В настоящее время основным лабораторным маркером, используемым в клинической практике для определения бактериальной природы воспаления у тяжелобольных пациентов, является прокальцитонин (ПКТ). Прокальцитониновый тест входит в международные и отечественные рекомендации по диагностике и оценке эффективности лечения пациентов с сепсисом [1, 2]. При нормальном физиологическом метаболизме синтез ПКТ как предшественника гормонально-активного кальцитонина осуществляется нейроэндокринными С-клетками щитовидной железы. Практически весь ПКТ, синтезируемый С-клетками, конвертируется в кальцитонин и в крови здоровых не определяется [3]. Повышение сывороточной концентрации ПКТ при ряде патологических состояний связано с деятельностью клеток — участников диффузной нейроэндокринной системы, расположенных в печени, почках, легких, нервной системе, желудочно-кишечном тракте и других органах и системах. Наиболее мощными индукторами синтеза ПКТ являются липополисахариды (ЛПС) клеточных мембран грамотрицательных бактерий и провоспалительные цитокины [4]. Белки теплового шока и факторы, ассоциированные с разрушением тканей (Damage associated molecular patterns — DAMP), также стимулируют синтез ПКТ [5].

В практике работы лабораторий прокальцитониновый тест обладает рядом достоинств и недостатков. К достоинствам относятся прежде всего высокая чувствительность стандартизованных тест-систем и быстрота получения результата. Вместе с тем есть результаты исследований [6, 7], показывающие, что при сепсисе, вызванном грамположительными микроорганизмами или грибами, отсутствуют выраженные повышения концентрации ПКТ. Известный эффект временной задержки повышения концентрации ПКТ, а также его неспецифическое по отношению к бактериальной инфекции повышение при тяжелых травмах, ожогах и других состояниях, об-условленное появлением в циркуляции больших количеств DAMP, в ряде случаев затрудняет трактовку результатов исследования.

В последние годы для быстрого определения бактериальной природы тяжелого воспаления изучается широкий спектр биологических маркеров. Одним из них является CD64, определяемый на нейтрофилах периферической крови (nCD64) [8, 9]. CD64 — высокоаффинный рецептор к IgG (Fc-γ RI), который не экспрессируется в норме зрелыми нейтрофилами крови. Его экспрессия возрастает в течение 15 мин после взаимодействия с ЛПС-активированным эндотелием сосудистого русла [10]. Появление в кровотоке ЛПС, продуктов расщепления компонентов комплемента и провоспалительных цитокинов также приводит к быстрому повышению экспрессии nCD64 [11].

Широкому применению теста по определению экспрессии nCD64 препятствуют необходимость использования дорогостоящего оборудования и отсутствие доступных стандартизованных тест-систем. Различия в способах оценки nCD64 и пороговых значениях (cut-off) приводят к выраженной вариабельности диагностической эффективности теста: чувствительность варьирует от 66 до 96%, специфичность — от 65 до 100% [11]. Тем не менее результаты мета-анализов исследований этого маркера среди взрослых пациентов [12] и новорожденных [13] позволили авторам рекомендовать выявление nCD64 для ранней диагностики бактериальной инфекции при наличии в лаборатории стандартного протокола исследований и при определении пороговых значений.

Данные исследования концентраций ПКТ и относительного количества нейтрофилов CD64+ у пациентов с сепсисом различной этиологии показали связь между этими лабораторными маркерами [14]. Однако в некоторых случаях высокий уровень nCD64 не сопровождался повышением концентрации ПКТ и выраженной клинической картиной сепсиса. По-видимому, несмотря на то что триггеры синтеза ПКТ и nCD64 схожи, эти лабораторные маркеры могут отражать неидентичные звенья патогенеза сепсиса.

Цель настоящего исследования — оценка связи ПКТ и nCD64 с основными составляющими септического процесса: наличием бактерий в крови и выраженностью органной дисфункции.

Обследовали 80 пациентов отделений реанимации и интенсивной терапии (ОРИТ) ФГБУ «Всероссийский центр экстренной и радиационной медицины им. А.М. Никифорова» МЧС России (ВЦЭРМ МЧС России): 24 больных с тяжелыми бактериальными инфекциями, 56 — с сепсисом (табл. 1).

Обследование включало бактериологический посев, определение концентрации ПКТ и относительного количества nCD64. Взятие материала для всех исследований у пациентов проводили в один день.

Статистическая обработка результатов проводилась с помощью пакета программ Statistica 10.0. Для расчета связей использовали непараметрический корреляционный анализ по Спирмену, для сравнения групп — критерий Манна—Уитни, для определения пороговой величины nCD64 — ROC-анализ. Результаты представлены в таблицах в виде медиан, 1 и 3 квартилей.

Сбор материала проводили стандартными методами: кровь засевали на две пары флаконов Bact/Alert 3D («БиоМерье», Франция), инкубировали. Выделенные микроорганизмы идентифицировали с использованием бактериологического анализатора VITEK2 («БиоМерье», Франция), определение чувствительности к антибактериальным препаратам осуществляли автоматическим методом, применяя соответствующие карты.

Для количественного определения ПКТ в сыворотке крови применяли метод иммунохимии с использованием тест-систем VIDAS BRAHMS PCT (прибор и реактивы «БиоМерье», Франция).

Кровь брали из локтевой вены, в качестве антикоагулянта использовали этилендиаминтетрауксусную кислоту. Для обследования каждого пациента готовили 2 пробирки. В первую вносили 50 мкл крови и антитела IgG1 (FITC), CD14 (PE), CD16 (PC5), CD45 (PC7), во вторую — 50 мкл крови и антитела CD64 (FITC), CD14 (PE), CD16 (PC5), CD45 (PC7). Инкубировали 15 мин в темноте. Для лизиса эритроцитов использовали VersaLyse. Пробы анализировали на проточном цитофлюориметре Navios. Все реактивы и прибор производства компании «Beckman Coulter» (США). Для выявления целевой популяции применяли многоэтапное гейтирование. Популяцию нейтрофилов определяли как CD45+dimSSCbrightCD16±клетки. Накапливали до 20 000 событий в регионе целевой популяции. Первая пробирка использовалась для оценки неспецифического связывания с антителами (негативный контроль по изотипу). Анализ второй пробирки позволял оценить относительное количество нейтрофилов CD64+ от их общей популяции. В качестве внутреннего позитивного контроля брали популяцию моноцитов (CD14+SSCdim-клетки), конститутивно экспрессирующих CD64.

Положительные результаты посевов крови определялись в 36% случаев (табл. 2).

Относительное количество нейтрофилов nCD64+ статистически значимо отличалось в группах с наличием или отсутствием возбудителя в крови. Вместе с тем результаты теста на ПКТ в образцах с бактериемией и без нее были достаточно вариабельны, и, несмотря на тенденцию к повышению ПКТ при положительных результатах бактериологического посева, значимых отличий выявить не удалось. В образцах с нормальным и умеренно повышенным ПКТ были обнаружены возбудители в 25 и 38% случаев соответственно (табл. 3),

У пациентов с нормальным и умеренно повышенным уровнем ПКТ nCD64 дает возможность дифференцировать образцы с положительными и отрицательными результатами посева крови. При более высоких концентрациях ПКТ эти отличия стираются. У пациентов с высоким и очень высоким уровнем ПКТ относительное количество нейтрофилов CD64+ повышается до максимальных значений независимо от наличия микроорганизмов в крови. В этих группах наиболее выражена полиорганная дисфункция.

Корреляционный анализ показал наличие связи между обоими лабораторными значениями и бактериемией, которая была более выражена для nCD64, чем для ПКТ (ρ=0,46 при p<0,001 и ρ=0,39 при p<0,05 соответственно). Связь nCD64 с результатами бактериологического посева позволяет использовать этот маркер для предварительной диагностики бактериемии даже при нормальном или умеренно повышенном уровне прокальцитонина.

В результате ROC-анализа был определен пороговый уровень (cut-off) nCD64 для ранней диагностики бактериемии, который составляет 89%, при этом чувствительность метода — 82%, специфичность — 73%.

Для оценки выраженности полиорганной дисфункции использовали шкалу SOFA, которая основывается на сумме баллов клинико-лабораторных показателей дыхательной, сердечно-сосудистой, печеночной, коагуляционной, почечной и неврологической систем [15].

У пациентов с тяжелыми бактериальными инфекциями и сепсисом была выявлена прямая корреляционная зависимость между значениями лабораторных показателей и выраженностью полиорганной дисфункции по шкале SOFA. Эта связь была более заметна для ПКТ, чем для nCD64 (ρ=0,65 и ρ=0,41 соответственно при p<0,05).

Сепсис — одна из клинических форм системного воспалительного ответа, где в качестве фактора, инициирующего повреждения, выступают микроорганизмы [16]. Раннее выявление инфекции как триггера воспалительного процесса важно для его диагностики. Тесная связь между nCD64 и наличием возбудителя в крови позволяет использовать этот маркер для предварительной диагностики бактериальной природы воспаления. По мнению ряда исследователей [17—19], оценка nCD64 необходима для дифференциальной диагностики острого бактериального процесса от системного аутоиммунного, при котором повышение нейтрофилов CD64+ также имеет место, но выражено слабее.

Несмотря на то что индукторами синтеза nCD64 и ПКТ являются сходные биологически активные молекулы: ЛПС, цитокины, продукты разрушения тканей макроорганизма, nCD64 более связан с инфекционной составляющей сепсиса, тогда как ПКТ — с системным воспалительным ответом и полиорганной дисфункцией. Экспрессию nCD64 усиливают ростовые факторы гранулоцитарного и гранулоцитарно-моноцитарного ростка (G-CSF, GM-CSF), которые продуцируют эндотелиальные клетки, активированные ЛПС [20—22]. Среди нейтрофилов, образующих монослой на ЛПС-активированном эндотелии, преобладают клетки CD64+ [10]. При сепсисе индукция транскрипции Fc-γ RI гена связана прежде всего с активацией транскрипционных факторов STAT1, STAT3, STAT5, опосредующих проведение сигналов от рецепторов G-CSF и GM-CSF [23, 24]. Возможно, зависимость уровня экспрессии CD64 нейтрофилами крови от продукции эндотелиоцитами ростовых факторов определяет специфичность этого показателя по отношению к бактериальной инфекции. Активация транскрипционного фактора NF-kB также индуцирует экспрессию гена CD64. Этот путь имеет место при стимуляции экспрессии nCD64 ЛПС или TNF-α [23].

При тяжелых поражениях отдельных органов и систем на первое место в поддержании неконтролируемого системного воспаления выходят продукты разрушения тканей — DAMP [25, 26]. Результаты настоящего исследования показали, что при развитии тяжелой полиорганной дисфункции nCD64 повышается независимо от наличия бактериемии. Взаимодействие DAMP с TLR приводит к экспрессии большого спектра провоспалительных цитокинов, в частности TNF-α. Последний является мощным индуктором синтеза как nCD64 [25], так и ПКТ [3].

В условиях воспаления основным регулятором транскрипции гена ПКТ (Calc-I) является NF-kB [27]. Продукция ПКТ, связанная с активацией этого транскрипционного фактора при взаимодействии TLR4 с ЛПС или DAMP, была отмечена в ряде исследований [28, 29]. NF-kB участвует в проведении сигналов большого количества внутриклеточных путей, в том числе от рецепторов провоспалительных цитокинов TNF-α и IL-1β, и способен запускать быструю экспрессию множества генов [30]. Возможно, высокая степень зависимости уровня ПКТ от тяжести полиорганной дисфункции (в меньшей степени — от наличия инфекции) связана с тем, что синтез ПКТ регулируется NF-kB.

Таким образом, лабораторные показатели nCD64 и ПКТ, тесно коррелирующие между собой, не являются полностью сопоставимыми. Они отражают развитие различных звеньев септического процесса. Первый в большей степени является маркером инфекционной составляющей, второй показывает выраженность органных нарушений как следствие системного воспалительного ответа. Совместное использование тестов на ПКТ и nCD64 позволяет улучшить качество обследования тяжелобольных пациентов. По мнению группы исследователей, занимавшихся разработкой комплексов лабораторных показателей для наблюдения за пациентами ОРИТ, включение в единую панель nCD64, ПКТ и триггерного рецептора миелоидных клеток 1 (sTREM-1) существенно улучшает раннюю диагностику сепсиса [31].

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflicts of interest.

Сведения об авторах

Калашникова Анастасия Андреевна — https://orcid.org/0000-0002-5338-0866; e-mail: petkova_nas@mail.ru

Калашникова А.А. nCD64 и прокальцитонин в диагностике сепсиса: сходство и различие лабораторных показателей. Лабораторная служба. 2019;8(4):-12. https://doi.org/10.17116/labs20198041

Автор, ответственный за переписку: Калашникова Анастасия Андреевна — e-mail: petkova_nas@mail.ru