Введение
Цитологическое исследование перитонеальных смывов для выявления свободных опухолевых клеток (СОК) является эффективным инструментом диагностики микроканцероматоза у больных раком желудка (РЖ). Диагностическая ценность исследования продемонстрирована в ряде работ [1—5] и признана ведущими мировыми онкологическими сообществами [1, 3], а его результат зачастую определяет выбор лечебной тактики [1—5]. Однако результаты цитологического исследования традиционной светооптической техникой демонстрируют достаточно низкую общую точность метода [6—10]. Это обусловлено в первую очередь отсутствием стандартов пробоподготовки и подробной информации в источниках литературы, которые представлены немногочисленными работами в иностранных периодических изданиях [11, 12].
Ключевыми задачами на преаналитическом этапе являются предотвращение дегенеративной трансформации клеточного материала, а также выбор оптимальной методики приготовления и окрашивания препаратов [12]. Все вышеперечисленное требует дальнейшей разработки и определения стандартов в этапах пробоподготовки.
Цель исследования — повысить информативность детекции СОК в перитонеальном смыве при РЖ путем стандартизации этапов пробоподготовки.
Материал и методы
В анализ вошли материалы 365 больных РЖ, проходивших обследование и лечение в отделении высокотехнологичной хирургии с июня 2016 г. по январь 2019 г.
Средний возраст пациентов составил 64 года (32—86 лет), из них 178 женщин и 187 мужчин.
Перитонеальные смывы получены при диагностической лапароскопии по стандартной методике: доступом в околопупочной области устанавливается 10 мм троакар с лапароскопом, далее устанавливаются два дополнительных 5 мм троакара для аспиратора/ирригатора и мягкого зажима. Проводится визуальная оценка париетальной и висцеральной брюшины, стенки желудка, сальника, поверхности печени, гепатодуоденальной связки. Также пальпаторно определяется наличие первичного опухолевого очага, производится оценка его свойств (плотность при пальпации, смещаемость, наличие связи с окружающими структурами), далее выполняют смыв путем ирригации 200 мл предварительно подогретого физиологического раствора (37 °C) в свободную брюшную полость на диафрагмальную и висцеральную поверхность печени, париетальную брюшину с последующей полной аспирацией, материал немедленно доставлялся в лабораторию (не более 15 мин) [13—19]. Далее получали и оценивали осадок, приготовленный центрифугированием из части (1/2) образца, на центрифуге Multi Centrifuge CM 6M (5 мин, 2000 оборотов/мин). Объем осадка измерялся в миллилитрах. В зависимости от величины осадка материал был разделен на гипоклеточный (<0,5 мл), нормоклеточной (0,5—1,0 мл) и гиперклеточный (>1,0 мл). Образцы проходили пробоподготовку по «жидкостной» методике на цитоцентрифуге Cyto-Tek («Sacura», Япония) и Thinprep («Hologic», США) и/или по методике «клеточного блока» (cell-block). В первом и втором случаях оставшийся материал (1/2) проходил аналогичную пробоподготовку и его использовали для проведения дополнительных методик, в случае «клеточного блока» материал объединяли и повторно центрифугировали. Окрашивание по Паппенгейму или по Папаниколау выполняли на стейнере АФОМК 16.
Cell block готовили на основе формалиновой фиксации (10% забуференный раствор формалина) и дальнейшего приготовления парафинового блока. Срезы толщиной 3,5—4 микрона были сделаны на микротоме Thermo Scientific HM 355S («Thermo Scientific», США).
Результаты и обсуждение
В результате исследования 365 образцов перитонеальных смывов, полученных при диагностической лапароскопии, СОК были выявлены в 133 материалах (CY+), что составило 36,4% клинических наблюдений. У 229 (62,7%) пациентов исследование на СОК было отрицательным (CY–), у 3 (0,9%) — было неинформативным.
Нами были выделены следующие преаналитические этапы: получение диагностического материала, его доставка в лабораторию, приготовление и окрашивание препарата.
На первом этапе принципиальное значение имеет бескровный доступ в брюшную полость — при необходимости после установки троакаров производили тщательный гемостаз с применением монополярной коагуляции. Для исключения потери клеточного материала необходима полная аспирация перитонеального смыва [18—19].
Полученный при перитонеальном смыве материал требует особого внимания, так как будучи помещенными в несвойственную среду, клетки быстро подвергаются дегенерации и лизису [11]. Из этого следует одна из важнейших задач — предотвратить данный процесс, в том числе обеспечив термическую изоляцию полученной жидкости и ее быструю доставку в лабораторию. Необходимо понимать, что материал становится неинформативным уже через 2 ч. Нами был проведен морфологический анализ 15 проб без примесей крови. Через 30 мин после получения материала, далее через 2, 4 и 12 ч (рис. 1—4) в препаратах всех анализируемых образцов наблюдали дегенеративные изменения эпителиального компонента, все более выраженные с течением времени. Результаты представлены в табл. 1.
Рис. 1. Сохранность эпителиального компонента и целостности структур в цитологических препаратах по материалам перитонеальных смывов через 30 мин после доставки материала.
Рис. 2. Сохранность эпителиального компонента и целостности структур в цитологических препаратах по материалам перитонеальных смывов через 2 ч после доставки материала.
Рис. 3. Сохранность эпителиального компонента и целостности структур в цитологических препаратах по материалам перитонеальных смывов через 4 ч после доставки материала.
Рис. 4. Сохранность эпителиального компонента и целостности структур в цитологических препаратах по материалам перитонеальных смывов через 12 ч после доставки материала.
Таблица 1. Сохранность эпителиального компонента и целостности структур в цитологических препаратах по материалам перитонеальных смывов
| Время хранения, ч | Сохранность материала и целостности структур | |
| эпителиальные элементы (клетки мезотелия, СОК) | элементы фона (лейкоциты, макрофагальные элементы и др.) | |
| 0,5 | Сохранны, четко визуализируются структуры и пласты клеток, а также ядра и/или ядрышки | Сохранны, четко визуализируются ядра и/или ядрышки |
| 2 | Сохранны, четко визуализируются структуры и пласты клеток, а также ядра и/или ядрышки | Сохранна часть клеток, ядра и/или ядрышки визуализируются нечетко, подвержены значительной дегенерации и лизису |
| 4 | Сохранена часть клеточных элементов в структурах, ядра и/или ядрышки визуализируются нечетко, подвержены значительной дегенерации и лизису | Все клеточные элементы фона подвержены значительной дегенерации и лизису |
| 12 | Структуры и пласты клеточных элементов визуализируются нечетко, подвержены значительной дегенерации и лизису | Все клеточные элементы фона едва различимы, подвержены значительной дегенерации и лизису, часто затрудняют морфологическую оценку эпителиального компонента |
По результатам анализируемых препаратов, количество информативного материала составляло через 30 мин 100%, через 2 ч — 74%, по истечении 4 ч — лишь 52%, а после 12 ч хранения — 37%.
Следующий важный этап — приготовление препаратов. Основную часть клеточных элементов осадка, как правило, составляет мезотелий, в меньшей мере —гистиоидные элементы, лейкоциты и потенциальные СОК. Возможна контаминация элементами периферической крови, которую легко оценить визуально, и дальнейшую пробоподготовку проводить с учетом этих особенностей.
В зависимости от величины осадка, полученного центрифугированием, материал был разделен на гипоклеточный (<0,5 мл), нормоклеточной (0,5—1,0 мл) и гиперклеточный (>1,0 мл). В первой и второй группах исследование выполнялось по «жидкостной» методике и составило 271 (74,2%) наблюдений. Для выбора наиболее эффективной и экономически выгодной техники работы с данным материалом было проведено сравнение 50 препаратов, приготовленных на цитоцентрифуге Cyto-Tek (рис. 5) и по методике Thinprep-Hologic (рис. 6). Результаты представлены в табл. 2.
Рис. 5. Материал перитонеальных смывов, приготовленный на цитоцентрифуге Cyto-Tek, окрашивание по Паппенгейму.
Рис. 6. Материал перитонеальных смывов, приготовленный по методике Thinprep-Hologic, окрашивание по Папаниколау.
Таблица 2. Сравнительная характеристика морфологических признаков в препаратах, приготовленных по методике Cyto-Tek и Thinprep
| Параметр оценки | Методика приготовления материала | |
| Cyto-Tek | Thinprep | |
| Структуры | Сохранны, визуализируются хорошо, имеют 2D структуры | Сохранны, визуализируются хорошо, имеют 3D структуры |
| Эритроциты | Сохранны, визуализируются хорошо | Лизируются в большинстве случаев, визуализируются ввиде лизированной массы при значительной примеси |
| Элементы фона | Сохранны, визуализируются хорошо | Частично лизируются, незначительное количество визуализируется хорошо |
| Ядра и ядрышки | Сохранны, визуализируются хорошо | Сохранны, визуализируются хорошо |
| Клеточность (%) | Клеточность достаточна для оценки материала и формирования заключения (96%) | Клеточность достаточна для оценки материала и формирования заключения (100%) |
Основываясь на результатах оценки «жидкостных» методик, можно отметить лучшую концентрацию препаратов и, как следствие, более высокую клеточность в материале Thinprep, а также значительный лизис элементов фона и примесей крови, кроме того, виалы содержат консервант, что позволяет длительное время избегать дегенерации эпителиального компонента. Таким образом, данная методика предпочтительней, чем Cyto-Tek, для образцов с низкой клеточностью, контаминированных значительным количеством крови, при выраженной гистиоцитарно-лейкоцитарной реакции и/или в случае необходимости хранения анализируемого образца в лаборатории свыше 2 ч. В других случаях значительной разницы в качестве диагностического материала отмечено не было.
Гиперклеточные образцы готовили по методике Cell-block. Данный способ предпочтительнее по причине возможности выполнения более широкой диагностической иммуноцитохимической панели и ее реализации по стандартным иммуногистохимическим протоколам. Однако анализ 100 проб, выбранных в случайном порядке, показал, что лишь при условии высокой клеточности образца (осадок >1,0 мл), его достаточно для анализа и при необходимости выполнения уточняющих методик.
Выбор протокола окрашивания препаратов также может влиять на качество препарата и, как следствие, детекцию СОК. Наиболее распространенными в цитологической диагностике являются окраски по Паппенгейму и Папаниколау [11, 12]. Sang-Yong Son и соавт. также исследовали возможности окрашивания материала перитонеальных смывов по Шорру, однако значительной разницы в качестве препаратов выявлено не было [12]. Для поиска более эффективной техники нами была проведена оценка 50 препаратов, приготовленных по методике Cyto-Tek («Sacura», Япония) и Thinprep («Hologic», США) и окрашенных по Паппенгейму и Папаниколау в каждом из случаев. Результаты представлены в табл. 3.
Таблица 3. Сравнительная характеристика техники окрашивания и методик приготовления материала (Cyto-Tek и Thinprep)
| Методика окраски | Метод приготовления материала | |
| Cyto-Tek | Thinprep | |
| По Паппенгейму | Окраска структур и пластов мезотелия, опухолевых клеток при их наличии равномерная, ядерная мембрана четко визуализируется только в части материала, структура хроматина и ядрышки визуализируются четко, элементы фона окрашены равномерно | Окраска структур и пластов мезотелия, опухолевых клеток при их наличии равномерная, ядерная мембрана четко визуализируется только в части материала, структура хроматина и ядрышки визуализируются четко, элементы фона и не полностью лизированные обломки эритроцитов часто окрашиваются ярко, в виде «грязного фона», затрудняют визуальную оценку всего препарата |
| По Папаниколау | Окраска структур и пластов мезотелия, опухолевых клеток при их наличии равномерная, ядерная мембрана четко визуализируется во всех препаратах, структура хроматина и ядрышки визуализируются очень четко, элементы фона окрашиваются слабо, не затрудняют визуальную оценку всего препарата | Окраска структур и пластов мезотелия, опухолевых клеток при их наличии равномерная, ядерная мембрана четко визуализируется во всех препаратах, структура хроматина и ядрышки визуализируются очень четко, элементы фона и не полностью лизированные обломки эритроцитов окрашиваются слабо, не затрудняют визуальную оценку всего препарата |
По результатам сравнительного анализа, окрашивание по Папаниколау во всех случаях позволила более четко визуализировать ядерную мембрану, следовательно, выявлять дискариоз и слабый полиморфизм при их наличии. Для препаратов Thinprep методика Паппенгейма и вовсе затрудняла визуализацию в 33 (66%) случаев (рис. 7). Таким образом, использовать для перитонеальных смывов, приготовленных по «жидкостной» методике, предпочтительнее окрашивание по Папаниколау.
Рис. 7. Препарат, приготовленный по методике Thinprep, окрашивание по Паппенгейму.
Заключение
Представленный алгоритм пробоподготовки позволил нам получить информативный материал в 99,1% случаев.
Каждый из этапов преаналитической части исследования одинаково значим и при нарушении может затруднить оценку материала, препятствовать формированию корректного цитологического заключения и привести к выбору тактики лечения, не соответствующей стадии заболевания.
Выбор методики, основанный на результатах первичной оценки полученного материала (объема осадка, вероятной контаминации периферической кровью и др.), позволяет значительно повысить информативность метода.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.