Введение

Ожоги составляют значительную часть патологии глаза. По этиологии они разделяются на химические (кислотные и щелочные), лучевые и термические. При этом щелочные ожоги встречаются чаще по причине преобладания веществ этой группы в составе бытовой химии. На долю химических ожогов может приходиться 12—22% от всех повреждений глаз [1].

Одним из исходов химического повреждения является помутнение роговицы, приводящее к значительному снижению зрительных функций. В комплексе мер по лечению химических ожогов роговицы отдельное значимое место занимает применение амниотической мембраны (АМ) [2].

Амнион — одна из плодных оболочек, часть плаценты, покрывающая пластинку хориона. В офтальмологии аллогенная АМ может применяться в виде свежего препарата в транспортной среде, а также в консервированном или лиофилизированном виде [3]. Широко известны преимущества применения АМ в офтальмологии при лечении травматического поражения роговицы глаза различной этиологии. АМ обладает противовоспалительными свойствами, содержит факторы роста и цитокины, индуцирующие эпителизацию и заживление ран [3, 4]. АМ обладает свойством влиять на врожденные и адаптивные иммунные процессы при лечении хронических воспалительных процессов и индукции толерантности к аутоиммунным реакциям, а также способна создавать среду для оптимальной регенерации тканей [3].

Цель исследования — подтвердить эффективность разработанной системы оценки толщины различных слоев роговицы, с ее помощью на основании клинической и объективной гистологической оценки определить преимущества и недостатки раннего покрытия поверхности глаза АМ в сочетании с блефарорафией и комплексной консервативной терапией в сравнении с аналогичной тактикой без применения АМ при лечении химического ожога глаза в эксперименте.

Материал и методы

Работа выполнена на лабораторных крысах линии Wistar мужского пола массой от 300 до 400 г. Операции и манипуляции с животными проводили, руководствуясь Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых в экспериментальных и других исследованиях (European Convention for Protection of Vertebrate Animals Used in Experimental and other Studies, 1986). Заключение ЛЭК ФГБОУ ВО «СЗГМУ им. И.И. Мечникова» Минздрава России от 12.10.22, протокол №9.

Животные (n=32; 64 глаза) были разделены на четыре равные группы в зависимости от планируемого срока выведения из эксперимента: 1 нед, 2 нед, 3 нед и 4 нед. Каждую группу формировали из 8 крыс.

Процесс формирования щелочного ожога. Эксперимент на животных проводили в экспериментальной микрохирургической операционной кафедры оперативной и клинической хирургии с топографической анатомией под руководством доц. В.В. Татаркина. Ожог вызывали 1,0-молярным (4%) раствором NaOH (40 г сухого вещества на 1 л). Перед вмешательством крысам вводили препараты для медикаментозной анестезии (димедрол, рометар, золетил) и выполняли дополнительную анестезию поверхности глаза инстилляцией 0,4% раствора инокаина.

Для подготовки операционного поля область глаза изолировали стерильными салфетками. Осуществляли вывих глазного яблока наружу и широкое раскрытие век путем наложения швов-держалок. Ожог наносили на половину площади роговицы с захватом области лимба при помощи аппликаторов из фильтровальной бумаги, пропитанных 1,0-молярным раствором щелочи по методу Обенбергера [5] (рис. 1).

Рис. 1. Подготовленное операционное поле: веки взяты на швы-держалки, глазное яблоко вывихнуто наружу, на поверхность помещен аппликатор, пропитанный 4% раствором NaOH.

Время аппликации — 1 мин, затем проводили нейтрализацию щелочи 2% раствором борной кислоты и промывание стерильным изотоническим раствором хлорида натрия в течение 10 мин.

Левый глаз (группа контроля: КТ (консервативная терапия) + РВБ (ранняя временная блефарорафия): выполняли РБВ путем наложения П-образного шва на веки. В дальнейшем применяли комплексную медикаментозную терапию: глюкокортикостероидами короткого действия (0,1% раствор дексаметазона 3 раза в сутки, 14 дней) и антибактериальными препаратами (0,3% флоксал 3 раза в сутки, 14 дней). Введение растворов лекарственных средств осуществляли через сомкнутые веки при помощи шприца с затупленной канюлей.

Правый глаз (основная группа: КТ + РПАМ (ранняя пластика амниотической мембраной + РВБ): с применением микрохирургического инструментария и с использованием операционного микроскопа МХ-ОФ-1 ЛОМО лоскутом амниотической мембраны покрывали обожженную поверхность роговицы эпителием вверх с захватом 1—2 мм склеры. Лоскут подшивали к конъюнктиве узловыми швами (пролен 10-0) по окружности.

Для экспериментального оперативного вмешательства использовали свежую АМ, которая была получена в стерильных условиях операционной после планового кесарева сечения. Перед забором АМ получали согласие рожениц. Мембрану механически отделяли от хориона и промывали стерильным изотоническим раствором хлорида натрия, содержащим 1% пенициллин-стрептомицин-неомициновую (PSN) смесь антибиотиков. Длительность ее хранения не превышала 3 сут при температуре 0—4°C. Дальнейшие этапы лечения, включающие временную блефарорафию и медикаментозную терапию, были аналогичны применяемым в группе контроля (левый глаз).

В работе применили деление ожогового процесса на четыре фазы по J. McCulley [6].

Оценка результатов. Исследование клинических критериев выполнено у 32 крыс (64 глаза: 32 — группа контроля, 32 — основная группа, или группа АМ).

Клиническое состояние. Для оценки офтальмологического статуса швы, наложенные с целью блефарорафии, и остатки АМ удаляли после медикаментозной седации. Затем голову животного фиксировали напротив щелевой лампы глазным яблоком к объективу. После первоначального осмотра переднего отдела глаза инстиллировали раствор флуоресцеина натрия и проводили дополнительный осмотр глаза при помощи синего кобальтового фильтра.

Осуществляли учет следующих клинических критериев:

— сохранность шва блефарорафии;

— реактивное воспаление вспомогательных органов глаза (ВОГ);

— состояние роговицы — степень эпителизации, наличие обширной неоваскуляризации (более половины площади поверхности);

— субатрофия глазного яблока;

— тонус глазного яблока.

Гистологическое исследование. Для патогистологического исследования случайным образом выбирали по 2 крысы (4 экспериментальные модели ожога роговицы глаза) из каждой группы, выводимой из эксперимента по выбранным срокам. Выведение животных из эксперимента выполняли путем передозировки раствора золетила (100 мг/кг, Virbac). После выведения подопытных животных удаляли глазные яблоки, из них выкраивали корнеосклеральный лоскут с захватом 3—4 мм склеры и конъюнктивы. Гистологический материал фиксировали в 12% растворе нейтрального формалина не менее 24 ч. Окраску осуществляли гематоксилином и эозином, альциановым синим. Изготовление и сканирование микропрепаратов осуществляли на кафедре патологической анатомии ФГБОУ ВО «СЗГМУ им. И.И. Мечникова» Минздрава России под руководством завкафедрой к.м.н., доц. Р.В. Деева. Гистологическое исследование проводили с использованием системы для сканирования микропрепаратов Aperio AT2 (Leica Biosystems, Германия).

С целью уточнения состоятельности экспериментальной модели были сформированы препараты отрицательного (здоровая роговица) и положительного (ранний ожог без лечения) контроля.

Оценку гистологических критериев проводили путем:

— визуальной оценки дезорганизации слоев роговицы, наличия клеток воспалительного ряда, новообразованных сосудов;

— объективного расчета толщины эпителия и стромы исследуемых образцов.

Статистические методы исследования. В рамках общего подхода к исследованию использован метод описательной статистики [7]. С целью объективной оценки влияния АМ на течение ожогового процесса проведено измерение толщины эпителия и стромы одновременно во множестве точек среза роговицы, выявлены участки максимальной и минимальной толщины, выполнен подсчет средней толщины и стандартного отклонения (рис. 2).

Рис. 2. Процесс измерения толщины стромы и эпителия роговицы во множестве точек на сканах исследуемых гистологических срезов.

Статистический анализ проводили для определения значимости различий между значениями выбранных показателей в исследуемых группах. Анализ полученных данных выполняли средствами системы Statistica for Windows (версия 10, лиц. BXXR310F964808FA-V). Сравнение количественных параметров (толщина стромы/эпителия) в группе контроля и основной группе осуществляли в заранее обозначенных временных промежутках: 1 нед, 2 нед, 3 нед и 4 нед. Оценку динамики или изменений в правом и левом глазу («опыт — контроль») выполняли с помощью критерия Уилкоксона. Выбранный метод позволил провести статистический анализ данных в группах с малым количеством наблюдений. Статистический анализ клинических критериев выполнен общепринятыми математическими методами с вычислением процентов. Применение указанных методов и материалов обосновывает достоверность выводов проведенного исследования.

Результаты

После визуальной оценки клинических критериев выявлено, что в обеих группах сохранность шва от блефарорафии была одинаковой, в группе применения АМ реже встречались такие признаки, как воспаление тканей ВОГ и субатрофия глазного яблока. Частота развития обширной неоваскуляризации (более половины площади поверхности роговицы) была больше при применении АМ (рис. 3).

При исследовании глаза крысы под кобальтовым фильтром с окраской флуоресцеином натрия выявлена полная эпителизация всех экспериментально полученных ожогов роговицы глаз на всех сроках наблюдения (1 нед, 2 нед, 3 нед и 4 нед исследования). Отмечено отсутствие зон прокрашивания на роговичной поверхности, что свидетельствует о полной эпителизации зоны экспериментального химического ожога.

Тонус глазного яблока оценивали пальпаторно, исходя из субъективных тактильных ощущений при компрессии глазного яблока двумя хирургическими пинцетами, аналогично пальпаторному определению внутриглазного давления у человека. За норму взято ощущение внутриглазного давления у здоровой крысы на неповрежденном глазу.

При сравнении двух групп выявлено, что тонус глазного яблока в группе с использованием АМ преимущественно был нормальным и минимально сниженным (Tn, T–1). При этом глаза с экспериментальным химическим ожогом роговицы из группы контроля в основном характеризуются сниженным офтальмотонусом (Т–2, Т–3). Результаты распределения состояния внутриглазного давления продемонстрированы на рис. 3.

Рис. 3. Распределение и соотношение клинических признаков поражения глазного яблока в разных группах наблюдения. Распределение и соотношение ориентировочных показателей офтальмотонуса в разных группах наблюдения.

OD — группа АМ; OS — группа контроля.

Гистологическое исследование. Для более объективного сравнения различных экспериментальных групп сформированы модели положительного (роговица сразу после ожога) и отрицательного (нормальная роговица) контроля (рис. 4).

Рис. 4. Положительный (а) контроль (роговица сразу после ожога) и отрицательный (б) контроль (здоровая роговица).

Видно, что поверхность роговицы сразу после ожога полностью деэпителизирована, но патологические изменения слоев еще не выявляются. В здоровой роговице слои четко дифференцируются, строма цельная, отек, фиброзирование, клеточная инфильтрация отсутствуют, слои эпителия упорядочены, клетки имеют физиологическую форму.

Исследование роговицы глаз животных из группы контроля. В препаратах через 1 нед наблюдения выявляли заметное уменьшение числа слоев эпителия, наблюдали дегенеративные изменения стромы роговицы, которые являются прямым следствием ожога (рис. 5). Ко 2-й и 3-й неделям наблюдения указанные изменения прогрессировали, сохранялась неупорядоченность слоев эпителия, местами наблюдали его утолщение.

Рис. 5. Гистологическое исследование роговицы.

1а — группа контроля на первой неделе наблюдения. Клетки эпителия полиморфны, слои местами не упорядочены. Выраженная инфильтрация (а) в субэпителиальных слоях, местами отмечалась отечность стромы с частичной отслойкой эпителия (в), центральная и периферическая неоваскуляризация (с). 2а — группа контроля на второй неделе наблюдения. Отечность, вакуолизация (d), выраженное расслоение стромы (e), инфильтрация клетками воспалительного ряда (f), усиление центральной и периферической неоваскуляризации (g). 3а — группа контроля на третьей неделе наблюдения. Эпителий неравномерный, слои местами не определяются. Сохраняется отечность, расслоение стромы (h), выраженная неоваскуляризация и инфильтрация клетками воспалительного ряда. Отмечается начало разрастания соединительной ткани между слоями стромы (i). 4а — группа контроля на четвертой неделе наблюдения. Субатрофия глазного яблока, наблюдается расслоение и воспалительная инфильтрация (j), строма в центральной зоне истончена, деформирована (k), отмечается субэпителиальная инфильтрация стромы (l), начало фиброзирования (m). 1б — основная группа (АМ) в 1-ю неделю наблюдения. Выраженная инфильтрация субэпителиальных слоев (n) на периферии роговицы, отечность и расслоение стромы (o). 2б — основная группа (АМ) на 2-й неделе наблюдения. Расслоение и отечность глубоких слоев. Под роговицей видно гомогенное вещество хрусталиковых масс (p). Обширная область неоваскуляризации в центральной и периферической зоне роговицы. 3б — основная группа (АМ) на 3-й неделе наблюдения , в поверхностных слоях стромы умеренная субэпителиальная инфильтрация (q). 4б — основная группа (АМ) на 4-й неделе наблюдения, наблюдается частичное расслоение глубоких слоев стромы (r).

На 4-й неделе наблюдения продолжилось разрастание соединительной ткани при сохранении интенсивной инфильтрации и неоваскуляризации (см. рис. 5).

Выявленные изменения (отслойка эпителия, снижение количества слоев эпителия, эпителиальная инфильтрация, выраженное расслоение стромы, фиброзирование и неоваскуляризация) с 1-й по 4-ю неделю являются закономерным итогом ожогового поражения роговицы при частичном сохранении лимбальных клеток и проведения базового лечения при помощи РВБ и консервативного лечения.

Исследование основной экспериментальной группы. На 1-й неделе наблюдения по сравнению с контрольной группой в меньшей степени отмечали дегенеративные изменения, связанные с течением ожогового процесса (см. рис. 5).

На 2-й неделе эпителий был более физиологичным, чем в группе без применения АМ. Однако стромальные изменения оставались значительно выраженными (см. рис. 5).

Аналогичные изменения наблюдали на 3-й и 4-й неделях наблюдения (см. рис. 5).

Выявлено положительное влияние АМ на течение ожогового процесса в представленной экспериментальной модели, что, по-видимому, обусловлено ее противовоспалительными свойствами, способствующими эпителизации стромы. В результате этого эффекта наьоблюдается меньшая степень дегенеративных изменений эпителия, менее выраженная инфильтрация стромы на всех неделях наблюдения, а также более физиологичное строение слоев.

При исследовании соотношения толщины эпителия в основной и контрольной группах на 1-й неделе наблюдения, т.е. в момент окончания острой фазы ожогового процесса по McCulley, эпителий на глазах, в лечении которых была использована АМ, был достоверно толще, чем в группе без использования АМ (рис. 6). Полученные данные с учетом относительного сходства по размерам отдельных эпителиоцитов могут свидетельствовать об увеличении толщины и упорядоченности слоев эпителия. На 2-й и 3-й неделях наблюдения (ранняя репаративная стадия) эпителий в опытной группе также был толще, за исключением одной крысы на 2-й неделе наблюдения, в случае которой различие между опытом и контролем было недостоверным. Лишь на 4-й неделе, в срок, который можно отнести к поздней репаративной стадии послеожоговых изменений, толщина эпителия в группе контроля увеличилась по сравнению с таковой в группе применения АМ. На это указывает в одном случае незначимость разницы толщины эпителия правого и левого глаза, а в другом случае бóльшая толщина эпителия левого глазного яблока, при лечении которого АМ не была использована. Результаты оценки толщины эпителия в опытной и контрольной группах представлены на рис. 6.

Рис. 6. Толщина эпителия в группе контроля и в основной экспериментальной группе.

Уровень p≤0,05 (*) отмечен во всех случаях, за исключением животного №1, выведенного из эксперимента на 2-й неделе, и животного №2, выведенного из эксперимента на 4-й неделе. Толщина стромы роговицы в группе контроля и в основной экспериментальной группе. Уровень p≤0,05 (*) наблюдается во всех случаях, за исключением животного №2, выведенного из эксперимента на 4-й неделе.

При исследовании соотношения толщины стромы в группе АМ и группе контроля на 1-й и 2-й неделях наблюдения (острая фаза воспаления и первая половина ранней репаративной фазы по McCulley) выявлена бóльшая толщина стромы роговицы в группе с использованием АМ (см. рис. 6). На 3-й неделе толщина стромы роговицы была больше в группе контроля, что может быть объяснено усилением активности воспалительного процесса с начала 3-й недели и появлением большого числа клеток воспалительного инфильтрата и новообразованных сосудов. К началу поздней репаративной фазы различия стали менее заметными, а у одного из животных различия не были достоверными. Результаты оценки толщины эпителия в опытной и контрольной группах представлены на рис. 6.

Обсуждение

Метод формирования химического ожога с использованием аппликаторов по Обенбергеру [5] был неоднократно воспроизведен во множестве научных работ. На роговицу лабораторных животных наносился ожог аппликаторами разных размеров. При этом способы оценки патологических изменений при проведении гистологического исследования различались. Ряд авторов учитывали интенсивность проявления патологических признаков, выраженную в баллах, с последующим их подсчетом и статистическим анализом на его основании. А.М. Кодунов и соавт. [8] проводили оценку толщины однократно в центральной зоне и перилимбально с использованием оптической когерентной томографии (OCT). X. Zhao и соавт. [9] проводили оценку эффективности лечения АМ, исходя из скорости эпителизации и степени сохранения функции светопропускания роговичной ткани.

Ряд авторов проводили объективную гистологическую оценку на основании ориентировочного подсчета длины новообразованных сосудов.

Целью проведенной работы было подтверждение эффективности разработанной нами системы оценки толщины отдельных слоев роговицы и определение с ее помощью влияния амниотической мембраны на течение ожогового процесса. Применяемая в настоящем исследовании модель химического ожога позволила получить явные изменения нормальной морфологии слоев роговицы, на примере которых можно было эффективно оценить влияние различных способов лечения.

Клиническая оценка осуществлялась путем подсчета распространенности отдельных клинических признаков. Было показано снижение распространенности реактивного воспаление ВОГ в группах, где в качестве биологической повязки была использована АМ, что согласуется с данными других авторов [10].

В исследовании Л.И. Кучеренко и соавт. [11] эпителизация в контрольной группе была завершена к 14-м суткам, в опытной — к 8—11-м суткам, однако в работе отсутствуют сведения о протяженности поражения лимба. X. Zhao и соавт. [9] отмечали полную эпителизацию лишь после 14-х суток наблюдения, но в работе были использованы диски фильтровальной бумаги округлой формы — и зона поражения лимба закономерно была распространена на всем его протяжении.

Д.С. Мальцев и соавт. [12] при моделировании ожога на половине окружности роговицы с захватом лимба отмечали сохранение дефекта эпителия на 7-е сутки лишь в виде эрозии в центре. В нашей работе ожог также формировался аппликатором той же формы, при этом на всех роговицах начиная с 1-й недели наблюдали полную эпителизацию.

Прогностически значимым критерием оценки репаративных процессов после нанесения экспериментального химического ожога роговицы является площадь неоваскуляризации. Так, Д.С. Мальцев и соавт. [12] наблюдали статистически значимое увеличение площади неоваскуляризации при применении эмульсии АМ по сравнению с контролем, что также отмечено и в нашем исследовании.

Гипотония и в дальнейшем субатрофия глазного яблока — прямое следствие длительного изменения pH во влаге передней камеры, что ведет к необратимым изменениям внутриглазных структур [13]. При этом известно, что раннее покрытие ожоговой поверхности АМ способствует скорейшей эпителизации и благодаря противовоспалительным свойствам мембраны снижает интенсивность цитокиновой кератомаляции [2, 12]. Это, по-видимому, может являться свойством, определяющим уменьшение числа случаев стойкой гипотонии при использовании АМ.

Гистологическая оценка препаратов роговицы служит одним из важнейших показателей эффективности лечения химического ожога в нашем исследовании. Ряд авторов для исследования микропрепаратов разработали балльную шкалу выраженности морфологических изменений. А.М. Кодунов и соавт. [8] используют данные толщины роговицы, полученные при помощи OCT в центральной и периферической зоне, но при этом авторы отмечают, что неравномерность толщины стромы не позволяет объективно сравнить толщину стромы в контрольной и опытной группах глаз. Преимущество нашей системы подсчета состоит в усреднении толщины стромы и эпителия на всем протяжении роговичного среза с последующим расчетом и анализом статистических показателей.

Проведя анализ результатов подсчета, можно отметить, что в группе использования АМ в меньшей степени наблюдалась дезорганизация отдельных слоев роговицы.

Статистически значимое уменьшение толщины эпителия в группе контроля на всех временных промежутках при относительно равных размерах отдельных эпителиоцитов, по-видимому, может свидетельствовать о большей дезорганизации и меньшем количестве слоев эпителия по сравнению с группой, в которой применялась АМ.

Статистически значимое различие по толщине стромы роговицы в исследуемых группах свидетельствует о выраженном влиянии АМ на течение таких патологических процессов, как клеточная инфильтрация, тканевый отек на ранних стадиях, разрастание соединительной ткани и неоваскуляризация на поздних стадиях ожогового процесса. По результатам подсчета перечисленных параметров выявлено истончение стромы на ранних сроках в группе контроля, что в отсутствие выраженных признаков отслойки десцеметовой мембраны и отека стромы в группе АМ может свидетельствовать о большей дегенерации слоев стромы и большем риске перфорации роговицы. Помимо этого, при использовании АМ отмечается уменьшение степени фиброзирования в период перехода ранней репаративной стадии в позднюю (3-я и 4-я недели наблюдения), что объясняет не столь значительное утолщение стромы в опытной группе в исследуемый период.

Результаты проведенного клинического и гистологического исследования подтверждают преимущества использования в качестве раннего лечения щелочных химических ожогов роговицы глаза покрытия ожоговой поверхности нативной АМ.

Заключение

1. Применяемая экспериментальная модель щелочного ожога роговицы глаза на лабораторных крысах показала свою эффективность в исследовании различных методов лечения данной патологии с позиции изучения как клинических проявлений процессов послеожоговой репарации, так и гистологических изменений ожоговой раны роговицы глаза. Вместе с тем разработанная система объективной гистологической оценки позволила оценить показатели статистически значимых (непараметрический тест-критерий Уилкоксона) изменений в толщине эпителия (в 6 случаях из 8) и стромы (в 7 случаях из 8) в исследуемых группах.

2. Применение амниотической мембраны оказало положительное влияние в отношении отдельных клинических проявлений ожоговой болезни. Выявлено, что в группе применения амниотической мембраны реже встречались реактивное воспаление ВОГ, субатрофия глазного яблока, однако обширная неоваскуляризация роговицы отмечалась чаще в группе применения амниотической мембраны. Офтальмотонус в группе амниотической мембраны преимущественно находился в пределах его нормального и минимально сниженного значения (Tn, T–1) по сравнению с группой контрольного лечения, в которой тонус глазного яблока в основном был снижен (T–2, T–3).

3. При использовании амниотической мембраны отмечено более частое сохранение нормальной морфологии и толщины эпителия роговицы на всех сроках наблюдения. При этом в 1-ю неделю и на 2-й неделе наблюдения выявлено преобладание толщины стромы в основной группе по сравнению с контрольной группой, что свидетельствует о снижении риска перфорации глазного яблока в основной группе по сравнению с контрольной группой. Кроме того, наблюдали уменьшение степени фиброзирования в период перехода ранней репаративной стадии в позднюю (3-я и 4-я недели наблюдения).

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — Э.В. Бойко, Е.М. Трунин, Р.В. Деев, В.В. Татаркин, Ф.О. Касымов, Ю.Л. Васильев, Н.В. Щемеров

Сбор и обработка материала — А.Н. Андреева, Р.И. Абдульминова, Е.Д. Реснянская, И. Сорочану, Н.В. Щемеров, Е.В. Пресняков

Статистическая обработка — О.А. Клиценко

Написание текста — Н.В. Щемеров

Редактирование — Э.В. Бойко, Р.В. Деев, Е.М. Трунин, В.В. Татаркин, Ф.О. Касымов, Ю.Л. Васильев

Participation of authors:

Concept and design of the study — E.V. Boyko, E.M. Trunin, R.V. Deev, V.V. Tatarkin, F.O. Kasymov, Yu.L. Vasiliev, N.V. Shchemerov

Data collection and processing — A.N. Andreeva, R.I. Abdulminova, E.D. Resnyanskaya, I. Sorochanu, N.V. Shchemerov, E.V. Presnyakov

Statistical processing of the data — O.A. Klitsenko

Text writing — N.V. Shchemerov

Editing — E.V. Boyko, R.V. Deev, E.M. Trunin, V.V. Tatarkin, F.O. Kasymov, Yu.L. Vasiliev

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.