, но тем не менее у значительной части — у 10 (63%; 95% ДИ 36—85%) из 16 больных сохранялись признаки активной воспалительной реакции, которая только в 7 случаях (95% ДИ 35—93%) подтверждалась позитивными ЦСЖ НТТ. Похожие данные получены у других 25 пациентов, проходивших первое контрольное обследование после лечения нейросифилиса: у 15 (60%; 95% ДИ 39—79%) из 25 наблюдались признаки активного воспаления, подтвержденные стандартными тестами у 9 (60%; 95% ДИ 32—84%) из них.

Рис. 3. Изменение уровней в ЦСЖ CXCL13 и интратекальной фракции Ig после лечения нейросифилиса (n=16; 0,7—2,8 года).

Обсуждение

Гуморальный ответ является неотъемлемой частью иммунной реакции при сифилитической инфекции. В ЦНС гуморальный ответ реализуется путем изменений функционального состояния гемато-ЦНС барьеров, способствующих увеличению доли плазменной составляющей в ликворе, а также путем формирования очагов лимфоидной инфильтрации (вплоть до образования эктопической лимфоидной ткани) обеспечивающих локальный (интратекальный) синтез различных антител. В результате этих процессов значительно повышается содержание иммуноглобулинов в ЦНС по сравнению с исходным уровнем. Выявление интратекального синтеза общих иммуноглобулинов, объективное свидетельство вовлечения ЦНС в воспалительный процесс при инфекционной патологии, имеет валидированные методики. Признанным маркером нейровоспаления является CXCL13, появление которого в ЦСЖ является следствием работы различных механизмов, направленных на миграцию, позиционирование иммунных клеток при остром воспалении и формирование и регуляцию приобретенного иммунного ответа [8], и не зависит от его содержания в системном кровотоке [9].

Особенностью нашего исследования является комплексное и детальное изучение биомаркеров интратекального гуморального иммунного ответа в контексте клинико-лабораторных особенностей пациентов, что ранее не осуществлялось. С учетом того, что исследуемые маркеры не являются специфичными для сифилиса, выборка была ограничена пациентами, не имеющими каких-либо указаний на другие возможные причины лабораторных отклонений.

Предложена модель интерпретации данных и рассмотрены полученные с ее помощью закономерности. Выявлена ассоциация типа 1 со вторичной, а типа 2 с поздней скрытой формой сифилиса. Тип 5 чаще встречался у пациентов со специфической терапией в анамнезе. Пациенты с признаками нейровоспаления (типы 1+2) и их отсутствием (типы 3+4+5) различаются между собой. Среди первых преобладают мужчины старше 40 лет, у них чаще наблюдались клинические проявления. Среди вторых преобладают лица с низкими титрами реакции микропреципитации в крови (отр. — 1:4). Положительные ЦСЖ НТТ («золотой стандарт» диагностики нейросифилиса) встречались почти исключительно при типе 2. Незначительное повышение уровня белка в ЦСЖ, не подкрепленное другими клиническими и лабораторными признаками, было наиболее частым отклонением при типе 4.

Выявленные ассоциации с клинико-лабораторными особенностями пациентов и результатами ликвородиагностики представляются логичными и правдоподобными, подтверждают применимость и правильность предложенной модели и возможность ее использования для оценки диагностических тестов.

Наблюдаемые иммуновоспалительные изменения ЦСЖ могут быть следствием как патогенспецифического иммунного ответа на бледную трепонему или ее отдельные антигены, так и неспецифического иммунного ответа на эндогенные антигены, образующиеся в результате повреждения собственных тканей. Нельзя исключать также возможность формирования аутоиммунного компонента (на нативные эндогенные антигены). Наиболее вероятно их сосуществование с изменением пропорций вклада при разных клинических формах или на разных этапах патологического процесса. Так или иначе, в отсутствие других причин (коинфекция другими нейротропными возбудителями, рассеянный склероз, аутоиммунные заболевания с вовлечением ЦНС и т.д.) выявление интратекального гуморального иммунного ответа у пациентов с подозрением на нейросифилис является доказательством поражения ЦНС.

К типу 1 относятся случаи, когда в ЦНС присутствуют условия для формирования В-клеточного ответа в виде соответствующего цитокинового фона, создаваемого воспалительным процессом, но сам ответ еще не настолько выражен, чтобы быть выявленным существующими лабораторными методами. Для ранних форм нелеченого сифилиса (вторичный сифилис) наиболее вероятно, что выявленные отклонения имеют клиническую значимость и обусловлены присутствием возбудителя. У лиц, получавших ранее терапию по поводу сифилиса, сохранение воспалительного потенциала может быть обусловлено в том числе сменой антигенной специфичности иммунного ответа. Тип 2, «активный» интратекальный иммунный ответ, может рассматриваться в качестве доказательства текущего воспалительного поражения ЦНС и использоваться для достоверной идентификации случаев нейросифилиса. Тип 3 представляет собой остаточные проявления интратекального синтеза, являющегося более статичным показателем по сравнению с CXCL13. Возможно как самопроизвольное разрешение воспалительного процесса, так и под влиянием терапии. Тип 4, скорее всего, объединяет различные варианты отклонений, приводящих к повышенному уровню иммуноглобулинов в ЦСЖ, таких как минимальный остаточный интратекальный синтез, дисфункция гематоликворного барьера вследствие нарушения циркуляции в субарахноидальном пространстве и/или оттока через арахноидальные грануляции при поражении паутинной оболочки головного и спинного мозга [7], высокое содержание иммуноглобулинов в системном кровотоке. Тип 5 включает случаи с отсутствием любых проявлений гуморального ответа в интратекальном пространстве либо вследствие его исходной интактности, либо по причине состоявшейся санации, самопроизвольной или под влиянием терапии.

Недостаточную точность классических лабораторных тестов ликвородиагностики нейросифилиса констатируют специалисты на протяжении всего периода использования этих тестов. В нашей работе получены новые, уточняющие, факты.

Так, классические критерии обеспечивают высокую точность выявления активного интратекального иммунного ответа у нелеченых больных поздними (и неуточненными) скрытыми формами сифилиса, но недостаточную точность у ранее получавших специфическую терапию. С учетом значительного удельного веса и продолжающегося роста числа лиц, лечившихся по поводу сифилиса в прошлом, среди подвергающихся ликворологическому обследованию [10, 11] актуален поиск дополнительных критериев для данной категории пациентов.

Помимо этого, на примере вторичного сифилиса показана неудовлетворительная выявляемость начальных стадий формирования интратекального иммунного ответа. Принимая во внимание все нарастающую тенденцию выбора для лечения ранних форм сифилиса цефтриаксона, для которого пока не доказана эффективность санации ЦНС, необходимо дополнительное обоснование для таких случаев.

После применения полноценного лечения (высокие дозы внутривенного бензилпенициллина) на стадии активного интратекального иммунного ответа наблюдается существенное снижение его интенсивности, но у значительной части пациентов сохраняются признаки воспалительной реакции в ЦНС, которые у многих не выявляются стандартными тестами, используемыми для оценки динамики. Природа и значимость остаточного воспаления, необходимость применения этиотропной терапии требуют дальнейшего изучения.

Наблюдаемое в отсутствие доказанных признаков интратекального иммунного ответа повышение числа лейкоцитов или уровня белка в ЦСЖ является незначительно выраженным, изолированным и не подкрепляется типичной клинической симптоматикой, что свидетельствует о неспецифическом характере данного повышения.

Данное исследование имеет ограничения. Во-первых, приведенные сведения о диагностической точности классических критериев могут различаться у ВИЧ-инфицированных пациентов. Во-вторых, не были учтены результаты трепонемных тестов в ликворе, так как в связи с огромным разнообразием тестов как по методологии, так и по нюансам отдельных производителей мнение об их диагностической значимости не сформировано, это должно являться предметом отдельного исследования. В-третьих, использованная методология предполагает выявление повреждений, локализованных вблизи пространств ЦСЖ и сопровождающихся В-клеточной иммуновоспалительной реакцией, тогда как существование других форм не может быть исключено.

Заключение

Комплексное исследование биомаркеров интратекального гуморального иммунного ответа целесообразно использовать для выявления поражения центральной нервной системы при сифилитической инфекции и совершенствования ликвородиагностики. Исследование с применением предлагаемой модели анализа и интерпретации данных позволяет выявить иммуновоспалительные изменения ликвора, не распознаваемые классическими тестами, и определить клинические ситуации, требующие применения дополнительных критериев.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования: Н.К. Левчик

Сбор и обработка материала: Н.К. Левчик, М.В. Пономарева

Статистическая обработка: Н.К. Левчик, М.В. Пономарева

Написание текста: Н.К. Левчик

Редактирование: Н.В. Зильберберг

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Authors’ contributions:

The concept and design of the study: N.K. Levchik

Collecting and interpreting the data: N.K. Levchik, M.V. Ponomareva

Statistical analysis: N.K. Levchik, M.V. Ponomareva

Drafting the manuscript: N.K. Levchik

Revising the manuscript: N.V. Zilberberg