Введение
Инволюционные изменения кожи представляют собой комплексный процесс, включающий уменьшение толщины дермы, снижение количества фибробластов, гиалуроновой кислоты и коллагена, структурную дезорганизацию коллагеновых и эластических волокон, нарушение микроциркуляции, атрофию подкожно-жировой клетчатки (ПЖК) и другие изменения [1]. Следует отметить, что во многом схожие изменения наблюдаются у достаточно молодых пациентов с недифференцированной дисплазией соединительной ткани, для которой характерно преждевременное старение кожи [2]. В связи с этим в современной эстетической медицине все более востребованы стимулирующие методы, реализующие многофакторное патогенетически обоснованное действие в отношении атрофических процессов. Именно к таким методам относится введение препаратов полимолочной кислоты (ПМК) [3]. В исследованиях показано, что введение ПМК стимулирует синтез фибробластами коллагена, эластина, фибронектина, гликозаминогликанов, протеогликанов и других компонентов внеклеточного матрикса [4]. Установлено, что введение ПМК в кожу стареющих животных приводит к усилению пролиферации адипозных стволовых клеток и усилению ангиогенеза [5, 6]. Накопленные данные обосновывают целесообразность применения ПМК для коррекции возрастных изменений кожи лица и тела [7, 8].
Эффективность любого метода лечения подтверждается не только клиническими наблюдениями, но и объективными методами оценки результата. В эстетической медицине в последнее время широкое распространение получили ультразвуковые исследования (УЗИ). Они проводятся с целью уточнения анатомии мягких тканей, идентификации филлеров разной природы, оценки особенностей морфологии кожи на фоне выполненных процедур и при диагностике нежелательных явлений [9]. Для исследования кожи могут использоваться линейные датчики с частотой от 7 МГц, позволяющие различать структурные образования размером менее 100 мкм [10]. Несмотря на широкие возможности метода высокочастотного УЗИ, научные данные по его применению для оценки эффективности и безопасности введения ПМК ограничены несколькими исследованиями. В работе R. Mazzuco и соавт. сравнивались характеристики кожи при введении поли-L-молочной кислоты (poly-L-lactic acid — PLLA) на различную глубину [11]. Было показано, что уплотнение дермы и жировой клетчатки при поверхностном подкожном введении PLLA является более выраженным, чем при глубоком подкожном инъецировании. В исследовании A. Li и соавт. пациентов наблюдали в течение 30 мес после коррекции носогубных складок с использованием PLLA [12]. Авторы установили, что высокочастотное УЗИ является надежным неинвазивным методом оценки биодеградации PLLA и диагностики нежелательных явлений, связанных с инъекциями.
Решающее значение в определении реакции тканей на введение полимеров имеет гистологическое исследование. Доклинические исследования с участием лабораторных животных показали, что по мере деградации PLLA происходит выработка коллагеновых волокон, постепенно заполняющих пространства, в которых ранее располагались частицы препарата [13]. Позже эти данные были подтверждены при гистологической оценке биоптатов, взятых у пациентов в период от 8 до 24 мес после введения PLLA [14]. Наблюдалась прогрессирующая деградация PLLA с последующим формированием коллагена I типа, подтверждающая, что механизм действия связан не с физическим воздействием частиц на окружающие ткани, а с фагоцитозом PLLA макрофагами и последующим синтезом медиаторов, стимулирующих фибробласты вырабатывать коллаген и другие компоненты межклеточного матрикса. В исследовании D. Goldberg и соавт. [15] с участием здоровых добровольцев после введения PLLA наблюдалось статистически значимое увеличение содержания коллагена I типа без выраженной сопутствующей воспалительной реакции. Изменения по сравнению с исходным уровнем содержания коллагена III типа не были статистически значимыми. При окраске по Ван Гизону биоптатов, взятых через 3 мес после введения PLLA, R. Mazzuco и соавт. выявили также новообразованные эластические волокна [16].
Клинический эффект от введения PLLA может различаться в зависимости от глубины введения. В частности, предполагается, что наибольшая эффективность PLLA обеспечивается при поверхностном подкожном введении, ближе к границе дермы и ПЖК, так как именно этот слой содержит максимальное количество фибробластов и клеток воспаления [16]. Однако при коррекции тела препарат обычно вводится глубже — в ПЖК. Определенную роль в эффективности и безопасности процедуры играет и концентрация PLLA в готовой к применению суспензии, что определяется объемом воды для инъекций, применяемой для восстановления лиофилизированной субстанции [17, 18].
Медицинское изделие MiraLine PLLA 28 представляет собой стимулятор синтеза коллагена на основе PLLA. Препарат предназначен для инъекционной коррекции морщин, улучшения качества кожи и восполнения объема мягких тканей лица и тела за счет стимуляции синтеза структурных белков кожи фибробластами. В состав входит 150 мг PLLA и 50 мг натрия карбоксиметилцеллюлозы. Сферическая форма частиц (рис. 1) предотвращает их агрегацию и обеспечивает предсказуемый макрофагальный ответ. Размер частиц 25—50 мкм обеспечивает минимальную выраженность болезненных ощущений при введении препарата [19].
Для коррекции различных участков кожи тела, как правило, используется PLLA в большем разведении (в меньшей концентрации), чем при коррекции кожи лица. Убедительного обоснования этого подхода в литературе не представлено.
Рис. 1. Структура микрочастиц MiraLine PLLA 28 (лиофилизированный порошок).
Исследование структуры проведено с использованием аналитического оборудования на базе сканирующего электронного микроскопа Tescan Mira LMU. Образцы изучались в режиме топографического (SE) контраста.
Цель настоящего исследования — оценка безопасности и эффективности введения PLLA в разной концентрации и на различном уровне в области живота. Для объективной оценки процессов возможной реструктуризации кожи проводили ультразвуковое сканирование и гистологическую диагностику.
Материал и методы
В исследовании приняли участие 4 пациентки в возрасте 40—70 лет с возрастными изменениями кожи области живота. Испытуемые подписали информированное добровольное согласие на участие в исследовании и использование персональных данных.
Исходная клиническая картина включала возрастные изменения различной степени выраженности: снижение тонуса кожи, дряблость, наличие морщин различной глубины. Такие изменения являются показанием для проведения коррекции с применением PLLA. Участникам исследования вводили MiraLine PLLA 28 в области передней брюшной стенки. Нанесенная разметка включала четыре квадранта размером 4×5 см (рис. 2). В каждый квадрант вводили восстановленную суспензию PLLA в объеме 2,5—5 мл в векторной технике канюлей 23G на глубину 1,5—2 мм (граница дермы и гиподермы) или 3—4 мм (ПЖК). Использовались суспензии с концентраций PLLA 12,5 мг/мл (восстановление сухого препарата с использованием 10 мл воды для инъекций и 2 мл 2% раствора лидокаина) и 6,8 мг/мл (восстановление сухого препарата с использованием 20 мл воды для инъекций и 2 мл 2% раствора лидокаина). Процедура не требовала предварительной подготовки и выполнялась после очищения кожи. Топическая анестезия не использовалась.
Рис. 2. Разметка области введения PLLA.
Введение PLLA в зоны размеченных квадрантов проводили в следующем порядке:
1-й квадрант — введение на глубину 1,5—2 мм (граница дермы и гиподермы), PLLA в концентрации 12,5 мг/мл;
2-й квадрант — введение на глубину 3—4 мм (уровень гиподермы), PLLA в концентрации 12,5 мг/мл;
3-й квадрант — введение на глубину 1,5—2 мм (граница дермы и гиподермы), PLLA в концентрации 6,8 мг/мл;
4-й квадрант — введение на глубину 3—4 мм (уровень гиподермы), PLLA в концентрации 6,8 мг/мл.
Методы диагностики включали визуальный осмотр, фотодокументирование, УЗИ и гистологическую оценку биоптатов. Визуальный осмотр и фотодокументирование осуществлялись до введения PLLA, а также спустя 7 дней и 14 дней, 4 нед и 6 нед после процедуры с целью контроля процессов реабилитации, наличия или отсутствия нежелательных явлений.
Ультразвуковую диагностику выполняли на аппарате Mindray MX7 («Шэньчжэнь Майндрей Био-Медикал Электронике Ко., Лтд.», КНР) с линейным датчиком L20-5s (частота 20 МГц). УЗИ проводилось у всех участников исследования в каждой из четырех зон коррекции. С помощью данного метода на этапе включения в исследование подтверждали отсутствие инородных тел, в том числе внутридермальных имплантатов, в области предполагаемого введения PLLA. После введения определяли уровень имплантации PLLA, а спустя 4 нед и 6 нед после процедуры оценивали структуру мягких тканей.
Гистологическая оценка проводилась для верификации данных, полученных в ходе УЗИ. Забор материала для гистологической диагностики проводился с помощью метода панч-биопсии и был выполнен у всех участников в каждой из четырех зон коррекции. Панч-биопсия выполнялась до процедуры и через 6 нед после введения PLLA, диаметр биоптата составил 2 мм, глубина забора — 4—5 мм. Окрашивание биоптатов проводилось по Массону и Ван Гизону с целью качественной характеристики коллагеновых и эластических волокон.
Результаты
Оценка реабилитационного периода проводилась спустя 7 дней и 14 дней после процедуры. Через 7 дней наблюдали незначительные остаточные постпроцедурные явления в виде разрешающихся кровоизлияний. Спустя 14 дней после процедуры период реабилитации полностью завершился во всех зонах коррекции (рис. 3).
Рис. 3. Состояние кожных покровов.
а — до введения PLLA; б — через 2 нед после введения PLLA; в — через 6 нед после введения PLLA.
Первые клинические результаты, зафиксированные через 14 дней от момента введения, связаны в основном с эффектом от объема вводимого препарата. Однако последующая положительная динамика во всех исследуемых участках кожи связана, вероятно, уже со структурными изменениями мягких тканей в зоне введения PLLA.
Окончательный клинический результат коррекции представлен выравниванием рельефа кожи, уплотнением и сокращением ее по площади, что было определено по расположению окружающих анатомических ориентиров. Выраженный результат был зафиксирован через 6 нед после процедуры (рис. 4). При оценке клинических результатов не было выявлено избыточного стимулирующего эффекта и гипертрофии тканей.
Рис. 4. Состояние кожных покровов.
а — до введения PLLA; б — через 4 нед после введения PLLA; в — через 6 нед после введения PLLA.
Исходно у всех участников УЗИ не выявило изменений мягких тканей области живота. Инородные тела не определялись. Видна граница дермы и гиподермы. Дерма и ПЖК четко визуализировались. В ПЖК расположены многочисленные горизонтальные септы.
Через 4 нед в области введения PLLA на границе дермы и гиподермы определялась повышенная акустическая плотность, были признаки имбибиции препаратом окружающих тканей. Через 6 нед наблюдались области разной акустической плотности, что, вероятно, было связано с постепенным замещением суспензии соединительнотканными структурами. Формирующиеся зоны повышенной акустической плотности служат проявлением возможной структурной перестройки и накопления волокнистых структур, поскольку компактно расположенные коллагеновые волокна являются основными отражающими элементами для ультразвуковых волн.
На рис. 5 представлены изображения УЗИ-области 2-го квадранта с введением PLLA в концентрации 12,5 мг/мл на глубину 3—4 мм (уровень гиподермы). Аналогичная картина наблюдалась и в остальных квадрантах. УЗИ-признаки явной воспалительной реакции не отмечались.
Рис. 5. Динамика изменения акустической плотности соединительной ткани (уровень дермы/гиподермы в месте введения PLLA).
а — до процедуры; б — через 4 нед; в — через 6 нед.
Для полуколичественной оценки динамики УЗИ-картины использовали шкалу, позволяющую по визуальным признакам оценивать изменение акустической плотности соединительной ткани (плотной — дерма и рыхлой — ПЖК) областей инъекций в разных квадрантах через 6 нед наблюдения по сравнению с исходным уровнем (табл. 1).
Таблица 1. Шкала визуальной оценки динамики акустической плотности соединительной ткани исследуемых областей
| Изменение эхогенности | Балл |
| Стала ниже | –1 |
| Не изменилась | 0 |
| Стала немного выше | 1 |
| Стала заметно выше | 2 |
Результат динамического наблюдения за УЗИ-картиной представлен в табл. 2.
Таблица 2. Динамика ультразвуковых областей введения PLLA
| Квадрант | Концентрация PLLA, мг/мл | Глубина введения, мм | n | Оценка динамики акустической плотности, баллы* |
| 1-й | 12,5 | 1,5—2 | 4 | 1,25±0,5 |
| 2-й | 12,5 | 3—4 | 4 | 0,75±0,5 |
| 3-й | 6,8 | 1,5—2 | 4 | 0,75±0,5 |
| 4-й | 6,8 | 3—4 | 4 | 1,25±0,5 |
Примечание. * — данные представлены в виде среднего арифметического и стандартного отклонения (M±SD).
Полученные данные обосновывают эффективность использования суспензии с высокой концентрацией PLLA на границе дермы и гиподермы и с более низкой концентрацией PLLA при условии введения ее в ПЖК, что обычно и происходит при коррекции большинства областей тела.
Для подтверждения результатов УЗИ было проведено гистологическое исследование до и через 6 нед после введения PLLA. Был предположен активный процесс реструктуризации соединительной ткани в зоне введения препарата через 6 нед, что было показано при УЗИ. При проведении исследований серии парафиновых срезов окрашивали по Массону и Ван Гизону. Для морфометрии на микропрепаратах границу дермы и ПЖК определяли по присутствию потовых и сальных желез, а также волосяных фолликулов.
На фрагментах интактной кожи (до инъекции, окраска по Массону) (рис. 6а, 7а) видно, что эпидермис четко выражен, его складчатость умеренная, сосочковый слой дермы уплотнен, глубина его равномерная, коллагеновые волокна образуют узкопетлистую сеть. Клеточные элементы сетчатого слоя представлены небольшим количеством фибробластов, единичных макрофагов и лейкоцитов вблизи кровеносных сосудов. Пучки коллагеновых волокон среднего диаметра из сетчатого слоя дермы продолжаются в ПЖК, где располагаются более рыхло. В нижних слоях представлены адипоциты. Значения показателей морфометрии представлены в табл. 3.
Рис. 6. Гистологическое исследование образца интактной кожи и зоны введения PLLA на границе дермы и гиподермы (окраска по Массону, ×220).
а — интактная кожа; б — через 6 нед после введения PLLA.
Рис. 7. Гистологическое исследование образца интактной кожи и зоны введения PLLA в ПЖК (окраска по Массону).
а — интактная кожа (×220); б — через 6 нед (×220); в — через 6 нед (×550). Здесь и на рис. 8: ПЖК — подкожно-жировая клетчатка.
Таблица 3. Данные морфометрии гистологических препаратов
| Препарат | Общая высота фрагмента, мкм | Глубина дермы, мкм | Глубина ПЖК, мкм | Глубина области коллагеновых волокон, мкм | Глубина слоя ПЖК с адипоцитами, мкм |
| Контрольный образец до введения PLLA | 13,0±0,02 | 6,0±0,02 | 7,0±0,02 | 1,0±0,02 | 6,0±0,02 |
| Через 6 нед после введения PLLA на границе дермы и гиподермы | 15,0±0,02 | 6,0± 0,02 | 9,0,0±0,02 | 7,0±0,02 | 2,0±0,02 |
| Через 6 нед после введения PLLA в ПЖК | 12,5±0,02 | 6,0±0,02 | 6,5±0,02 | 5,0±0,02 | 1,5±0,02 |
Примечание. * — данные представлены в виде среднего арифметического и стандартного отклонения (M±SD). ПЖК — подкожно-жировая клетчатка.
Через 6 нед после введения ПМК в концентрации 12,5 мг/мл на уровне дермы и гиподермы эпидермис характеризовался ровной поверхностью, выраженной складчатостью и равномерной толщиной. Толщина дермы была одинаковой. Такое утолщение кожи происходит преимущественно за счет верхних слоев ПЖК. Здесь хорошо видны молодые коллагеновые волокна в виде развитой широкопетлистой сети (окраска по Массону) (рис. 6б). Микросферы PLLA визуализируются в месте введения (см. рис. 6б).
Принципиальных отличий в гистологической картине при введении ПМК в концентрации 6,8 мг/мл не отмечалось.
При более глубоком введении препарата в концентрации 12,5 мг/мл через 6 нед в ПЖК четко визуализировались микросферы ПМК (рис. 7в). Они были окружены соединительной тканью, клеток воспаления не отмечалось. Общая толщина кожи практически не отличалась от контроля, однако верхний слой ПЖК был значительно утолщен с компактно расположенными коллагеновыми волокнами (рис. 7б). В нижнем слое их практически не было.
При введении ПМК в концентрации 6,8 мг/мл гистологическая картина также принципиально не отличалась.
При изучении биоптатов кожи участка после введения PLLA в ПЖК (окраска по Массону) при большом увеличении определялись микросферы ПМК разного диаметра без признаков резорбции (рис. 8). Микросферы были окружены большим количеством эластических волокон и фибробластов, ядра которых имели тенденцию к округлости, что свидетельствует об их активности. Выраженной макрофагальной инфильтрации выявлено не было.
Рис. 8. Гистологическое исследование образца кожи через 6 нед после введения PLLA в ПЖК (окраска по Массону, ×990).
Окраска срезов по Ван Гизону (рис. 9, 10) позволила подтвердить наличие более плотной сети коллагеновых волокон на уровне дермы и ПЖК через 6 нед после введения ПМК по сравнению с фрагментами кожи до инъекций. Принципиальных различий при введении PLLA в разной концентрации также выявлено не было.
Рис. 9. Гистологическое исследование образца интактной кожи и зоны введения PLLA на границе дермы и гиподермы (окраска по Ван Гизону, ×220).
а — интактная кожа; б — через 6 нед после введения PLLA. Коллагеновые волокна окрашены в малиново-красный цвет.
Рис. 10. Гистологическое исследование образца интактной кожи и зоны введения PLLA в гиподерму (окраска по Ван Гизону, ×220).
а — интактная кожа; б — через 6 нед после введения PLLA. Коллагеновые волокна окрашены в малиново-красный цвет.
Таким образом, гистологическое исследование подтвердило процесс активной структурной реорганизации соединительной ткани и накопления коллагеновых волокон в составе дермы и особенно ПЖК через 6 нед после введения ПМК в разной концентрации и на разном уровне.
Обсуждение
Сравнительный анализ данных объективных методов диагностики показывает, что при оценке гистологической картины использование суспензии PLLA в различной концентрации (различном разведении) не выявлено существенных различий стимулирующего действия. Максимальную зону уплотнения коллагеновой сети в поверхностных или глубоких слоях ПЖК определяет различный уровень глубины введения. Полученные данные УЗИ свидетельствуют о том, что максимально выраженные результаты в виде повышения акустической плотности соединительной ткани достигаются при введении препарата, восстановленного в объеме 12 мл (концентрация PLLA 12,5 мг/мл), на уровне границы дермы и гиподермы, а также при введении препарата, восстановленного в объеме 22 мл (концентрация PLLA 6,8 мг/мл), на уровне ПЖК. Полученные данные служат обоснованием для использования готовой суспензии с низкой концентрацией PLLA и ее глубокого введения при коррекции областей тела.
Заключение
Применение PLLA позволяет добиться видимых клинических результатов и обеспечивает прогнозируемый эффект в разведениях, рекомендуемых для практического применения. Настоящим исследованием подтверждена способность PLLA в составе имплантата MiraLine PLLA 28 к стимуляции выработки коллагеновых волокон, что подтверждено данными УЗИ и гистологической диагностикой. Проведенные наблюдения свидетельствуют об эффективности и безопасности применения имплантата MiraLine PLLA 28 для коррекции не только лица, но и тела. Учитывая возрастающий интерес врачей-косметологов к применению препаратов PLLA, целесообразно продолжить изучение их стимулирующего действия, в том числе в составе комбинированных протоколов коррекции инволюционных изменений кожи лица и тела.
Конфликт интересов: С.В. Мураков, А.М. Главнова сотрудничают с компанией ООО «Лотос 288» (Москва, Россия).
Conflict of interest: S.V. Murakov, A.M. Glavnova cooperate with the company Lotos 288, LLC (Moscow, Russia).