Введение
Рак молочной железы (РМЖ) — это наиболее частое злокачественное новообразование у женщин. В России в 2021 г. распространенность РМЖ была зафиксирована на уровне 509,2 на 1000 тыс. населения [1]. В возникновении и прогрессировании РМЖ важную роль играет фактор некроза опухоли (TNF, TNF-α), который является ключевым в первичном и адаптивном иммунном ответе и одним из основных провоспалительных цитокинов, секретируемых клетками крови, стромальными клетками опухолевой ткани, самими опухолевыми клетками [2]. При этом концентрации TNF в сыворотке крови (sTNF), как и в опухолевой ткани, коррелируют с клиническим статусом [3—5].
Ген TNF расположен на коротком плече 6 хромосомы в области генов комплекса гистосовместимости HLA III класса и имеет ряд полиморфизмов, влияющих на уровень его экспрессии. Наиболее изученным является однонуклеотидная замена -308(G/A)TNF (rs1800629), ассоциированная с повышенным уровнем экспрессии цитокина. Полиморфизм гена TNF ассоциирован с широким спектром заболеваний, в том числе с аутоиммунными и онкологическими. Аллель -308A гена TNF входит в ряд наследственных гаплотипов (Ancestral haplotype, AH), которые представляют собой консервативные последовательности большой протяженности, захватывающие все области генов HLA I, II и III классов, передающиеся без изменений на протяжении сотен поколений [6]. Наследственные гаплотипы обладают восприимчивостью или устойчивостью к различным заболеваниям. Один из наиболее известных — гаплотип AH8.1 (HLA-A1-B8-DR3), связанный с аутоиммунными заболеваниями и ассоциированный с повышенным уровнем sTNF [7, 8].
Ранее, при изучении ассоциации маркерных аллелей AH8.1 с общей выживаемостью больных РМЖ, нами было показано двухкратное снижение общей выживаемости для носителей аллеля -308A гена TNF вне аутоиммунного гаплотипа AH8.1 [9].
Цель настоящего исследования — оценка влияния наследственного гаплотипа AH8.1 на уровень sTNF и клинико-морфологические характеристики больных РМЖ — носителей полиморфизма -308(G/A)TNF.
Материал и методы
В исследование включено 100 больных РМЖ, проходивших адъювантную лучевую терапию (АДЛТ) в режиме РОД 2Гр до СОД 50Гр в отделении радиотерапии ФМБЦ имени А. И. Бурназяна ФМБА России в 2021—2022 гг. Средний возраст женщин составил 57,4 года (от 28 до 87 лет). До начала исследования от каждого из участников было получено информированное добровольное согласие в соответствии с этическими стандартами нашего центра и национального комитета по исследовательской этике. Данные о клинико-морфологических характеристиках заболевания получали из медицинской карты пациента.
Образцы венозной крови получали «до» проведения АДЛТ (на 1-й неделе) и «после» (на 5-й неделе) курса АДЛТ. Из лейкоцитов венозной крови выделяли геномную ДНК (QIAamp DNA Mini Kit, QIAGEN, Нидерланды). Аллели -308(G/A)TNF (rs1800629) и маркерные аллели гаплотипа AH8.1 (HLA-A*01, HLA-B*08 и HLA-DRB1*03) определяли методом аллель-специфической ПЦР, как описано ранее [9]. Дополнительно в ходе работы маркерные аллели гаплотипа AH8.1 были определены в 30 архивных образцах ДНК от больных РМЖ — носителей аллеля -308(A)TNF с известным уровнем sTNF из ранее описанной выборки [10].
Концентрацию sTNF в сыворотках крови определяли наборами Human TNFa ELISA Kit по протоколу производителя (BD Biosciences, США). Сыворотки крови до проведения ИФА хранили при –20 °C. Для анализа уровня sTNF было доступно 42 образца сыворотки крови носителей генотипа -308GG гена TNF, и 18 — носителей аллеля -308А.
При статистическом анализе группы сравнивали двухсторонним критерием Фишера. Для проверки согласия распределения генотипов -308(G/A)TNF с распределением, равновесным по Харди—Вайнбергу, использовали критерий Пирсона. Распределение AH8.1 определяли прямым подсчетом, «полным гаплотипом» AH8.1 (обозначено в тексте как AH8.1+) в данном исследовании считали наличие одновременно трех маркерных аллелей: HLA-A*01, HLA-B*08 и HLA-DRB1*03. Наличие одного или двух маркерных аллелей обозначали как M+. Средние значения sTNF представляли как Mean±SEM и сравнивали непарным t-критерием Стьюдента; при сравнении более двух групп использовали дисперсионный анализ, для поправки на множественные сравнения использовали критерий Тьюки. Для всех критериев различия считали достоверными при достижении p<0,05.
Результаты и обсуждение
В исследованной выборке среди 100 больных РМЖ 24 (24%) оказались носителями аллеля -308A гена TNF, из них одна женщина — носителем гомозиготы этого аллеля; соответственно, 76 больных РМЖ (76%) являлись носителями гомозиготы -308GG. Распределение генотипов -308(G/A)TNF соответствует теоретическому распределению по Харди—Вайнбергу (p>0,05).
Распределение маркерных аллелей наследственного гаплотипа AH8.1 представлены в табл. 1. Группа носителей аллеля -308A достоверно отличалась от носителей -308GG по частотам аллелей HLA-A*01, HLA-B*08 и HLA-DRB1*03. В исследованной выборке было выявлено 10 носителей (10%) полного гаплотипа AH8.1+, и только среди носителей -308A гена TNF (41,7%, по сравнению с 0% среди носителей -308GG, p=1.1D-07), что соответствует частоте этого гаплотипа в европейской популяции и его ассоциированности с редким аллелем -308A гена TNF [6]. Девять больных РМЖ (9%) при наличии аллеля -308A гена TNF не имели ни одного из трех маркерных аллелей AH8.1, что, по нашим данным, может быть неблагоприятным прогностическим фактором только для носителей аллеля -308A, но не -308GG [9], и именно эта группа (обозначенная как AH8.1-) является основным предметом настоящего исследования.
Таблица 1. Частоты гаплотипа AH8.1 и его маркерных аллелей HLA-A*1, HLA-B*8 и HLA-DRB1*03 у носителей полиморфизма -308(G/A)TNF
| -308(G/A)TNF | A1+ | A1– | B8+ | B8– | DR3+ | DR3- | AH8.1+ | M+1 | AH8.1– |
| -308A, n=24 (%) | 12 | 12 | 11 | 13 | 13 | 11 | 10 | 5 | 9 |
| (50,0) | (50,0) | (45,8) | (54,2) | (54,2) | (45,8) | (41,7) | (20,8) | (37,5) | |
| -308GG, n=76 (%) | 7 | 69 | 2 | 74 | 3 | 73 | 0 | 11 | 65 |
| (9,2) | (90,8) | (2,6) | (97,4) | (3,9) | (96,1) | (0,0) | (14,5) | (85,5) | |
| pF | 4.9D-05 | 1.03D-06 | 1.3D-07 | 1.1D-07 | 0,53 | 1.2D-05 | |||
Примечание. 1M+ — носители одного или двух маркерных аллелей AH8.1 (HLA-A*1, HLA-B*8, HLA-DRB1*03); AH8.1+ — носители полного гаплотипа AH8.1; AH8.1 — отрицательные по трем маркерным аллелям AH8.1.
Средние концентрации sTNF в сыворотках крови больных РМЖ были выше для носителей аллеля -308A, по сравнению с носителями -308GG, но не достигали достоверных различий ни до проведения АДЛТ (14,33±3,88 и 9,6±1,78 пкг/мл соответственно), ни после АДЛТ (11,8±4,65 и 6,8±2,18 пкг/мл соответственно).
При анализе влияния аллелей HLA-A*01, HLA-DRB1*03 и HLA-B*08 на продукцию sTNF у носителей -308A гена TNF оказалось, что средние концентрации этого цитокина у носителей каждого из маркерных аллелей AH8.1 были ниже, по сравнению с концентрациями в отсутствии этих маркеров, но не достигали достоверного уровня значимости у больных до АДЛТ (хотя концентрации sTNF отличались в 2,3—2,4 раза), при этом после проведения АДЛТ достоверно различались в 5,5—8,5 раз у носителей HLA-A*01 и HLA-DRB1*03 (p<0,05), для HLA-B*08 также была отмечена подобная тенденция (p=0,057) (табл. 2).
Таблица 2. Концентрации sTNF в сыворотках крови больных РМЖ — носителей -308A гена TNF при наличии или отсутствии маркерных аллелей гаплотипа AH8.1 (HLA-A*1, HLA-B*8 и HLA-DRB1*03)
| sTNF в сыворотках крови больных РМЖ | A1– | A1+ | B8– | B8+ | DR3– | DR3+ |
| До операции1, n=30 | 17 | 13 | 17 | 13 | 15 | 15 |
| Mean ± SEM, пкг/мл | 5,1±0,29 | 3,7±0,34 | 5,0±0,31 | 3,7±0,32 | 5,2±0,24 | 3,7±0,35 |
| p t-test | 0,0041 | 0,0062 | 0,0013 | |||
| До АДЛТ, n=17 | 6 | 11 | 8 | 9 | 7 | 10 |
| Mean ± SEM, пкг/мл | 22,6±7,16 | 9,8±4,19 | 20,3±6,02 | 9,0±4,61 | 21,8±6,73 | 9,1±4,13 |
| p t-test | 0,12 | 0,15 | 0,11 | |||
| После АДЛТ, n=18 | 7 | 11 | 8 | 10 | 7 | 11 |
| Mean ± SEM, пкг/мл | 25,6±10,06 | 3,0±1,24 | 21,6±9,48 | 3,9±1,50 | 24,7±10,35 | 3,6±1,41 |
| p t-test | 0,012 | 0,057 | 0,022 | |||
Примечание. 1Архивная выборка больных РМЖ с известным дооперационным уровнем sTNF [10].
Поскольку полученные данные находились в противоречии с представлением о повышенном уровне sTNF у носителей аутоиммунного гаплотипа AH8.1 [8], дополнительно было исследовано 30 образцов архивной ДНК первичных больных РМЖ с известными дооперационными концентрациями sTNF, описанными ранее [10]. Среднее значение sTNF для всех носителей -308A в архивной группе составило 4,47±0,25 пкг/мл. Как представлено в табл. 2, для архивной выборки еще более убедительно показано достоверно более низкие уровни sTNF в сыворотках крови больных РМЖ — носителей маркерных аллелей HLA-A*01, HLA-DRB1*03 и HLA-B*08, по сравнению с группой, у которой такие аллели не обнаружены (p<0,01).
При определении суммарного влияния гаплотипа AH8.1 на продукцию sTNF предварительный анализ показал, что носители одного или двух маркерных аллелей гаплотипа AH8.1 (см. табл. 1; рисунок, а, обозначены как группа M+) демонстрируют свойства, аналогичные носителям полного гаплотипа (группа AH8.1+), что стало основанием для объединения их в группу, обозначенную в дальнейшем как M(AH8.1)+, в противоположность AH8.1–. В качестве контроля использовали группу носителей гомозиготы распространенного аллеля -308GG гена TNF, среди доступных для исследования образцов которых все были отрицательными по маркерным аллелям AH8.1 (см. рисунок, б; табл. 3). Клинико-морфологические характеристики больных РМЖ в группах сравнения, выделенных на основании полиморфизма -308(G/A)TNF и маркерных аллелей гаплотипа AH8.1, не имели статистически достоверных отличий относительно стадии заболевания, степени злокачественности, гистологического типа и рецепторного статуса опухоли (см. табл. 3).
Динамика уровня sTNF в сыворотках крови больных РМЖ до операции (архивная группа, отмечено X), до АДЛТ и после АДЛТ (соединены стрелками) в зависимости от маркерных аллелей гаплотипа AH8.1.
Уровни sTNF в сыворотках крови больных РМЖ до операции (архивная группа) обозначены X. Уровня sTNF до АДЛТ и после АДЛТ обозначены • и соединены стрелками. Уровни значимости p указаны для непарного t-test, при множественных сравнениях с поправкой по Тьюки.
Таблица 3. Клинико-морфологические характеристики больных РМЖ с различными генотипами
| Клинико-морфологические характеристики РМЖ | Вся выборка | -308A TNF | |||
| n=100 (%) | -308GG, n=76 (%) | -308A, n=24 (%) | AH8.1–, n=9 (%) | M(AH8.1)+1, n=15(%) | |
| I стадия | 31 (31,0) | 23 (30,3) | 8 (33,3) | 3 (33,3) | 5 (33,3) |
| II стадия | 47 (47,0) | 38 (50,0) | 9 (37,5) | 3 (33,3) | 6 (40,0) |
| III стадия | 22 (22,0) | 15 (19,7) | 7 (29,2) | 3 (33,3) | 4 (26,7) |
| нд | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| G1 | 10 (10,6) | 9 (12,5) | 1 (4,5) | 0 (0,0) | 1 (7,1) |
| G2 | 60 (63,8) | 44 (61,1) | 16 (72,7) | 7 (87,5) | 9 (64,3) |
| G3 | 24 (25,5) | 19 (26,4) | 5 (22,7) | 1 (12,5) | 4 (28,6) |
| нд | 6 | 4 | 2 | 1 | 1 |
| неспец | 81 (81,0) | 65 (85,5) | 16 (66,7) | 6 (66,7) | 10 (66,7) |
| дольк | 13 (13,0) | 8 (10,5) | 5 (20,8) | 2 (22,2) | 3 (20,0) |
| другие | 6 (6,0) | 3 (3,9) | 3 (12,5) | 1 (11,1) | 2 (13,3) |
| нд | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| ER+ | 82 (87,2) | 60 (84,5) | 22 (95,7) | 7 (87,5) | 15 (100,0) |
| ER– | 12 (12,8) | 11 (15,5) | 1 (4,3) | 1 (12,5) | 0 (0,0) |
| нд | 6 | 5 | 1 | 1 | 0 |
| PR+ | 66 (71,7) | 48 (68,6) | 18 (81,8) | 6 (75,0) | 12 (85,7) |
| PR– | 26 (28,3) | 22 (31,4) | 4 (18,2) | 2 (25,0) | 2 (14,3) |
| нд | 8 | 6 | 2 | 1 | 1 |
| HER2+ | 15 (16,0) | 12 (16,7) | 3 (13,6) | 0 (0,0) | 3 (21,4) |
| HER2– | 79 (84,0) | 60 (83,3) | 19 (86,4) | 8 (100,0) | 11 (78,6) |
| нд | 6 | 4 | 2 | 1 | 1 |
| Ki67>30 | 42 (45,7) | 33 (47,8) | 9 (39,1) | 4 (50,0) | 5 (33,3) |
| [20-30] | 27 (29,3) | 19 (27,5) | 8 (34,8) | 3 (37,5) | 5 (33,3) |
| Ki67<20 | 23 (25,0) | 17 (24,6) | 6 (26,1) | 1 | 5 (33,3) |
| нд | 8 | 7 | 1 | 1 | 0 |
Примечание. 1M(AH8.1)+ — носители одного и более маркерных аллелей гаплотипа AH8.1 (HLA-A*1, HLA-B*8 и HLA-DRB1*03).
В своей работе мы использовали две независимые выборки (экспериментальную и архивную), причем для определения концентрации sTNF методом ИФА были использованы разные диагностические наборы, что, несомненно, является ограничением данного исследования. Был проведен анализ динамики изменения уровней sTNF в трех точках — до операции, «до» и «после» АДЛТ во всех генетических группах, тем не менее статистически значимым оказалось только повышение уровня sTNF на первом этапе лечения для группы -308A/AH8.1– (p=0,0014) (см. рисунок, б). Таким образом, в этом исследовании мы не смогли выявить влияния АДЛТ на уровень sTNF у больных РМЖ.
Средние уровни sTNF в архивной группе (до операции) статистически достоверно различались у носителей -308A при наличии и отсутствии маркерных аллелей AH8.1 (3,9±0,32 и 5,3±0,26 пкг/мл соответственно; p=0,0035), хотя эти значения находились практически в границах нормы (см. рисунок, б). Для экспериментальной группы только после проведения АДЛТ были обнаружены статистически достоверные различия у носителей аллеля -308A при наличии и отсутствии маркерных аллелей AH8.1 (3,3±1,21 и 33,8±12,29 пкг/мл соответственно; p<0,001). По сравнению же с носителями -308GG среднее значение sTNF было достоверно выше в группе -308A/AH8.1- как до АДЛТ (9,6±1,78 и 25,1±8,2 пкг/мл соответственно; p<0,05), так и после АДЛТ (6,8±2,18 и 33,8±12,29 пкг/мл соответственно; p<0,001) (см. рисунок, б). Таким образом, на двух независимых выборках были получены данные, подтверждающие нормализующее влияние гаплотипа AH8.1 на продукцию sTNF у носителей полиморфизма -308A гена TNF, по сравнению с носителями распространенного генотипа -308GG.
РМЖ — это гетерогенное заболевание, включающее различные молекулярные подтипы опухоли. Наряду с химиотерапией и лучевой терапией современные методы молекулярно-направленной терапии РМЖ представлены эндокринной и анти-HER2-терапией, а также новыми подходами ингибирования ключевых молекул иммунного ответа, метаболических и сигнальных путей опухолевых клеток. Несмотря на существенные успехи, перед медицинской наукой по-прежнему стоит задача повышения эффективности за счет персонификации на всех этапах лечения.
TNF — многофункциональный цитокин с двойственной ролью в онкологии. С одной стороны, он оказывает противоопухолевый эффект через прямое цитотоксическое/цитостатическое действие на опухолевые клетки, индукцию геморрагического некроза опухоли, стимуляцию противоопухолевого иммунитета. С другой стороны, TNF обладает проканцерогенным действием, вызывая неоангиогенез, пролиферацию, инвазию и миграцию опухолевых клеток, способствуя метастазированию и прогрессии заболевания [2]. TNF кажется весьма привлекательной терапевтической мишенью. Считается, что низкие эндогенные концентрации цитокина при хроническом воспалении обладают проканцерогенным действием, тогда как высокие (терапевтические) концентрации экзогенного TNF оказывают противоопухолевое действие. Соответственно, два противоположных направления — TNF как мишень и как лекарственное средство — пытались применить в ограниченном числе клинических исследований, однако недостаточно эффективно. Предполагается, что персонификация режима TNF-терапии для каждого молекулярного подтипа опухоли позволит добиться более значительных результатов в лечении РМЖ [11, 12].
Повышенный уровень sTNF у больных онкологическими и аутоиммунными заболеваниями связывают с аллелем -308A гена TNF [13—15], при этом продукция цитокина, по-видимому, контролируется активацией многих клеточных сигнальных путей, межклеточных взаимодействий, однако механизм регуляции экспрессии гена TNF остается не до конца изученным.
В нашем исследовании средние значения уровня sTNF были выше для носителей аллеля -308A, по сравнению с носителями -308GG, хотя и не достигали достоверных различий. При оценке влияния наследственного гаплотипа AH8.1 на уровень sTNF группа больных РМЖ, имеющих, согласно нашим предыдущим исследованиям [9], прогностически неблагоприятный генотип -308A/AH8.1–, достоверно отличалась от остальной выборки повышенным уровнем sTNF (см. рисунок). При наличии аллеля -308A гена TNF носители каждого из маркерных аллелей аутоиммунного наследственного гаплотипа AH8.1 (HLA-A*01, HLA-B*08 и HLA-DRB1*03) имели более низкую концентрацию sTNF в сыворотках крови в трех временных точках: до операции, до АДЛТ и после проведения АДЛТ (см. табл. 2), т.е. при одновременном носительстве маркерных аллелей AH8.1 у носителей высоко-экспрессирующего аллеля -308A подавляется продукция sTNF.
Полученные данные находятся в противоречии с результатами работы L.J. Abraham и соавт., которые исследовали влияние наследственных гаплотипов на продукцию TNF в супернатантах лимфобластоидных клеточных линий, и продемонстрировали повышенную продукцию TNF клетками, гомозиготными по гаплотипу AH8.1, по сравнению с другими наследственными гаплотипами HLA [16]. Тем не менее, согласованность наших данных о пониженной экспрессии sTNF при наличии маркерных аллелей AH8.1 в двух независимых выборках российских больных РМЖ (архивной и экспериментальной), повышают научную значимость полученных нами результатов. Кроме того, имея в виду этнические различия, описанные для полиморфизма гена TNF [17, 18] и гаплотипа AH8.1 [19, 20], национальные исследования, по нашему мнению, имеют приоритетное значение.
В нашем исследовании повышенный уровень цитокина отмечался в генетической группе -308A/AH8.1– на протяжении нескольких этапов лечения. Экстраполируя полученные данные (см. рисунок), можно предположить, что оперативное вмешательство стимулирует экспрессию гена TNF в большей степени для носителей аллеля -308A, чем гомозиготных по -308GG. При этом гаплотип AH8.1 оказывает нормализующее действие, поскольку у носителей -308A в таком случае обнаруживается концентрация циркулирующего sTNF, сопоставимая с контрольной группой -308GG, тогда как для носителей -308A вне аутоиммунного гаплотипа такие регуляторные механизмы, по-видимому, не работают и концентрация sTNF остается существенно повышенной.
Следует уточнить, что отсутствие маркерных аллелей наследственного гаплотипа AH8.1 подразумевает для высоко экспрессирующего аллеля -308A гена TNF иное геномное окружение и, возможно, сцепленность с другими наследуемыми гаплотипами комплекса HLA. Продолжение исследований в этом направлении позволило бы более определенно оценить роль полиморфизма -308(G/A)TNF в патогенезе РМЖ. Тем не менее, на настоящий момент кажется возможным применение для генетической группы -308A/AH8.1– с повышенным уровнем sTNF анти-TNF терапии, причем уже на ранних этапах лечения РМЖ.
Ограничением данного исследования является низкая частота носителей как прогностически неблагоприятного генотипа -308A/AH8.1– (9%), так и прогностически благоприятного генотипа -308A/M(AH8.1)+ (15%). Однако нам удалось получить статистически значимые и биологически обоснованные доказательства влияния наследственного гаплотипа AH8.1 на уровень sTNF у российских больных РМЖ. Кроме того, в масштабах уровня заболеваемости РМЖ предпринятые и дальнейшие исследования в этом направлении представляются актуальными.
Заключение
Проведен детальный анализ влияния наследственного гаплотипа AH8.1 на уровень sTNF у носителей полиморфизма -308(G/A)TNF больных РМЖ. Определена генетическая группа -308A/AH8.1– с повышенным уровнем sTNF, для которой (имея в виду прогностическую неблагоприятность такого генотипа) в дополнение к стандартным протоколам, предположительно может быть использована анти-TNF-терапия. С другой стороны, у носителей высокоэкспрессирующего аллеля -308A гена TNF аутоиммунный гаплотип AH8.1 оказывает нормализующее действие на продукцию sTNF в сыворотках крови больных РМЖ до уровня, сравнимого с уровнем цитокина в группе носителей распространенного -308GG генотипа.
Полученные результаты могут быть использованы в рамках персонифицированной медицины и требуют дальнейшего исследования.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.