Введение
Сифилис — хроническая инфекция, вызываемая бледной трепонемой, T. pallidum, которая обладает высокой нейротропностью и может практически на любой стадии инфекции вызвать специфическое поражение центральной нервной системы (ЦНС), называемое нейросифилисом (НС).
Интерес к НС, изучению его патогенеза, клиники, диагностики в последние годы растет, что связано с ростом заболеваемости НС, неспецифичностью симптоматики, сложностью верификации, особенно при асимптомном варианте заболевания. О росте интереса свидетельствует значительное увеличение в последние годы количества публикаций, посвященных различным аспектам проблемы НС, в базе данных PubMed (с 1997 по 2022 г. рост в 4,2 раза) (см. рисунок).
Рост количества публикаций, посвященных нейросифилису, в базе данных PubMed (с 1997 по 2022 г.); дата обращения: 30.03.23.
Прямые методы исследования — метод секвенирования нового поколения
Одним из потенциальных современных подходов к прямой детекции T. pallidum в цереброспинальной жидкости (ЦСЖ) может явиться метод секвенирования1. Появляется все больше доказательств того, что в диагностике нейроинфекционных заболеваний, таких как энцефалит и менингит, можно использовать метагеномное секвенирование нового/следующего поколения (mNGS)2, хотя его трудно применять в качестве рутинного инструмента для повседневного скрининга из-за относительной трудоемкости и высокой стоимости [1, 2].
В работе китайских авторов C. Liu и соавт. [3] описан случай использования метода mNGS для диагностики НС путем тестирования ЦСЖ у молодого (29 лет) мужчины с прогрессирующими когнитивными расстройствами и положительными результатами нетрепонемного теста TRUST (с титром 1:32) и FTA-ABS. Результаты исследования ЦСЖ пациента методом mNGS выявили 2288 прочтений последовательностей, однозначно соответствовавших геному бледной трепонемы с охватом 11,6483%, что подтвердило у пациента диагноз НС. Таким образом была показана возможность использования метода mNGS в диагностике НС путем исследования ЦСЖ.
Вместе с тем главенствующими методами в диагностике НС путем исследования ЦСЖ остаются непрямые (иммунологические) методы.
Оценка интратекального синтеза антитрепонемных иммуноглобулинов
Одним из важных моментов при установлении клинико-лабораторного диагноза НС является обнаружение интратекального синтеза антитрепонемных иммуноглобулинов. С этой целью осуществляется одновременное исследование крови и ЦСЖ и проводится подсчет ряда индексов, оценивающих проницаемость гематоэнцефалического барьера (ГЭБ) [4–7].
Важнейшим показателем проницаемости ГЭБ считается определение так называемого альбуминового коэффициента, определяющего соотношение уровня альбуминов в сыворотке крови к альбуминам в ЦСЖ; поскольку альбумины в ЦНС не вырабатываются, их концентрация целиком зависит от сохранности функции ГЭБ:
В норме альбуминовый коэффициент может колебаться от 140 до 400 в зависимости от возраста пациента и в среднем составляет около 220 [8]; снижение коэффициента свидетельствует о повышенной проницаемости ГЭБ и выраженном воспалении в структурах нервной системы [9].
Косвенным подтверждением интратекальной продукции антитрепонемных IgG-антител может являться IgG-коэффициент (IgGk), определяемый по соотношению общих IgG в сыворотке крови и ЦСЖ:
В норме величина IgGk колеблется от 268 до 850 (в среднем 300–450), а при возрастании концентрации IgG снижается.
Аналогично может определяться коэффициент IgM:
У больных НС его величина снижается в 3,5–4 раза (до 13–16). Однако расчет данного коэффициента не всегда возможен, поскольку в пробах ЦСЖ при НС могут определяться лишь следовые количества IgM [9].
В конце XX — начале XXI века для оценки интратекального синтеза иммуноглобулинов в ЦСЖ больных НС был также разработан ряд коэффициентов, основанных на результатах РПГА [10–13], но широкого распространения в рутинной диагностике НС они до недавнего времени не получали. Между тем один из таких индексов — Intrathecal T. pallidum assay index (ITPA-индекс), апробированный в 2019 г. в кандидатской диссертации сотрудника МНПЦДК Е.С. Негашевой [7], продемонстрировал обнадеживающие результаты. Исследования показали, что ITPA-индекс высокоинформативен при диагностике НС. Разница в абсолютных значениях показателя у больных НС и больных сифилисом без НС оказалась высокодостоверной (p<0,001). Преимуществами определения ITPA-индекса являются наличие зарегистрированных российских тест-систем (РПГА и ИФА), возможность одновременного исследования значительного количества биопроб, высокая чувствительность и специфичность используемых наборов реагентов.
Подсчет индекса осуществляется по формуле:
ITPA-индекс способствует дифференциальной диагностике локальной продукции антител и их пассивной транссудации в ЦНС [6, 7, 14]. Если антитела в ЦНС не синтезируются, а присутствие в ЦСЖ трепонемоспецифических IgG является следствием пассивного переноса из сыворотки через неповрежденный ГЭБ, то соотношение трепонемных и общих иммуноглобулинов G (IgG) в ЦСЖ и сыворотке крови одинаково, а индекс равен 1. При значениях индекса 2 и более (до 3) состояние пациента расценивается как возможное формирование НС, при котором целесообразно назначать адекватную терапию. Значение индекса ITPA 3 и более (3–430) свидетельствует об интратекальном синтезе специфических антител к бледной трепонеме и поражении нервной системы. В настоящее время ITPA-индекс включен в действующие клинические рекомендации Минздрава России по ведению больных сифилисом.
По мнению N. Levchik и соавт., признаками интратекального синтеза Ig могут являться также повышенные титры и индексы РПГА в ЦСЖ, повышенное количество клеток и положительная VDRL, тогда как в случаях отсутствия интратекального синтеза ассоциируются отрицательные значения РИФ и РПГА в ЦСЖ и титры РПГА от 1:4 до 1:160 [15].
Иммуночипы в серо- и ликвородиагностике сифилиса
Одним из основных направлений современной медицины является мультиплексная диагностика, которая предполагает одновременное определение множества аналитов в одном образце для комплексного выявления маркеров инфекционных заболеваний [16]. Применительно к иммунодиагностике сифилиса перспективным подходом представляется использование технологии иммуночипов, или белковых микрочипов, которые позволяют проводить исследование в мини-формате и детектировать параллельно множество антител. На поверхности микрочипов иммобилизуются антигены, с которыми взаимодействуют искомые аналиты (антитела), содержащиеся в биологических образцах. Визуализацию связавшихся антител проводят с помощью конъюгатов — вторичных антител, конъюгированных с флуорофорами. Микрочипы позволяют при минимальном объеме биологических проб повысить достоверность результатов и благодаря высокой емкости сократить время обследования пациента [17–19].
Известно несколько белковых иммуночипов, применяемых для диагностики сифилиса. Так, описан белковый чип для детекции IgG к рекомбинантному белку Tpp47 T. pallidum на стеклах с альдегидным покрытием [20]. Для визуализации антител к Tpp47 применяли коллоидный раствор наночастиц золота, модифицированных протеином A стафилококков. Метод позволил осуществлять полуколичественную оценку результатов, но оказался слишком трудоемким и затратным.
В 2008 г. в ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора разработали тест-систему на основе иммуночипа для серодиагностики сифилиса в формате непрямого иммунофлюоресцентного анализа, которая включала в себя антигены Tp15, Tp17, TmpA и Tp47 T. pallidum, иммобилизованные на активированных слайдах. При проведении исследования антигены взаимодействовали с IgG человека, для визуализации комплекса антиген—антитело применяли конъюгат в виде античеловеческих IgG-антител с флюоресцентной меткой [21]. Специфичность тест-системы на основе иммуночипа составила 100%. При этом для 195 из 200 сывороток крови был получен положительный спектр антител к двум антигенам T. pallidum и более.
Китайские исследователи разработали иммуночип для выявления трепонемоспецифических антител IgG и IgM в сыворотке крови больных сифилисом [22], твердая фаза которого была представлена комплексным рекомбинантным белком TpN15-17-N47, иммобилизованным на поверхности чипа. Визуальный предел обнаружения антител IgG на биочипе составил 0,39 мкг/мл, чувствительность теста — 99%, специфичность — 100%. Ограничением явилась невозможность раздельной детекции антител к антигенам T. pallidum.
Исследователи из Государственного научного центра дерматовенерологии и косметологии Минздрава России в 2018 г. разработали иммуночип, позволяющий определять IgG-антитела к T. pallidum. Кроме традиционно используемых иммунодоминантных антигенов T. pallidum, иммуночип содержал ряд дополнительных белков (Tp0277, Tp0319, Tp0453, Tp0684, Tp0965, Tp1038), отобранных на основании изучения данных литературы, биоинформатического анализа и экспериментальной апробации. Чувствительность биочипа при тестировании сывороток крови больных сифилисом составила 94,1%, специфичность — 100%. Высокий уровень аналитической ценности получен для белков Tp0277 (периплазматическая C-терминальная протеаза), Tp0319 (цитоплазматический мембрана-ассоциированный липопротеин TmpC), Tp0453 (связанный с наружной мембраной белок с транспортной функцией) [23, 24].
В 2016 г. Московским центром дерматовенерологии и косметологии совместно с ЦНИИ эпидемиологии впервые в РФ создана и клинически апробирована экспериментальная модель иммуночипа для детекции антител к T. pallidum в ЦСЖ [25]. Диагностическая тест-система состояла из иммуносорбента с раздельно иммобилизированными на нем антигенами T. pallidum: Tp15, Tp17, Tp47, TmpA и конъюгата с флюоресцентной меткой. Чувствительность и специфичность тест-системы при тестировании образов ЦСЖ больных с установленным диагнозом НС составила 100%, при этом антитела к антигену Tp17 выявлены во всех образцах, а антитела к двум антигенам и более в разных сочетаниях — в 83,6% образцов. Исследования в этом направлении продолжаются.
Многомерный дискриминантный анализ
Одним из современных направлений в диагностике НС является подход, осуществляемый с использованием математического инструмента — многофакторного (множественного, или многомерного) дискриминантного анализа (МДА). Сущность МДА заключается в поиске новых признаков, называемых дискриминантными функциями (ДФ), на основе использования совокупности исходных показателей пациента. Полученные новые признаки с высокой точностью дифференцируют пациентов с разными диагнозами, по отношению к которым решается задача дискриминации. При этом каждой группе пациентов соответствует своя ДФ.
В ходе выполнения НИР сотрудники МНПЦДК разработали защищенный патентом на изобретение №2699057 способ диагностики НС [26, 27], который состоит в исследовании ЦСЖ и отличается тем, что у пациента с подозрением на НС в ЦСЖ определяют совокупность лабораторных показателей (наличие антител к кардиолипиновому антигену в РМП, к кардиолипиновому антигену в тесте VDRL, к бледной трепонеме в РПГА, долю иммобилизации бледных трепонем в РИБТ, наличие антител к бледной трепонеме в ИФА, в РИФц, уровень цитоза, белка, а также содержание антител к Tp15, Tp17, Tp47, TmpA в формате иммуночипа с последующим определением по соответствующим формулам линейных дискриминантных функций: ДФ1 — соответствует диагнозу НС и ДФ2 — соответствует сифилису без НС). При ДФ1>ДФ2 диагностируют наличие специфического НС, при ДФ2>ДФ1 диагноз НС исключают. С рассчитанными в ходе выполнения экспериментальных исследований значениями дискриминантных функций можно ознакомиться в тексте патента на сайте открытых реестров ФИПС3.
В последние годы достигнут прогресс в разработке новых биомаркеров для тестирования ЦСЖ, которые могут быть применены для диагностики НС.
Цитокины, хемокины
В настоящее время появляется все больше данных о результатах изучения уровня в ЦСЖ интерлейкинов и хемокинов, играющих важную роль в модуляции иммунной функции.
Многие авторы в качестве дополнения к существующей диагностике НС предлагают использовать уровень хемокинового лиганда 13 (CXCL13) в качестве точного диагностического биомаркера интратекального воспаления. Отмечается, что уровень лиганда значительно повышен при НС, положительно коррелирует с титром VDRL и трепонемных тестов, а также с величиной цитоза [28–32] и снижается в ЦСЖ после специфического лечения НС [33]. Указано, что CXCL13 может быть потенциальным диагностическим маркером неврологических заболеваний человека, вызываемых спирохетами, в том числе НС [30].
В работах российских и зарубежных (в основном китайских) авторов отмечается также повышение уровня цитокинов и других хемокинов в ЦСЖ больных НС, в том числе IL-2 [34], IL-6 и IL-10 [33, 35], IL-12, IL-23, 12p40 [34, 36], IL-17A, IFN-γ, TNF-α [9, 37], IL-26 [38], CCL24, CXCL7 [39], CXCL8, CXCL10 [34] и др. При этом для некоторых цитокинов, например IL-17A, отмечено отсутствие корреляции между уровнями в сыворотке крови и ЦСЖ, что предполагает интратекальную продукцию данного цитокина [40]. В ряде работ указывается на наблюдаемую при НС клеточную дисфункцию и вовлеченность в патогенез НС цитокинов Th1 (IL-2, IL-12 и IFN-γ) и Th2 (IL-6 и IL-10) [33, 34]. В работе автора из Белоруссии А.М. Лукьянова [9] отмечено, что повышенный уровень IL-4 может быть индикатором раннего НС, а повышенные уровни IL-6 и TNF-α — маркерами позднего НС.
Представляют интерес работы, посвященные изучению при НС фактора, ингибирующего миграцию макрофагов (MIF), который является мультиэффекторным иммунорегуляторным цитокином и признается одним из ключевых индикаторов инфекций ЦНС. В исследовании L.-R. Lin и соавт. [41] показано, что уровень MIF был выше в ЦСЖ больных НС, чем у больных без НС, и являлся более чувствительным показателем, чем наличие плеоцитоза и протеинархии, особенно при отрицательных нетрепонемных тестах; чувствительность его определения в ЦСЖ для диагностики НС составила 74,42%, специфичность — 67,74%.
Таким образом, следует отметить явный интерес исследователей, в основном зарубежных, к изучению уровня цитокинов и хемокинов в ЦСЖ больных НС и установлению их возможной роли в патогенезе заболевания.
Другие белки
Помимо общего белка, уровень которого учитывается при установлении диагноза НС, есть целый ряд белков, которые, по мнению исследователей, заслуживают внимания при диагностике НС. Одним из таких показателей может быть тау-белок — фосфопротеин, участвующий в структурно-функциональной организации цитоскелета нейронов и регулирующий рост аксонов. В ЦСЖ пациентов с НС его уровень значительно выше, чем у пациентов без НС, что позволяет предположить, что тау-белок может быть важен для диагностики НС в случаях перенесенного сифилиса и снижения когнитивных функций пациентов [42].
Разработан способ диагностики НС путем исследования уровня сфингомиелина в ЦСЖ с помощью проточной тонкослойной хроматографии [43]. Сфингомиелин — фосфолипид; локализуется в клеточной мембране, может участвовать в передаче клеточных сигналов; в большом количестве содержится в аксонах нервных волокон. Авторы изобретения показали, что при уровне сфингомиелина 3,0–3,7 мг% может быть диагностирован неосложненный сифилис, а при уровне 8,7–11,1 мг% — НС.
Перспективным считается определение в ЦСЖ β2-микроглобулина, так как данный белок является маркером активации клеточного иммунитета. В норме уровень β2-микроглобулина в ЦСЖ очень низкий. По мнению исследователей [44, 45], содержание β2-микроглобулина повышено в ЦСЖ новорожденных с НС вследствие интратекального синтеза данного белка.
Многообещающим биомаркером для ранней диагностики НС считают фермент белковую лиазу — предшественник β-амилоида (β-amyloid precursor protein lyase), или BACE1, — интегральный мембранный белок, сконцентрированный в синапсах нейронов. Он функционирует как рецептор клеточной поверхности и участвует в качестве регулятора образования синапсов и нейронной пластичности [46, 47]. В исследовании M. Zhang и соавт. [48] показано, что уровни BACE1 в плазме значительно коррелируют с уровнями BACE1 в ЦСЖ больных НС.
Одним из возможных биомаркеров НС может служить триггерный рецептор, экспрессируемый на клетках костного мозга 2 (TREM2), который образуется в высоких концентрациях в клетках микроглии ЦНС, где, предположительно, играет роль в ослаблении иммунного ответа. В исследовании W. Li и соавт. [49] показано, что уровень sTREM2 в ЦСЖ значительно выше у пациентов с НС, чем без НС, и выше при позднем НС, чем при раннем, что позволяет предположить, что sTREM2 может служить основой для клинического прогноза НС.
Для улучшения диагностики НС, особенно с симптомами, предлагается определять в ЦСЖ концентрацию легких и тяжелых цепей нейрофиламентов — чувствительных маркеров разрыва аксонов, которые высвобождаются в ответ на повреждение миелинизированных аксонов и могут служить биомаркером-кандидатом для ранней диагностики и оценки прогноза при НС [50].
Метаболом и биохимические показатели
Одним из современных подходов к изучению патогенеза и диагностике НС может явиться «омиксный» подход, основанный на использовании метаболомики — науки, занимающейся изучением профилей низкомолекулярных метаболитов, являющихся конечным продуктом клеточных процессов. В сифилидологии использование методов метаболомики только начинается. В базе данных PubMed по ключевым словам «metabolomics», «syphilis» нам удалось найти только 4 публикации, 2 из которых посвящены НС.
Основываясь на принципах метаболомики, Li-Li Liu и соавт. [51] провели анализ ЦСЖ пациентов с НС с использованием системы ВЭЖХ Agilent 1290 Infinity, при этом у пациентов с НС по сравнению с пациентами с сифилисом без НС и пациентами без сифилиса наблюдались соответственно 87,369-кратные и 7,492-кратные изменения уровня N-ацетил-L-тирозина, участвующего в метаболизме фруктозы, маннозы, галактозы, лизосом, транспортеров ABC. Помимо этого, в ЦСЖ пациентов с НС идентифицировано несколько высокоэкспрессируемых метаболитов, включая L-гулоно-гамма-лактон, D-маннозу, N-ацетил-L-тирозин и гипоксантин. Эти метаболиты потенциально могут улучшить диагностику НС в будущем. Их роль в развитии НС заслуживает дальнейшего изучения. В работе других авторов из Китая [52] в качестве новых потенциальных маркеров НС отмечены билирубин, L-гистидин, простагландин E2, альфа-камлоленовая кислота, бутирил-L-карнитин и пальмитоил-L-карнитин.
Существуют методики, позволяющие уточнить форму НС и диагностировать доклиническое поражение нервной системы путем определения таких молекулярных маркеров изменений ЦНС, как ацетилтриптофан, индолуксусная, индолмасляная кислоты, ацетилморфолин и т.д.) при помощи газохроматографических и масс-спектрометрических методов [53]. Показано, что неспецифическим показателем поражения нервной системы при НС может быть содержание в ЦСЖ глюкозы, уровень которой снижается при ранних и повышается при поздних формах НС, а также уровень хлоридов и ряда ферментов (АсАТ, АлАТ, ЛДГ, ЩФ, креатинкиназа, γ-глутамилтранспептидаза), демонстрирующих разнонаправленные изменения в зависимости от клинической формы НС [9].
Заключение
Как следует из приведенных данных, существует множество потенциальных маркеров НС, однако в настоящее время в ликвородиагностике НС, кроме общепринятого определения концентрации общего белка и цитоза, широко используются только нетрепонемные и трепонемные тесты, определяющие уровень антител к T. pallidum в ЦСЖ.
Что касается специфической диагностики НС, то большие надежды возлагаются на применение ранее широко не использовавшихся индексов, определяющих наличие интратекального синтеза антител к T. pallidum, а также на разработку и внедрение в практику иммуночипов, возможно, в расширенном формате, выявляющих антитела к наиболее иммуногенным рекомбинантным белкам T. pallidum.
Совокупность применяемых показателей может быть оценена путем использования математических подходов, в частности многомерного дискриминантного анализа.
Специфической современной технологией, позволяющей осуществлять прямую детекцию ДНК T. pallidum, является метагеномное секвенирование нового поколения, которое с учетом его трудоемкости и высокой стоимости может быть использовано в сложных для диагностики случаях.
Описанные выше неспецифические белки, цитокины, хемокины, нейрофиламенты могут явиться потенциальными маркерами для оценки активности иммунопатологического процесса при НС, однако этот вопрос нуждается в дальнейшем изучении. Оценка диагностической и прогностической ценности потенциальных биомаркеров НС возможна только при комплексном определении уровня нескольких маркеров, возможно, в формате белкового микрочипа при одновременном учете других показателей (цитоз, белок, значений НТТ и ТТ).
Изучение метаболомных профилей и молекулярных индикаторов изменений ЦНС с использованием систем высокоэффективной жидкостной и газожидкостной хроматографии, масс-спектрометрии, а также методами биохимического анализа может как явиться новым способом изучения патогенеза НС, так и, возможно, использоваться в диагностике данной формы заболевания.
Участие авторов:
Концепция и дизайн — Н.Н. Потекаев, Н.В. Фриго, Г.А. Дмитриев
Поиск источников литературы — Н.В. Фриго, Г.А. Дмитриев, Т.С. Махновская, А.В. Жданович
Написание текста — Г.А. Дмитриев, Н.В. Фриго, Н.В. Китаева, Т.С. Махновская
Редактирование — Н.В. Фриго, О.В. Доля
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Authors’ contributions:
The concept and design of the study — N.N. Potekaev, N.V. Frigo, G.A. Dmitriev
Literature search — N.V. Frigo, G.A. Dmitriev, T.S. Mahnovskaya, A.V. Zhdanovich
Drafting the manuscript — G.A. Dmitriev, N.V. Frigo, N.V. Kitaeva, T.S. Mahnovskaya
Revising the manuscript — N.V. Frigo, O.V. Dolya
1 Секвени́рование нуклеиновых кислот (ДНК и РНК) — определение их нуклеотидной последовательности (от лат. sequentum — последовательность).
2 Комплексный анализ генетического материала микроорганизмов и хозяина (ДНК или РНК) непосредственно в клинических образцах, получаемых от пациентов, с помощью секвенирования следующего поколения.
3Федеральный институт промышленной собственности.