Актуальность настоящего исследования обусловлена прежде всего тревожным ростом репродуктивных проблем в браке, являющихся важной составляющей демографических процессов. Среди репродуктивных проблем наиболее распространенным является бесплодие, в структуре причин которого особое место занимает мужской фактор [1, 11]. Вместе с тем патогенез нарушений сперматогенеза на сегодняшний день до конца не изучен. Многочисленными клиническими наблюдениями и экспериментальными исследованиями [2, 10, 13, 14, 16] установлено, что мужские половые клетки обладают высокой чувствительностью к действию разнообразных экзогенных повреждающих факторов, в том числе стрессорных. В настоящее время не вызывает сомнений, что количественные и качественные изменения мужских половых клеток могут служить своеобразным индикатором адаптационных и дезадаптационных процессов, протекающих в организме под влиянием стрессорных факторов.

Цель настоящего исследования — анализ двигательной активности эпидидимальных сперматозоидов половозрелого потомства самок крыс с экспериментальным поражением печени.

Работа выполнена на белых лабораторных крысах Вистар (16 взрослых половозрелых самок) и их половозрелом потомстве (15 крысят). Для достижения поставленной цели у взрослых половозрелых крыс-самок моделировалось хроническое поражение печени мезенхимальной этиологии, для чего им до беременности вводили 20 ЕД активности щелочной фосфатазы [5]. Эту мезенхимальную (М-группа) группу составили 11 крысят на 70-й день постнатального развития из 9 пометов.

Повреждение печени у половозрелых самок крыс верифицировали на основании морфологических (некробиотические изменения гепатоцитов, носящие очаговый характер, дискомплексация гепатоцитов, гиперплазия печеночных макрофагов, расширение синусоидных капилляров, массивная лимфогистиоцитарная периваскулярная инфильтрация портальных трактов, распространяющаяся на периферию долек), иммунологических (высокий титр противопеченочных аутоантител 1:320; 1:640), биохимических (гипергаммаглобулинемия, увеличение активности аланин-, аспартатаминотрансаминаз, содержания билирубина) критериев.

Контрольную группу (К-группа) составили 8 крысят на 70-й день постнатального развития из 8 пометов.

Работа с лабораторными животными проводилась в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (приказ №755 от 12.08.77 МЗ СССР).

Объектом исследования явилось непосредственно 70-дневное потомство самок крыс с экспериментальным поражением гепатобилиарной системы различного генеза.

Зрелые сперматозоиды получали из придатка семенника, разрезая его вдоль в среде дозированного количества 5% раствора глюкозы (в объеме 1 мл), предварительно подогретого до температуры 37 °С. Далее отрезком отмытой резиновой трубки эпидидимис активно перемещали в течение 2 мин для освобождения от части сперматозоидов [4]. Затем в камере Горяева производился подсчет сперматозоидов с учетом характера их подвижности. Подсчет производился в течение 1-го часа через каждые 15 мин, а затем через 30 мин до 240-й минуты включительно. Полученную взвесь эпидидимальных сперматозоидов хранили в термостате при температуре 37 °С. Оценка подвижности проводилась по общепринятой методике 4-балльной оценки сперматозоидов по характеру подвижности [6]: 0 — неподвижные (погибшие), 1 — «дергающиеся» (колебательное, местное движение, когда имеется движение хвоста, но не происходит перемещения сперматозоидов); 2 — слабоподвижные (манежное или круговое прогрессивное движение, при котором сперматозоиды вращаются вокруг своей головки или по небольшому кругу); 3 — прогрессивно-подвижные (прямолинейное поступательное движение со спиральным вращением вокруг своей оси) сперматозоиды. Индекс подвижности сперматозоидов определялся как отношение фертильных (прогрессивно-подвижных и слабоподвижных) и нефертильных (дергающихся и неподвижных) половых клеток.

Кроме того, в полученной эпидидимальной суспензии определялось суммарное количество сперматозоидов в единице объема (1 мл) [9].

Иммобилизационный стресс создавали путем помещения 70-дневных крысят в камеру Когана, где животные находились в положении лежа на спине [3]. Первоначально иммобилизация продолжалась с 10.00 до 15.00 ч. Затем, после 2-часового отдыха животные вновь помещались в камеру на ночь. После отдыха животные в 17.00 ч снова подвергались иммобилизации до утра.

Полученные цифровые данные обрабатывали на компьютере с использованием программы Statistica v.6.0. («Statsoft, Inc».). Учитывая небольшую выборку животных, достоверность полученных результатов определялась при помощи непараметрического метода — критерия Манна—Уитни.

Одним из показателей фертильности спермы является концентрация сперматозоидов. Нами установлено, что у подопытных крысят содержание сперматозоидов в 1 мл клеточной эпидидимальной взвеси снижено (17,15±1,49·106) по сравнению с интактными животными (44,2±3,88 ·106). Под влиянием стрессового воздействия содержание сперматозоидов у всех экспериментальных животных существенно уменьшилось. Так, если исследуемый показатель у интактных крысят, подвергшихся стрессу, составил 13,25±0,02 · 106 (индекс супрессии 40%), то у подопытных крысят — всего 0,29±0,031 · 106 ( индекс супрессии 98,3%).

Среди сперматозоидов интактных крысят 42,98% составила фракция фертильных половых клеток, в том числе 26,45±1,342% прогрессивно-подвижных клеток и 16,53±4,934% слабоподвижных клеток. Под влиянием иммобилизационного стресса у интактных животных фракция фертильных сперматозоидов уменьшилась и составила 13,9%, в том числе 6,05±1,512% прогрессивно-подвижных клеток и 7,85±2,769% слабоподвижных сперматозоидов. Таким образом, под влиянием стрессового воздействия у интактных животных произошло уменьшение числа фертильных сперматозоидов на 67,66%, в том числе фракция прогрессивно-подвижных уменьшилась на 77,13%, а фракция слабоподвижных сократилась на 52,51% от исходного уровня. Аналогичная закономерность выявлена и у подопытных крысят. Так, среди сперматозоидов подопытных животных только 11,37% составила фракция фертильных клеток, в том числе 2,29±0,864% прогрессивно-подвижных спермиев и 9,08±1,178% слабоподвижных клеток. Под влиянием стрессового воздействия у подопытных животных также произошло снижение количества фертильных сперматозоидов до 1,67±0,833%, что на 85,31% меньше исходного уровня. При этом содержание слабоподвижных сперматозоидов уменьшилось на 81,61%, а прогрессивно-подвижные сперматозоиды отсутствовали.

Жизнеспособность сперматозоидов является одним из ведущих показателей фертильности человека. Для оценки жизнеспособности половых клеток проводился анализ содержания различных фракций сперматозоидов с учетом характера их подвижности. Прежде всего нами установлено, что на 15-й минуте наблюдения у интактных крысят содержание прогрессивно-подвижных сперматозоидов снижается до 0,65±0,21%, в то время как у подопытных крысят исследуемая фракция половых клеток полностью отсутствует. При этом у интактных животных, подвергшихся иммобилизационному стрессу, фракция прогрессивно-подвижных сперматозоидов исчезает.

Фракция слабоподвижных сперматозоидов у интактных животных постепенно уменьшается с 16,53±4,934% на 1-й минуте наблюдения до 0,31±0,22% на 120-й минуте (табл. 1).

Аналогичная закономерность выявлена и у подопытных животных. Однако у подопытных крысят сперматозоиды слабоподвижной фракции выявляются только до 45-й минуты наблюдения. В то же время у интактных крысят под влиянием иммобилизационного стресса данная фракция сперматозоидов существенно снижается по сравнению с исходным уровнем (см. табл. 1). При этом слабоподвижные сперматозоиды выявляются только до 75 мин наблюдения (0,13±0,067%).

У потомства самок крыс с мезенхимальным поражением печени, подвергшегося действию иммобилизационного стресса, фракция слабоподвижных сперматозоидов выявляется только на 1-й минуте наблюдения. В процессе наблюдения по мере уменьшения числа фертильных (прогрессивно-подвижных и слабоподвижных) сперматозоидов у интактных и подопытных крысят происходит увеличение содержания фракции нефертильных (дергающихся и неподвижных) сперматозоидов. Так, если у интактных крысят содержание фракции нефертильных сперматозоидов постепенно увеличивается с 57,15±9,123 до 100% на 135-й минуте наблюдения, то у подопытных животных их количество первоначально составляет 88,64±4,763%, затем увеличивается до максимума (100%) на 60-й минуте наблюдения. Обращает на себя внимание, что у подопытных крысят изначально количество нефертильных сперматозоидов (дергающихся и неподвижных) превышает таковое в контроле.

Под влиянием иммобилизационного стресса у экспериментальных животных интактной и опытной групп содержание нефертильных сперматозоидов существенно увеличивается. При этом у интактных крысят изначально исследуемый показатель увеличился на 54,66% и составил 86,1±7,87%, в то время как у подопытных животных число нефертильных сперматозоидов увеличилось на 10,93% и достигло уровня 98,33±1,667%. У интактных крысят, подвергшихся иммобилизационному стрессу, содержание нефертильных сперматозоидов постепенно увеличивается и достигает максимального значения (100%) на 90-й минуте наблюдения, в то время как у подопытных животных этот показатель уже к 15-й минуте достигает 100%.

Нарушение соотношения фертильных и нефертильных половых клеток у экспериментальных животных обусловило изменение индекса подвижности сперматозоидов (табл. 2).

Обращает на себя внимание, что индекс подвижности сперматозоидов у подопытных крысят снижен по сравнению с контрольными животными на всех сроках наблюдения.

Таким образом, полученные результаты позволяют сделать заключение о снижении фертильности потомства самок крыс с экспериментальным поражением гепатобилиарной системы, о чем свидетельствует как уменьшение содержания сперматозоидов, так и снижение их двигательной активности. Вместе с тем полученные результаты указывают на существенное снижение антистрессорной резистентности сперматогенеза у потомства самок крыс с экспериментальным поражением печени.

Известно, что даже кратковременная фиксация в положении лежа на спине является для организма крыс крайне сильным стрессорным фактором. Так, по данным Т.Е. Потемкиной [7], у крыс, подвергшихся стрессовому воздействию, уже через сутки количество сперматозоидов в эякуляте снижается на 62,72%, при этом подвижных клеток не обнаруживается. Установлено, что кортикостероиды, выработка которых резко увеличивается при стрессе, угнетают активность клеток Лейдига, секретирующих тестостерон [12, 15, 17, 18]. Ранее нами было показано, что у потомства самок крыс с экспериментальным поражением гепатобилиарной системы имеет место снижение числа и функциональной активности клеток Лейдига и клеток Сертоли [8]. Вместе с тем, согласно современным представлениям, тестостерон, вырабатываемый клетками Лейдига, диффундирует через базальную мембрану и поступает в клетки Сертоли, где превращается в процессе ароматизации в более активный дегидротестостерон, который затем транспортируется в просвет семенных канальцев и регулирует сперматогенез и спермиогенез. Логично предположить, что под влиянием стрессорного фактора у потомства самок крыс с патологией печени активность клеток Лейдига и сустентоцитов еще больше угнетается под влиянием кортикостероидов, что обусловливает снижение концентрации тестостерона, необходимого для регуляции сперматогенеза. Следствием изменения локального гормонального гомеостаза семенных извитых канальцев явилось выраженное снижение концентрации сперматозоидов и угнетение их двигательной активности.