Введение

В настоящее время хорошо известно, что действие витамина D не ограничивается регуляцией кальций-фосфатного гомеостаза и также связано с клеточной пролиферацией и дифференцировкой, воспалением и иммунитетом [1, 2]. В кровообращении витамин D и его метаболиты транспортируются белком-переносчиком витамина D (DBP, 58-kD). Мегалин, также известный как Lrp2 (Low-density lipoprotein-related protein 2), или gp330, является трансмембранным рецептором, необходимым для поглощения 25-гидроксивитамин D (25OHD)-DBP [3] и синтеза активной формы в митохондриях извитого фрагмента проксимальных канальцев почек. Результаты экспериментальных исследований подтверждают потенциальные нефропротективные эффекты витамина D и его аналогов [4—13]. Защитное действие витамина D связывают с модуляцией многочисленных сигнальных путей, в том числе ренин-ангиотензин-альдостероновой системы (РААС) [14], ядерного фактора-κB (NF-κB) [15], трансформирующего фактора роста-β (TGF-β)/Smad [16], сигнального пути Wnt/β-катенин [15], обусловливающих негативную регуляцию клеточной гибели и фиброза. Поскольку 25-гидроксивитамин D является субстратом для синтеза активной формы, его дефицит приводит к снижению 1,25-дигидроксивитамина D (1,25(OH)₂D) в циркуляции. Согласно экспериментальным и клиническим исследованиям, уровень 25OHD может снижаться под действием катаболического фермента CYP24 канальцев, экспрессия которого существенно возрастает при дисфункции почек [17]. Нарушение мегалин-опосредованного транспорта 25OHD в поврежденных проксимальных канальцах приводит к снижению доступного субстрата для синтеза 1,25(OH)₂D [3]. В контексте новых данных исследование ассоциации между уровнем 25OHD и патологическими изменениями в почке представляет существенный интерес, поскольку измерение 25OHD является доступным лабораторным тестом, а восполнение дефицита витамина D — относительно простой клинической задачей. Целью исследования являлся анализ взаимосвязей между уровнем 25OHD и тубулоинтерстициальными изменениями у пациентов с начальными стадиями хронической болезни почек.

Материал и методы

В исследование были включены 100 человек: 44 мужчины и 56 женщин (возраст 39 (30—51) лет). Участники исследования были распределены следующим образом: контрольная группа условно здоровых лиц без нефрологической патологии и с нормальными значениями расчетной скорости клубочковой фильтрации (рСКФ; n=10), и группа пациентов с гломерулопатиями, первично поступивших на нефрологические отделения ПСПбГМУ им. акад. И.П. Павлова (табл. 1). Сбор образцов венозной крови и суточной мочи назначали накануне выполнения биопсии почки. Критериями исключения являлись острое повреждение почек, инфекционные заболевания, сердечная/легочная недостаточность, онкологические заболевания, иммуносупрессивная терапия, терапия препаратами витамина D в дозах, превышающих профилактические. Все пациенты проходили стационарное клиническое, лабораторное и инструментальное обследование согласно внутренним стандартам ПСПбГМУ им. акад. И.П. Павлова для пациентов с заболеваниями почек.

Таблица 1. Основные клинико-демографические показатели исследуемой группы пациентов (n=90)

Примечание. Данные представлены как медиана с интерквартильным размахом (Me, Q1—Q3), рСКФ — расчетная скорость клубочковой фильтрации (CKD-EPI).

Биохимические исследования. Кровь и мочу центрифугировали при 1500 g в течение 10 мин, после чего выполняли лабораторные исследования либо хранили аликвоты при температуре –80 °C до момента проведения теста (не более 6 мес). Концентрацию креатинина измеряли модифицированным методом Яффе путем регистрации кинетики реакции (значения калибратора прослеживаются до IDMS через SRM967 (NIST)) («Beckman Coulter», США). рСКФ рассчитывали по формуле CKD EPI [18]. Концентрацию белка в моче определяли методом с пирогаллоловым красным на автоматическом биохимическом анализаторе Synchron CX9 («Beckman Coulter», США). Для стандартизации результатов рассчитывали суточную протеинурию. Измерение концентрации интактного паратиреоидного гормона (ПТГ) в сыворотке крови пациентов проводили при помощи тест-системы Intact PTH на анализаторе Access Immunoassay System («Beckman Coulter», США). Концентрацию 25OHD в сыворотке крови измеряли с использованием тест-системы ARCHITECT 25OH витамин D («Abbott Laboratories», США) для количественного определения 25OHD₂ и 25OHD₃ [19] на анализаторе ARCHITECT i2000SR («Abbott Laboratories», США). Данная тест-система обладает надежными характеристиками получаемых результатов. Набор не определяет эпимеры (перекрестная реактивность с 3-epi 25-OH витамин D₃ составляет 2,7%). Тест-система ARCHITECT 25-OH Vitamin D имеет коэффициент корреляции 0,90 для образцов сыворотки крови при сравнении с референсным методом хроматографии (ЖХ/МС/МС). По данным, приведенным в инструкции к тест-системе внутрилабораторный коэффициент вариации (КВ) составляет 2,6—4,6% (менее допустимых 10%). Согласно собственным исследованиям, внутрисерийный КВ составляет 1,6—5,92% и межсерийный — 2,15—2,63% [20].

Гистологическое исследование. Фрагменты почки фиксировали в 5% нейтральном формалине (pH 7,4) в течение 24 ч при комнатной температуре (22 °C). После стандартной обработки (обезвоживание и пропитка) из парафиновых блоков изготавливали серийные срезы толщиной 2—4 мкм. Морфологическое исследование включало анализ изменений на светооптическом уровне (семь стандартных окрасок). Выраженность распространенности дистрофических изменений тубулоинтерстиция оценивали полуколичественно в баллах (0 — <10%; 1 — 10—25%; 2 — 26—50%; 3 — >50%) по системе, разработанной в НИИ нефрологии ПСПбГМУ им. акад. И.П. Павлова. Суммарные дистрофические изменения тубулярного эпителия (ТИ) рассчитывали по формуле: ТИ (баллы) = (ЗДК+ГДК+ВДК+ППК)/4+АК, где ЗДК — зернистая дистрофия канальцев, ГДК — гиалиновокапельная дистрофия канальцев, ВДК — вакуольная дистрофия, ППК — пенистое перерождение канальцев и АК — атрофия канальцев.

Статистический анализ данных выполняли с помощью пакета программ SAS Enterprise Guide 9.4. Поскольку статистическое распределение большинства изученных параметров не соответствует нормальному, данные представлены как медиана и интерквартильный размах (Me, Q1—Q3). Для сравнения двух выборок использовали критерий Манна—Уитни, при сравнении большего количества выборок — критерий Краскела—Уоллиса. Для оценки связей между переменными применяли непараметрический ранговый коэффициент корреляции Спирмена и множественный линейный регрессионный анализ. Межгрупповые различия и регрессионные коэффициенты считали статистически значимыми при значении p<0,05.

Исследование одобрено локальным этическим комитетом ПСПбГМУ им. И.П. Павлова. Все участники подписывали информированное согласие на участие в исследовании.

Результаты

При анализе результатов пациенты были поделены на две группы по уровню расчетной скорости клубочковой фильтрации: 1-я группа — рСКФ ≥60 мл/мин/1,73м² (ранние стадии ХБП C1 и C2, n=47) и 2-я группа — рСКФ <60 мл/мин/1,73м² (более поздние стадии ХБП C3 и C4, n=43). Уровни суточной протеинурии в группах пациентов не различались (p=0,46): в 1-й группе протеинурия составляла 2,80 (0,97—8,26) г, а во 2-й группе — 2,28 (1,18—6,24) г. У пациентов 2-й группы наблюдали более выраженные фибропластические изменения тубулоинтерстиция — очаговый интерстициальный фиброз (рис. 1, а) и периваскулярный склероз (p<0,001). Достоверные различия между зернистой (p=0,096), гиалиновокапельной (p=0,10), вакуольной (p=0,14) дистрофией и пенистым перерождением (p=0,097) канальцев отсутствовали. Суммарные дегенеративные изменения тубулярного эпителия были более выражены при рСКФ <60 мл/мин/1,73м² (рис. 1, б).

Рис. 1. Полуколичественная морфометрия выраженности очагового интерстициального фиброза (а) и суммарных тубулярных изменений (б) в группах пациентов с рСКФ ≥60 и <60 мл/мин/1,73м².

У большинства обследованных был выявлен низкий уровень 25-гидроксивитамина D, соответствовавший недостатку или дефициту витамина D (рис. 2). У пациентов наблюдали тенденцию к снижению концентрации 25OHD в сыворотке крови по сравнению с контрольной группой, тем не менее данный тренд не был достоверным (p=0,06), различия между исследуемыми группами пациентов отсутствовали (p=0,14). Уровень ПТГ был выше у пациентов с рСКФ <60 мл/мин/1,73 м² (59,8 (46,8—111,3)), чем у пациентов с рСКФ ≥60 мл/мин/1,73 м² (29,6 (23,8—44,0), p=0,028). Корреляция между концентрациями 25OHD и ПТГ в сыворотке крови отсутствовала (r= –0,03, p=0,86).

Рис. 2. Уровень 25-гидроксивитамина D в сыворотке крови в контрольной группе и у пациентов с поражением почек при рСКФ ≥60 и <60 мл/мин/1,73м².

Была выявлена достоверная взаимосвязь между снижением 25OHD и патологическими изменениями канальцев нефрона, в частности с зернистой и гиалиновокапельной дистрофией канальцев (табл. 2).

Таблица 2. Регрессионный анализ взаимосвязи между концентрацией 25-гидроксивитамина D (25OHD) и морфологией биоптата почки

Примечание. рСКФ — расчетная скорость клубочковой фильтрации, ЗДК — зернистая дистрофия канальцев, ГДК — гиалиновокапельная дистрофия канальцев, ВДК — вакуольная дистрофия, ППК — пенистое перерождение канальцев и АК — атрофия канальцев, ТИ — суммарные тубулярные изменения, ОИФ — очаговый интерстициальный фиброз, ПВС — периваскулярный склероз; в таблице указаны значения коэффициента корреляции Спирмена; * — p<0,05.

У пациентов с рСКФ ≥60 мл/мин/1,73 м² выраженная дистрофия канальцев сочеталась с низкими значениями 25OHD (рис. 3, а, 4, а) и высокой протеинурией (рис. 3, в, 4, в). В группе пациентов с рСКФ <60 мл/мин/1,73 м² степень выраженности дистрофии канальцев была ассоциирована со снижением концентрации 25OHD (рис. 3, б и 4, б) и не зависела от уровня протеинурии (рис. 3, г, 4, г). При множественном линейном регрессионном анализе было показано, что 25OHD является независимым предиктором ГДК (β= –0,33±0,11, p=0,046), несмотря на включение в модель протеинурии в качестве независимой переменной (β=0,22±0,11, p=0,062). Уровень протеинурии негативно коррелировал с концентрацией 25OHD в сыворотке крови (r= –0,56, p=0,012).

Рис. 3. Выраженность зернистой дистрофии канальцев (0—1 и 2 балла) и уровень 25-гидроксивитамина D (25OHD) в группе пациентов с рСКФ ≥60 (а) и <60 мл/мин/1,73м² (б), протеинурии при рСКФ ≥60 (в) и <60 мл/мин/1,73м² (г); рСКФ — расчетная скорость клубочковой фильтрации, ЗДК — зернистая дистрофия канальцев.

Рис. 4. Выраженность гиалиновокапельной дистрофии канальцев (0—1 и 2 балла) и уровень 25-гидроксивитамина D (25OHD) при рСКФ ≥60 (а) и <60 мл/мин/1,73 м² (б), протеинурии при рСКФ ≥60 (в) и <60 мл/мин/1,73м² (г); рСКФ — расчетная скорость клубочковой фильтрации, ГДК — гиалиновокапельная дистрофия канальцев.

Обсуждение

Заболевания, связанные с нарушением функции почек или повреждением канальцев, сопровождаются хроническим воспалением, обусловленным окислительным стрессом, ацидозом, снижением клиренса воспалительных цитокинов и стимуляцией воспалительных факторов [6, 21]. Экспериментальные модели in vitro, а также исследования на животных и клинические исследования продемонстрировали нефропротективные свойства витамина D и его аналогов [4—13]. Недостаток или дефицит витамина D традиционно сопутствуют ХБП [21—24]. С другой стороны, установлены иммуномодулирующие свойства витамина D, его способность оказывать реципрокное действие на регуляторные пути цитокинов, а также участие в ремоделировании внеклеточного матрикса [25, 26]. Следовательно, уровень обеспеченности витамином D может быть связан с изменениями как тубулярного (дистрофия и атрофия канальцев), так и интерстициального (интерстициальный фиброз) компонентов почки при иммунных гломерулопатиях. Ренальный фиброз является важнейшим механизмом прогрессирования ХБП, при котором центральную роль играют активация фибробластов и эпителиально-мезенхимальная трансформация (ЭМТ) клеток канальцев [27], запускаемые фиброгенными цитокинами, главным из которых является трансформирующий ростовой фактор β1 (TGF-β1) [28, 29]. Значительное количество данных свидетельствует о взаимосвязи между уровнем обеспеченности витамином D и интерстициальным фиброзом органов [2, 4, 5]. Доказано, что кальцитриол проявляет почечную защитную активность через множественные механизмы, такие как ингибирование воспаления почек, регуляция ренин-ангиотензиновой системы, блокировка активации мезангиальных клеток [14—16]. Исследования in vivo и in vitro показали, что D-гормон эффективно блокирует ЭМТ клеток канальцев — процесс, играющий центральную роль в развитии почечного интерстициального фиброза [28, 29]. В исследовании моделей фиброза почек аналог активной формы витамина D парикальцитол эффективно предотвращал TGF-β1-индуцированную ЭМТ и накопление внеклеточного матрикса [30]. По нашим данным, уровень очагового интерстициального фиброза был значительно выше у пациентов с рСКФ <60 мл/мин/1,73 м² (ХБП C3—4), чем у пациентов с ХБП C1—2. Несмотря на то, что ранее в моделях экспериментальной ХБП мы подтвердили ассоциацию между сниженной концентрацией 25OHD в сыворотке и фиброзом почки [24] и миокарда [23], в представленном исследовании корреляция между 25OHD и ренальным фиброзом отсутствовала. Это может быть связано с тем, что у пациентов прогрессирование ХБП происходило на фоне предсуществующего недостатка или дефицита витамина D. В экспериментальном исследовании уровень кальцидиола у контрольных крыс был существенно выше, чем у крыс с экспериментальной ХБП (модель нефрэктомии ³/₄ объема органа). Авторы применяли разные методики оценки выраженности ренального фиброза.

В представленном исследовании не выявлена связь 25OHD непосредственно с количеством полностью или частично склерозированных клубочков. Подобные результаты были получены в исследовании D. Dabak и соавт. [31], что не согласуется с некоторыми экспериментальными [32—35] и клиническими [36] данными о защитном действии 1,25(OH)₂D на клубочки. В этих исследованиях авторы предположили, что снижение протеинурии под действием витамина D может ослаблять ассоциированное с протеинурией повреждение канальцев при нефропатиях [35—37]. Наблюдаемая нами корреляция между 25OHD и протеинурией может свидетельствовать в поддержку гипотезы о защитном действии кальцитриола (кальцитриол не определялся в этом исследовании) на гломерулы. Кроме того, мы продемонстрировали независимую от протеинурии связь 25OHD с гиалиновокапельной дистрофией канальцев. Полученные данные косвенно подтверждают нефропротективное действие витамина D на клубочки, что может быть связано со снижением протеинурии и ассоциированными с ней повреждениями эпителия канальцев.

Принято считать, что при ХБП снижение концентрации 1,25(OH)₂D в сыворотке связано с нарушением второго этапа гидроксилирования из-за потери 1a-гидроксилазы почек (CYP27B1) в результате повреждения эпителия проксимальных канальцев [38, 39]. Помимо нарушений синтеза и катаболизма 1,25(OH)₂D, ускоренная деградация его предшественника 25OHD также способствует формированию дефицита витамина D при ХБП [40]. Предполагают, что митохондриальный цитохром CYP24 играет существенную роль в катаболизме 25OHD (как и 1,25(OH)₂D) при ХБП [41, 42]. Нокаут гена CYP24 значительно увеличивает период стабильности 25OHD, в то время как рост экспрессии мРНК и белка CYP24 сочетается с низким уровнем 25OHD [43, 44]. Следовательно, одним из объяснений обнаруженной нами взаимосвязи между 25OHD и тубулярным повреждением может являться увеличение активности CYP24 и деградации 25OHD при повреждении эпителия канальцев. Факторами, приводящими к снижению уровня витамина D при ХБП, также могут являться увеличение экскреции 25OHD-DBP с мочой, снижение синтеза 1,25(ОН)₂D и секреции 25OHD/1,25(ОН)₂D из-за нарушения кубилин-мегалинового транспорта в поврежденных почечных канальцах [3, 45]. Мы наблюдали повышение уровня суммарных дегенеративных изменений канальцев у пациентов с более поздними стадиями ХБП. В общей группе пациентов низкие концентрации 25OHD были ассоциированы с дистрофическими изменениями канальцев нефрона.

Следует отметить, что, несмотря на данные литературы о снижении 25OHD при ХБП, нами не было обнаружено значительных различий между концентрациями 25-OHD в сыворотке крови пациентов с ХБП C1—2, ХБП C3—4 и контрольной группы. Отсутствие снижения кальцидиола может быть связано с широкой распространенностью дефицита витамина D в общей популяции Северо-Западного региона России [20, 21], что подтверждалось нашими наблюдениями, где у большинства обследованных уровень 25OHD в сыворотке крови был ниже 30 нг/мл.

Эффекты витамина D разнообразны по своей физиологической направленности и не всегда предсказуемы. Собственные результаты и данные литературы свидетельствуют о том, что недостаток и дефицит кальцитриола и/или его предшественника 25OHD ассоциированы с системными негативными процессами в организме и неблагоприятным прогнозом при ХБП. Молекулярные механизмы защитного воздействия витамина D на почки при ХБП все еще остаются неясными и требуют дальнейших исследований.

Заключение

У пациентов с хронической болезнью почек низкие концентрации 25OHD в сыворотке крови ассоциированы с более выраженными дегенеративными изменениями тубулярного эпителия почки. Обнаруженная взаимосвязь, вероятно, обусловлена недостатком нефропротективного действия витамина D в условиях дефицита D-гормона, что приводит к опосредованному протеинурией повреждению тубулярного эпителия. Механизмы защитного действия витамина D требуют дальнейших исследований.

Авторы подтвердили отсутствие конфликта интересов, о котором необходимо сообщить.

Ограничения исследования: не определяли 1,25-(ОН)2D, мегалин, кубилин, FGF-23.