Исследование иммуногенности и протективных свойств рекомбинантной вакцины против гриппа

Читать метаданные

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ

Доклиническое изучение иммуногенности и защитных свойств противогриппозной тривалентной вакцины АдеВак-Флю на лабораторных мышах.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Вакцина АдеВак-Флю представляет собой смесь рекомбинантных аденовирусов человека пятого серотипа, экспрессирющих гены гемагглютининов вакцинных штаммов вируса гриппа A/California/07/2009(H1N1), A/Perth/16/2009(H3N2), B/Brisbane/60/2008, а также молекулярного адъюванта Иммуномакс. В качестве препарата сравнения была использована живая гриппозная вакцина Ультравак (ФГУП НПО «Микроген»). Для изучения защитных свойств вакцины мыши линии Balb/c были иммунизированы однократно интраназально и через 28 дней после иммунизации заражены летальными дозами вирусов гриппа A H1N1, H3N2 и B. Уровень вирусовыделения из легких мышей был оценен на 3-и и 6-е сутки после заражения с помощью титрования гомогенатов легких на культуре клеток MDCK. Уровень специфических антител к вирусам гриппа определяли методами непрямого ИФА, РТГА и РВН.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Было показано, что гриппозная тривалентная вакцина АдеВак-Флю^ТМ является более иммуногенной, чем препарат сравнения. Уровни защиты от гомологичных штаммов вирусов гриппа либо чуть меньше, либо сравнимы с уровнями защиты препарата сравнения. При этом показано, что АдеВак-Флю так же, как и живая гриппозная вакцина, эффективно защищает мышей от гетерологичного штамма вируса гриппа, хотя у мышей и наблюдалось вирусовыделение из легких и незначительное снижение массы тела (менее чем на 10%).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Показано, что вакцина АдеВак-Флю на основе рекомбинантных аденовирусов человека 5-го серотипа, экспрессирующих гены гемагглютинина вирусов гриппа A/California/07/2009 (H1N1), A/Perth/16/2009 (H3N2), B/Brisbane/60/2008, обладает иммуногенностью и защитными свойствами по отношению как к гомологичным, так и гетерологичным (в пределах субтипа) штаммам вируса гриппа.

Ключевые слова:

Авторы:

Седова Е.С.

ФГБУ «Федеральный научно-исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии им. почетного акад. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России

Степанова Л.А.

ФГБУ «Научно-исследовательский институт гриппа им. А.А. Смородинцева» Минздрава России

Лысенко А.А.

Щербинин Д.Н.

Верховская Л.В.

Цыбалова Л.М.

ФГБУ «Научно-исследовательский институт гриппа им. А.А. Смородинцева» Минздрава России

Шмаров М.М.

ФГБУ «Федеральный научно-исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии им. почетного акад. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России;
ООО «НТФАРМА»

Дата поступления:

27.09.2019

Дата принятия в печать:

20.10.2019

Список литературы:

Paules C, Subbarao K. Influenza. Lancet. 2017;390:697-708. https://doi.org/10.1016/S0140-6736(17)30129-0
Zhang Y, Xu C, Zhang H, Liu GD, Xue C, Cao Y. Targeting Hemagglutinin: Approaches for Broad Protection against the Influenza A Virus. Viruses. 2019;11(5):E405. https://doi.org/10.3390/v11050405
Седова Е.С., Щербинин Д.Н., Мигунов А.И., Смирнов Ю.А., Логунов Д.Ю., Шмаров М.М., и др. Гриппозные рекомбинантные вакцины. Acta Naturae. 2012;4(4(15)):17-27.
Tompkins SM, Lin Y, Leser GP, Kramer KA, Haas DL, Howerth EW, et al. Recombinant parainfluenza virus 5 (PIV5) expressing the influenza A virus hemagglutinin provides immunity in mice to influenza A virus challenge. Virology. 2007;362:139-150. https://doi.org/10.1016/j.virol.2006.12.005
Ertl HC. Viral vectors as vaccine carriers. Curr Opin Virol. 2016;21:1-8. https://doi.org/10.1016/j.coviro.2016.06.001
Hoelscher MA, Singh N, Garg S, Jayashankar L, Veguilla V, Pandey A, et al. A broadly protective vaccine against globally dispersed clade 1 and clade 2 H5N1 influenza viruses. Infect Dis. 2008;197(8):1185-1188. https://doi.org/10.1086/529522
Melidou A, Gioula G, Exindari M, Chatzidimitriou D, Diza-Mataftsi E. Influenza A(H5N1): an overview of the current situation. Eurosurveillance. 2009;14(20). https://doi.org/10.2807/ese.14.20.19216-en
Throsby M, van den Brink E, Jongeneelen M, Poon LL, Alard P, Cornelissen L, et al. Heterosubtypic neutralizing monoclonal antibodies cross-protective against H5N1 and H1N1 recovered from human IgM+ memory B cells. PLoS One. 2008;3(12):e3942. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0003942
Шмаров М.М., Седова Е.С., Верховская Л.В., Руднева И.А., Богачева Е.А., Барыкова Ю.А., и др. Индукция протективного гетеросубтипического иммунного ответа против вируса гриппа при иммунизации рекомбинантными аденовирусными векторами, экспрессирующими гемагглютинин вируса гриппа H5. Acta Naturae. 2010:2(1(4)):119-126.
Атауллаханов Р.И., Пичугин А.В., Шишкова Н.М., Мастернак Т.Б., Малкина Е.Ю., Ульянова Л.И. и др. Клеточные механизмы иммуномодулирующего действия препарата Иммуномакс. Иммунология. 2005;26(2):111-120.
Багаев А.В., Пичугин А.В., Лебедева Е.С., Лысенко А.А., Шмаров М.М., Логунов Д.Ю. и др. Регуляция экспрессии целевого белка (трансгена) в составе ДНК аденовирусного вектора с помощью агонистов toll-подобных рецепторов. Acta Naturae. 2014;6(4(23)):29-42.
Багаев А.В., Пичугин А.В., Лебедева Е.С., Лысенко А.А., Шмаров М.М., Логунов Д.Ю. и др. ВлияниеTLR-агонистов на экспрессию в антигенпрезентирующих клетках целевого белка-антигена, закодированного в аденовирусном векторе. Иммунология. 2015;36(4):188-195.
Методические указания 3.3.2.1758—03 «Методы определения показателей качества иммунобиологических препаратов для профилактики и диагностики гриппа». М. 2003.
Методические рекомендации «Выявление антител к вирусам гриппа А(Н5N1) в сыворотках людей и животных при естественной инфекции и вакцинальном процессе в реакции микронейтрализации». М. 2009.
Степанова Л.А., Сергеева М.В., Шуклина М.А., Шалджян А.А., Потапчук М.В., Коротков А.В., и др. Гибридный белок на основе второй субъединицы гемагглютинина вирусов гриппа A/H2N2 формирует перекрестный иммунитет. Acta Naturae. 2016;8(2):129-140.
Tutykhina IL, Sedova ES, Gribova IY, Ivanova TI, Vasilev LA, Rutovskaya MV. Passive immunization with a recombinant adenovirus expressing an HA (H5)-specific single-domain antibody protects mice from lethal influenza infection. Antiviral Res. 2013;97:318-328. https://doi.org/10.1016/j.antiviral.2012.12.021

Закрыть метаданные

Грипп — высококонтагиозное заболевание, возбудителями которого являются РНК-содержащие вирусы, относящиеся к семейству Orthomyxoviridae. Ежегодные эпидемии вызывают вирусы гриппа, относящиеся к группам А и В, причем среди людей в настоящее время циркулируют вирусы гриппа А субтипов H1N1 и H3N2 [1]. Главным методом профилактики гриппа является вакцинация. Показано, что основным антигеном вируса гриппа, вызывающим формирование нейтрализующих антител, является гемагглютинин. Профилактический эффект современных вакцин основан главным образом на выработке протективных антител именно к этому поверхностному антигену [2]. Однако современные противогриппозные вакцины являются штамм-специфичными. Благодаря антигенному дрейфу состав циркулирующих среди населения вирусов гриппа постоянно меняется, что обусловливает необходимость ежегодного обновления штаммового состава противогриппозных вакцин [3].

Одной из возможных стратегий, позволяющих расширить спектр действия противогриппозных вакцин, является так называемая генетическая вакцинация. Генетические вакцины обеспечивают попадание генетического материала инфекционного агента в клетки хозяина и экспрессию в них генов белков патогена. В результате белки патогена распознаются иммунной системой, что приводит к индукции как гуморального, так и клеточного иммунного ответа. При этом структура целевых антигенов максимально близка к их нативной структуре и позволяет добиться более широкого иммунного ответа [4]. Одним из наиболее популярных направлений в создании генетических вакцин являются вакцины на основе аденовирусов человека пятого серотипа (Ад5) [5]. Показано, что генетические вакцины на основе аденовирусов, несущие ген гемагглютинина вируса гриппа А, способны индуцировать перекрестный иммунитет как в пределах одного субтипа вируса гриппа А [6], так и между разными субтипами [7]. Ранее нами было показано, что иммунизация лабораторных мышей рекомбинантным аденовирусом (рАд5), несущим ген гемагглютинина вируса гриппа H5N2, обеспечивает индукцию протективного иммунного ответа как против вируса гриппа субтипа H5N1, так и против вируса гриппа субтипа H1N1, относящегося к той же филогенетической группе [8], но не обеспечивает защиту мышей против вируса гриппа субтипа H3N2, относящегося к другой группе [9]. Таким образом, создание кандидатных вакцин на основе рАд5, экспрессирующих гемагглютинины вирусов гриппа A и B, может позволить добиться более широкого иммунного ответа и уйти от необходимости ежегодной ревакцинации населения. Кроме того, такие вакцины позволяют отказаться от работы непосредственно с патогеном при производстве, а также включить в программу по вакцинации людей, страдающих аллергией на белки куриных яиц и не имеющих возможности вакцинироваться препаратами, в состав которых входят вирусы гриппа (или их компоненты), накопленные в куриных эмбрионах.

Цель исследования — доклиническое изучение иммуногенности и протективных свойств противогриппозной тривалентной вакцины АдеВак-Флю на лабораторных животных. Вакцина АдеВак-Флю представляет собой смесь рАд5, экспрессирующих гены гемагглютининов вакцинных штаммов вируса гриппа A/California/07/2009(H1N1), A/Perth/16/2009(H3N2), B/Brisbane/60/2008, а также молекулярный адъювант Иммуномакс, позволяющий существенно увеличить уровень экспрессии трансгена аденовирусным вектором [10—12].

Материал и методы

Генноинженерная кандидатная гриппозная вакцина АдеВак-Флю. Вакцина представляет собой смесь рАд5, экспрессирующих гены гемагглютинина вакцинных штаммов вирусов гриппа: A/California/07/2009(H1N1), A/Perth/16/2009(H3N2), B/Brisbane/60/2008 с активностью 2·10⁷БОЕ/мл каждого штамма на 1 прививочную дозу (в 0,5 мл) с добавлением в качестве молекулярного адъюванта Иммуномакса в количестве 100 ЕД и стабилизирующего буфера. РАд5 были получены как описано ранее [9]. Вакцина произведена ООО «Иммафарма», Россия по заказу ООО «НТФарма», Россия.

Препарат сравнения. В качестве препарата сравнения была выбрана коммерческая живая гриппозная вакцина (ЖГВ) Ультравак производства ФГУП НПО «Микроген». ЖГВ является лиофилизатом для приготовления раствора для интраназального введения, одна ампула (0,5 мл) содержит 1 дозу вакцины. В одной прививочной дозе содержатся реассортантные вирусы гриппа A/California/07/2009(H1N1), A/Perth/16/2009(H3N2) — 10^6,⁹ ЭИД₅₀ и B/Brisbane/60/2008 —10^6,⁴ ЭИД₅₀.

Животные. В работе использовали мышей линии Balb/c (самки), массой 16—18 г, полученных из питомника «Столбовая» ГУ научный центр биомедицинских технологий РАМН. Животных содержали в виварии ФГБУ «НИИ гриппа им. А.А. Смородинцева» Минздрава России в соответствии с действующими правилами.

Иммунизация. Были сформированы три группы животных по 40 особей. Мышам 1-й группы вводили вакцину АдеВак-Флю интраназально дискретно с интервалами 15 мин в общем объеме 0,5 мл (одна доза). Мышей 2-й опытной группы иммунизировали ЖГВ интраназально одной дозой человека, разбитой на 2 введения с интервалом 2 нед. Контрольная группа мышей получила интраназально PBS (фосфатно-солевой буфер, pH 7,2) в объеме 100 мкл.

На 28-е сутки после иммунизации у части мышей в каждой группе отбирали кровь, бронхоальвеолярные лаважи и назальные смывы. Оставшихся мышей заражали вирусами гриппа A и B.

Получение сывороток. Образцы крови получали от 5 мышей каждой группы на 28-й день после иммунизации. Для получения сыворотки кровь инкубировали в течение 30 мин при 37 °C. После образования сгустков крови образцы центрифугировали в течение 15 мин при 400 g, аликвотировали и замораживали при температуре –20 °C.

Получение назальных смывов и бронхоальвеолярных лаважей (БАЛ). Назальные смывы и БАЛ получали от 5 мышей каждой группы на 28-й день после иммунизации после умерщвления животных в атмосфере углекислого газа. Труп животного фиксировали на операционном столике брюшком кверху. Производили разрез кожи по средней линии от нижней челюсти. В верхнюю часть трахеи при помощи зонда вводили 1 мл PBS (pH 7,2) и собирали жидкость через носовые ходы. Промывание проводили 2—3 раза. В нижнюю часть трахеи в направлении легких вводили катетер на глубину 3—5 мм. Дважды промывали бронхи и легкие 1 мл PBS (pH 7,2). Смывы и БАЛ центрифугировали 15 мин при 400 g, аликвотировали и замораживали при температуре –20 °C.

Реакция торможения гемагглютинации (РТГА). Для оценки иммуногенности вакцины АдеВак-Флю в РТГА использовали вирусы гриппа A/California/07/2009(H1N1), A/Perth/16/2009(H3N2), B/Brisbane/60/2008. РТГА проводили согласно М.У. 3.3.2.175803 [13].

Реакция вируснейтрализации (РВН). Для проведения РВН использовали вирусы гриппа A/California/07/2009(H1N1), A/Perth/16/2009(H3N2), B/Brisbane/60/2008. Реакцию проводили на клеточной культуре MDCK. Реакцию нейтрализации ставили в соответствии с М.У. [14].

Иммуноферментный анализ (ИФА). ИФА проводили общепринятым методом [15, 16], в качестве антигенов использовали очищенные гемагглютинины вирусов гриппа A/California/07/2009(H1N1), B/Brisbane/60/2008, A/Perth/16/2009(H3N2). К сорбированным на планшете антигенам добавляли исследуемые сыворотки, БАЛ или назальные смывы. После отмывки в лунки планшета добавляли антитела к Ig мыши, конъюгированные с пероксидазой хрена. В качестве субстрата использовали тетраметилбензидин (ТМБ). Учет реакции проводили при длине волны 450 нм. За титр принимали наибольшее разведение сыворотки, которое дает оптическую плотность, по крайней мере, в 2 раза больше, чем образец от неиммунизированных мышей в том же разведении.

Вирусы и заражение мышей. Через 28 дней после иммунизации мыши были заражены следующими вирусами: A/California/07/2009(H1N1) — 15 мышей, B/Brisbane/60/2008 — 5 и A/Aichi/2/68(H3N2) — 15. Вирусы вводили интраназально под легким эфирным наркозом в объеме 50 мкл/мышь в дозе 10ЛД₅₀ для вирусов A/California/07/2009(H1N1) и A/Aichi/2/68(H3N2) и 3,5 lgМИД (мышиная инфекционная доза) для B/Brisbane/60/2008. Наблюдение за животными осуществляли в течение 14 дней.

Вирусовыделение из легких мышей. Легкие 5 мышей из каждой группы, извлеченные на 4-е сутки после заражения, гомогенизировали в 10-кратном объеме стерильного PBS и готовили из гомогенатов серию 10-кратных разведений на том же буфере. При определении титра вируса гриппа использовали культуру клеток MDCK, выращенных на 96 луночных планшетах на среде МЕМ. Клетки заражали серийными 10-кратными разведениями легочного гомогената от 10 до 10^–7 и инкубировали в термостате в течение 72 ч. По окончании срока инкубации культуральную жидкость переносили в лунки планшета для иммунологических реакций, после чего добавляли равный объем 1% куриных эритроцитов в физиологическом растворе. Уровень репродукции вируса в лунках панели оценивали по реакции гемагглютинации (РГА) эритроцитов. Инфекционную активность вируса рассчитывали по методу Рида и Менча и выражали в lgТЦД₅₀.

Статистическая обработка данных

Статистическую значимость различий титров специфических антител в сыворотках, назальных смывах и БАЛ оценивали с использованием U-критерия Манна—Уитни. Динамика изменения массы тела оценивалась с использованием программы GraphPadPrismv. Сравнение показателей выживаемости в различных группах мышей — с использованием тестов Mantel—Cox (log-rank) и Gehan—Breslow—Wilcoxon.

Результаты и обсуждение

Иммуногенность кандидатной гриппозной вакцины АдеВак-Флю. Для оценки иммуногенности вакцины в сыворотках крови иммунизированных животных на 28-й день после иммунизации определяли титры специфических антител изотипа IgG в ИФА, титры гемагглютинирующих антител в РТГА и титры нейтрализующих антител в РВН к штаммам вирусов гриппа A/California/07/09(H1N1), A/Perth/16/2009(H3N2) и B/Brisbane/60/2008. В назальных смывах и БАЛ определяли содержание специфических секреторных IgA к тем же штаммам.

На 28-е сутки после иммунизации АдеВак-Флю и ЖГВ средние геометрические титры (СГТ) специфических антител IgG, полученных в ИФА, к гемагглютинину вируса гриппа H1N1 составили 409 600,00±112 177,00 и 137 384,00±61 441,86 соответственно. Достоверных различий в уровнях IgG между иммунизированными группами выявлено не было (p>0,05). СГТ сывороточных IgG к гемагглютинину вируса гриппа A/Perth/16/2009(H3N2) у мышей, иммунизированных АдеВак-Флю, был достоверно выше (p<0,01), чем у мышей, получавших ЖГВ, и составил 1 060 960,00±243 435,20 и 19 200,00±10 772,82. СГТ IgG к гемагглютинину вируса гриппа B/Brisbane/60/2008 составили 143 360,00±25 083,54 для группы АдеВак-Флю и 19 412,16±8681,65 для группы ЖГВ (p<0,01) (табл. 1).

Таблица 1. СГТ к вирусам гриппа в сыворотках крови, БАЛ и назальных смывах мышей, выявленные с помощью ИФА

Группа	Антиген	IgG в сыворотке	IgA
Группа	Антиген	IgG в сыворотке	в назальных смывах	в БАЛ
АдеВак-Флю	A/California/07/2009 (H1N1)	409 600,00±112 177,00	34,00±13,23	2336,00±1032,47*
	A/Perth/16/2009 (H3N2)	1 060 960,00±243 435,20*	122,40±55,36*	3072,00±591,21*
	B/Brisbane/60/2008	143 360,00±25 083,54*	24,40±11,11	576,00±161,07*
ЖГВ	A/California/07/2009 (H1N1)	137 384,00±61 441,86	4,00±1,09	72,00±24,53
	A/Perth/16/2009 (H3N2)	19 200,00±10 772,82	5,20±1,19	34,40±13,00
	B/Brisbane/60/2008	19 412,16±8681,65	4,00±1,09	65,60±18,99

Примечание. Здесь и в табл. 2—4: * — различия между группами достоверны, p<0,05.

В РТГА выявлено, что средний СГТ гемагглютинирующих антител к вирусу гриппа H1N1 на 28-е сутки у мышей, получивших АдеВак-Флю, составил 900,0 по сравнению с 20,0 у мышей, иммунизированных ЖГВ (p<0,01). В РВН показано, что к 28-му дню наблюдения выявлялся высокий уровень нейтрализующих вирус гриппа H1N1 антител, и СГТ в группе АдеВак-Флю составил 735,2, что достоверно выше (p<0,01), чем у мышей, иммунизированных ЖГВ (СГТ=30,3). Данные представлены в табл. 2.

Таблица 2. Тиры антител к вирусу гриппа A/California/07/2009 (H1N1) в сыворотках крови мышей, выявленные с помощью РТГА и РВН

Группа	№ мыши	Антиген	Титры антител
Группа	№ мыши	Антиген	в РТГА	в РВН
АдеВак-Флю	1	A/California/07/2009 (H1N1)	640	640
	2		640	640
	3		640	640
	4		640	640
	5		1280	1280
СГТ			900,0*	735,2*
ЖГВ	1		40	40
	2		80	80
	3		40	40
	4		20	20
	5		<20	<20
СГТ			20,0	30,3
Контроль			<8	<8

В табл. 3 представлены результаты по определению гемагглютинирующих и нейтрализующих антител к вирусу гриппа H3N2. СГТ в РТГА для мышей группы АдеВак-Флю составил 1689,00, а у мышей, получавших ЖГВ, СГТ составил 22. В РВН показано, что уровень нейтрализующих антител к вирусу гриппа H3N2 у мышей, получавших АдеВак-Флю, составил 696,4 и был достоверно выше (p<0,01), чем у мышей, получавших ЖГВ, — 60,6.

Таблица 3. Титры антител к вирусу гриппа A/Perth/16/2009(H3N2) в сыворотках крови мышей, выявленные с помощью РТГА и РВН

Группа	№ мыши	Антиген	Титры антител
Группа	№ мыши	Антиген	в РТГА	в РВН
АдеВак-Флю	1	A/Perth/16/2009 (H3N2)	640	400
	2		1280	800
	3		1280	400
	4		2560	800
	5		5120	1600
СГТ			1689,0*	696,4*
ЖГВ	1		20	40
	2		40	40
	3		20	80
	4		20	80
	5		<20	80
СГТ			22	60,6
Контроль			<10	<8

В табл. 4 представлены результаты РТГА и РВН сывороток крови мышей с вирусом гриппа B/Brisbane/60/2008. Выявлено, что к 28-му дню у мышей группы АдеВак-Флю СГТ в РТГА составил 40,0, что значительно выше, чем у мышей, получавших ЖГВ, у которых титр в РТГА практически не отличался от контроля. В РВН выявлена достоверная разница в содержании нейтрализующих антител у мышей, получавших АдеВак-Флю и ЖГВ (p<0,05). СГТ для группы АдеВак-Флю составил 95,1, что было более чем в 3 раза выше, чем у группы ЖГВ (СГТ=26,4).

Таблица 4. Титры антител к вирусу гриппа B/Brisbane/60/2008 в сыворотках крови мышей, полученные с помощью РТГА и РВН

Группа	№ мыши	Антиген	Титры антител
Группа	№ мыши	Антиген	в РТГА	в РВН
АдеВак-Флю	1	B/Brisbane/60/2008	<20	80
	2		80	80
	3		160	80
	4		<20	160
	5		80	—
СГТ			40,0	95,1*
ЖГВ	1		20	20
	2		<20	20
	3		<20	20
	4		<20	40
	5		<20	40
СГТ			<20	26,4
Контроль			<10	<8

Содержание секреторного IgA к вирусам гриппа А/H1N1, А/H3N2 и В в назальных смывах и БАЛ иммунизированных животных представлено в табл. 1. К 28-м суткам уровень секреторного IgA у мышей, иммунизированных вакциной АдеВак-Флю^ТМ, к вирусу H1N1 был достоверно выше, чем у мышей, получавших ЖГВ: 34,00±13,23 и 4,00±1,09 (p=0,05) для назальных смывов и 2336,00±1032,47 и 72,00±24,53 (p<0,05) для БАЛ соответственно.

Содержание IgA к вирусу H3N2 в назальных смывах мышей группы АдеВак-Флю также было достоверно выше, чем в группе ЖГВ (122,40±55,36 и 5,20±1,19 соответственно, p<0,05). Уровень IgA в БАЛ мышей, получавших АдеВак-Флю, был достоверно выше, чем у мышей, иммунизированных ЖГВ, и составил 3072,00±591,21 и 34,40±13,00 (p=0,01) соответственно.

Содержание IgA к вирусу гриппа B в назальных смывах мышей, иммунизированных АдеВак-Флю, было в 6 раз выше, чем у мышей, получавших ЖГВ, и составило в среднем 24,40±11,11 и 4,00±1,09 соответственно (p=0,05). Уровень секреторных IgA в БАЛ у группы АдеВак-Флю был достоверно выше, чем у группы ЖГВ. СГТ составил 576,00±161,07 и 65,60±18,99 соответственно (p<0,01).

Протективность гриппозной вакцины АдеВак-Флю

Динамика изменения массы тела и гибели мышей после заражения вирусом гриппа A/California/07/09 (H1N1) в дозе 10 ЛД₅₀представлена на рис. 1. Различия в выживаемости между мышами, получавшими АдеВак-Флю и ЖГВ, были статистически незначимыми, не было значительной потери массы тела после заражения животных. В контроле падение массы тела достигало 40%. Протективность в группе мышей, иммунизированных АдеВак-Флю, составила 80%, а в группе, получавшей ЖГВ, — 90%. Результаты определения инфекционного титра вируса гриппа A/California/07/09 (H1N1) в легочной ткани мышей на 4-е сутки после заражения представлены в табл. 5. Из табл. 5 видно, что у мышей, иммунизированных АдеВак-Флю и ЖГВ, не происходит выделения вируса из легких в отличие от контроля, где содержание вируса составило больше 8,5 lgТЦД₅₀.

Рис. 1. Анализ протективности иммунного ответа мышей, иммунизированных вакциной АдеВак-Флю или ЖГВ, с последующим заражением летальной дозой вируса гриппа A/California/07/2009(H1N1).

а — выживаемость мышей, зараженных летальной дозой (10 ЛД₅₀) вируса гриппа A/California/07/2009(H1N1). Мыши были однократно интраназально иммунизированы АдеВак-Флю и ЖГВ. В качестве контроля использовали мышей, иммунизированных фосфатным буфером PBS. По оси ординат — % выживших животных, по оси абсцисс — дни с момента заражения. Различия между выживаемостью в группах АдеВак-Флю, ЖГВ и контрольной группой PBS являются статистически достоверными (p<0,05); б — изменение массы тела мышей, зараженных летальной дозой (10 ЛД₅₀) вируса гриппа штамма A/California/07/2009(H1N1). По оси ординат — изменение массы тела животных в %, по оси абсцисс — дни с момента заражения.

Таблица 5. Вирусовыделение из легких мышей на 4-е сутки после заражения вирусом гриппа A/California/07/09 (H1N1) в дозе 10ЛД₅₀

Группа	Доза заражения вирусом гриппа A/California/07/09 (H1N1), ЛД₅₀	Репродукция в легких, lgТЦД₅₀
АдеВак-Флю^ТМ	10	≤0,5*
ЖГВ	10	≤0,5*
Контроль	10	≥8,5

Примечание. Здесь и в табл 6 и 7: * — достоверное отличие от контрольной группы (p<0,01).

Высокий уровень ингибиторчувствительности вируса гриппа A/Perth/16/2009 (H3N2) не позволил использовать его для оценки протективности, поэтому заражение проводилось вирусом гриппа A/Aichi/2/68(H3N2) в дозе 10 ЛД₅₀(гетерологичное заражение). Динамика изменения массы тела и гибели мышей опытных и контрольной групп после заражения вирусом гриппа A/Aichi/2/68/ (H3N2) представлена на рис. 2. Различия в выживаемости между группами АдеВак-Флю и ЖГВ были статистически незначимы. Не было значительной потери массы тела, тогда как в контроле падение массы тела достигало 30% от исходной. Протективность в группе мышей, иммунизированных АдеВак-Флю, составила 90%, а в группе, получавшей ЖГВ, — 100%.

Рис. 2. Анализ протективности иммунного ответа мышей, иммунизированных вакциной АдеВак-Флю и ЖГВ, с последующим заражением летальной дозой вируса гриппа А/Aichi/2/68(H3N2).

а — выживаемость мышей, зараженных летальной дозой (10 ЛД₅₀) вируса гриппа А/Aichi/2/68(H3N2). Мыши были однократно интраназально иммунизированы АдеВак-Флю и ЖГВ. В качестве контроля использовали мышей, иммунизированных фосфатным буфером PBS. По оси ординат — % выживших животных, по оси абсцисс — дни с момента заражения. Различия между выживаемостью в группах АдеВак-Флю, ЖГВ и контрольной группой PBS являются статистически достоверными (p<0,05); б — изменение массы тела мышей, зараженных летальной дозой (10 ЛД₅₀) вируса гриппа штамма А/Aichi/2/68(H3N2). По оси ординат — изменение массы тела животных в %, по оси абсцисс — дни с момента заражения.

Определение уровня вируса гриппа в легких мышей на 4-е сутки после заражения показало (табл. 6), что в легких мышей обеих групп наблюдается выделение вируса, но оно было достоверно ниже (p<0,01), чем в контроле.

Таблица 6. Вирусовыделение из легких мышей на 4-е сутки после заражения вирусом гриппа A/Aichi/2/68(H3N2) в дозе 10 ЛД₅₀

Группа	Доза заражения вирусом гриппа A/Aichi/2/68(H3N2), ЛД₅₀	Репродукция в легких, lgТЦД₅₀
АдеВак-Флю	10	5,95±1,44*
ЖГВ	10	4,15±1,33*
Контроль	10	8,2±0,4

Вирус гриппа B/Brisbane/60/2008 вводили животным в дозе 2,5 lgМИД, поскольку он не был летальным для мышей. Поэтому различия в динамике изменения массы тела и гибели мышей опытных и контрольной групп не являлись значимыми и информативными. Различий в состоянии животных в группах АдеВак-Флю и ЖГВ выявлено не было (данные не представлены).

Основным показателем протективного действия в случае вируса B/Brisbane/60/2008 являлось вирусовыделение из легких мышей. Вирус гриппа не был выделен из легких ни у одной мыши, ни в группе ЖГВ, ни в группе АдеВак-Флю (табл. 7). При этом средний титр вируса в контрольной группе составил 2,6 lgТЦД₅₀. Различия между опытными и контрольной группами были достоверными (p<0,01).

Таблица 7. Вирусовыделение из легких на 4-е сутки после заражения вирусом гриппа B/Brisbane/60/2008 в дозе 2,5 lgМИД

Группа	Доза заражения вирусом гриппа B/Brisbane/60/2008, lgМИД	Репродукция в легких, lgТЦД₅₀
АдеВак-Флю	2,5	≤0,5*
ЖГВ	2,5	≤0,5*
Контроль	2,5	2,6±1,02

Заключение

Иммуногенность и защитные свойства гриппозной тривалентной вакцины АдеВак-Флю на основе рАд5, экспрессирующих гены гемагглютининов вирусов гриппа A/California/07/2009(H1N1), A/Perth/16/2009(H3N2), B/Brisbane/60/2008, изучены при однократном интраназальном введении мышам линии Balb/c. В качестве препарата сравнения использовали коммерческую ЖГВ Ультравак (ФГУП «НПО "Микроген"»). Результаты изучения иммуногенности показали, что однократная иммунизация гриппозной вакциной АдеВак-Флю приводит к формированию выраженного специфического гуморального (в том числе местного) иммунитета с образованием высоких титров гемагглютинирующих и нейтрализующих антител. При этом иммуногенность гриппозной вакцины АдеВак-Флю была значительно выше, чем иммуногенность препарата сравнения. Титры IgG к вирусу гриппа A/California/07/2009(H1N1) в сыворотке крови после иммунизации мышей АдеВак-Флю были более чем в 2 раза выше, чем после иммунизации ЖГВ. Содержание гемагглютинирующих и нейтрализующих антител было в 5—7 раз выше, чем у мышей, получавших ЖГВ. Разница в уровнях секреторных IgA в назальных смывах и БАЛ между этими группами была соответственно в 32 и 8,5 раза больше. Различия в иммуногенности гриппозной вакцины АдеВак-Флю^ТМ и ЖГВ к вирусу гриппа A/Perth/16/2009(H3N2) были еще более выражены. Уровни специфических IgG в сыворотке крови у мышей, получивших гриппозную вакцину АдеВак-Флю, были в 55 раз выше, чем у мышей, иммунизированных ЖГВ. Титры гемагглютинирующих и нейтрализующих антител в группе АдеВак-Флю в 10—100 раз выше, чем в группе ЖГВ. Титры секреторных IgA в назальных смывах и БАЛ между группами различаются в 90 и 25 раз соответственно. К вирусу гриппа B/Brisbane/60/2008 титры IgG в сыворотке крови в 7 раз выше у мышей, иммунизированных АдеВак-Флю, чем ЖГВ. А по отношению к IgA в назальных смывах и БАЛ эта разница составляет 9 и 8 раз. Следует отметить, что иммуногенность разных компонентов в составе гриппозной вакцины АдеВак-Флю существенно различается. Наибольшей иммуногенностью в составе гриппозной вакцины АдеВак-Флю обладали Ад5, экспрессирующие ген гемагглютинина A/Perth/16/2009(H3N2), наименьшей — ген гемагглютинина B/Brisbane/60/2008.

Для оценки протективности гриппозной вакцины АдеВак-Флю на 28-е сутки после начала опыта мышей заражали гомологичными вирусами гриппа A/California/07/2009(H1N1) (в дозе 10 ЛД₅₀) и B/Brisbane/60/2008 (в дозе 2,5 lgМИД). Для оценки защиты от вируса гриппа H3N2 проводилось заражение иммунизированных мышей антигенно отличающимся вариантом A/Aichi/2/68(H3N2) в дозе 10 ЛД₅₀(гетерологичное заражение). Следует отметить, что вирус гриппа A/Aichi/2/ 68/(H3N2) имеет только 86,1% гомологии с вирусом гриппа A/Perth/16/2009(H3N2). При этом 19 значимых аминокислотных замен приходятся на антигенные сайты в составе гемагглютинина.

Протективность АдеВак-Флю против вируса гриппа A/California/07/2009(H1N1) составила 80%, тогда как ЖГВ — 90%. Динамика изменения массы тела животных опытных групп была практически одинаковой, не было значительной потери массы тела после заражения в отличие от контроля. Как в группе АдеВак-Флю, так и в группе ЖГВ не наблюдалось выделения вируса из легких.

Протективность АдеВак-Флю к вирусу гриппа B/Brisbane/60/2008 не удалось показать на модели летальной гриппозной инфекции. Основным показателем считалось вирусовыделение из легких мышей. Показано, что заражающий вирус не был выделен из легких ни у одной мыши ни в группе ЖГВ, ни в группе АдеВак-Флю.

После заражения иммунизированных мышей гетерологичным штаммом вируса гриппа A/Aichi/2/68(H3N2) обе вакцины показали хорошую протективность (90—100%), несмотря на то, что в обеих опытных группах гетерологичный вирус выделялся из легких мышей на 4-е сутки после заражения, но в значительно меньших титрах, чем у мышей контрольных групп.

Таким образом, гриппозная тривалентная вакцина АдеВак-Флю является более иммуногенной, чем живая гриппозная вакцина. Уровни защиты от гомологичных штаммов вирусов гриппа были сопоставимы с уровнями защиты при иммунизации ЖГВ. При этом показано, что АдеВак-Флю так же, как и ЖГВ, эффективно защищает мышей от гетерологичного штамма вируса гриппа, хотя у мышей и наблюдалось вырусовыделение из легких и незначительное снижение массы тела (менее чем на 10%).

Итак, можно сделать вывод, что вакцина АдеВак-Флю на основе рекомбинантных аденовирусов человека 5-го серотипа, экспрессирующих гены гемагглютинина вирусов гриппа A/California/07/2009(H1N1), A/Perth/16/2009(H3N2), B/Brisbane/60/2008, обладает высокой иммуногенностью и протективными свойствами по отношению как к гомологичным, так и к гетерологичным (в пределах субтипа) штаммам вируса гриппа.

Информация о соблюдении стандартов работы с животными. Содержание лабораторных животных происходило согласно ГОСТ 33216-2014 «Руководство по содержанию и уходу за лабораторными животными. Правила содержания и ухода за лабораторными грызунами и кроликами».

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflicts of interest.