Сердечно-сосудистые заболевания (ССЗ) атеросклеротического происхождения являются ведущей причиной смерти и нетрудоспособности населения в Российской Федерации [l, 2]. Основными немодифицируемыми факторами риска (ФР) атеросклероза являются мужской пол, возраст и отягощенная наследственность. В последние годы активно изучаются наследственные факторы и маркеры риска развития атеросклероза. Вклад генетических факторов, по данным исследований, проведенных на монозиготных и дизиготных близнецах, варьирует от 30 до 80%. Первые доказательства значимости роли генетических факторов в развитии мультифакториальных заболеваний основывались на демонстрации семейной агрегации, оценке типа наследования и стимулировали исследования по поиску аллелей риска [3, 4]. В настоящее время эта модель опровергается в свете так называемой проблемы потерянной наследственности - почти все, за несколькими исключениями, локусы, выявленные в исследованиях геномных ассоциаций, объясняют лишь малую часть наследственности. Несколько десятков локусов со средним эффектом и средней частотой каждый не могут объяснить имеющиеся проценты риска заболевания в популяции [5].

Часть «потерянной наследственности» может быть отнесена к эпигенетической наследственности, т.е. к наследуемым паттернам экспрессии генов, которая не определяется изменениями в последовательности ДНК [5]. Данный обзор посвящен анализу исследований направленных на изучение эпигенетических механизмов атеросклероза. Выделяют две основные категории эпигенетических модификаций: метилирование ДНК и модификации гистонов. Наиболее изученный эпигенетический механизм у человека - это метилирование цитозинов ДНК, находящихся в контексте CpG динуклеотидов [6, 7].

Метилирование осуществляется ДНК-метилтранс­феразами и приводит к добавлению метильной группы в 5-м положении пиримидинового кольца цитозина. На данный момент известны три ДНК-метилтрансферазы (DNA methyltransferase, DNMT): DNMT1, DNMT3a и DNMT3b. Последние две отвечают за метилирование de novo при эмбриогенезе, в то время как функцией DNMT1 является поддерживание уровня метилирования при митозе [8]. При этом метилирование новой цепи определяется статусом аналогичной реакции в комплементарной матричной цепи [9]. CpG имеют тенденцию к кластеризации в областях, называемых CpG-островами. Около 70% всех промоторов имеют высокое содержание CpG динуклеотидов [10]. Метилирование промоторных областей ассоциируется со стабильной и продолжительной транскрипционной репрессией подконтрольных промотору генов [11]. Такая репрессия может происходить двумя путями. Метилирование цитозина может напрямую блокировать связывание некоторых транскрипционных факторов [9]. Другим способом с помощью которого метилирование ДНК может ингибировать транскрипцию, является рекрутирование белков, связывающих метил-CpG [3] и способных привлекать комплексы, приводящие к модифицированию гистонов, изменению в упаковке хроматина и сайленсингу.

Роль эпигенетических механизмов доказана для ряда заболеваний, в том числе синдрома Ретта и синдрома Беквита-Видеманна [12]. Значительные изменения профиля метилирования ДНК особенно выражены при опухолях [13], а также при таких патологиях, как различные аутоиммунные заболевания [14], метаболический синдром [15] и атеросклероз [16]. Эпигенетическое наследование, по-видимому, в значительной степени отвечает за неучтенную наследственность и фенотипическую разницу между монозиготными близнецами. В настоящее время роль метилирования в патогенезе интенсивно изучается и диагностические подходы на основе дифференциального метилирования активно разрабатываются [17].

Изменения в глобальном уровне метилирования ДНК при атеросклерозе были детектированы для разных тканей и типов клеток - клеток гладких мышц сосудов [18, 19], атеросклеротических бляшек [20] и периферических лейкоцитов крови [21]. Исследование уровня метилирования ДНК клеток крови проводилось на наиболее полных выборках и, учитывая роль лейкоцитов в развитии атеросклероза, исследование уровня метилирования ДНК этих клеток предоставляет важную биологическую информацию для изучения кардиоваскулярных заболеваний.

Считается, что глобальное гипометилирование ДНК является признаком атеросклероза. Такая закономерность впервые была обнаружена при анализе пациентов с инсультом или подтвержденной с помощью ангиографии ишемической болезнью сердца [21]. В этом исследовани также изучалась связь между высоким уровнем гомоцистеина и метилированием ДНК. Гомоцистеин широко признан как независимый маркер развития атеросклероза, однако механизм, с помощью которого он влияет на риск кардиоваскулярных осложнений, недостаточно понятен [22]. В физиологических условиях гомоцистеин находится в обратимом равновесии с S-аденозилго­мо­цистеином, который является эффективным ингибитором ДНК-метилтрансфераз. В работе R. Castro и соавт. [21] было показано, что высокий уровень гомоцистеина и S-аденозилгомоцистеина в крови у больных с выраженным атеросклерозом ассоциирован с глобальным гипометилированием ДНК, которое может быть связано с ингибированием S-аденозилгомоцистеином реакции метилирования ДНК. В другом исследовании [20] гипометилирование ДНК было продемонстрировано в атеросклеротических бляшках человека, а также у мышей, нокаутированных по гену APOE, и в поврежденной интиме аорты кролика. Кроме того, были изучены мыши с мутацией по гену метилентетрагидрофолатредуктазы - фермента, существенного для регенерации S-аденозилметионина, который является донором метильной группы при метилировании ДНК. У таких мышей был существенно повышен уровень гомоцистеина, который коррелировал с глобальным гипометилированием в различных тканях, а также отмечалось повышенное отложение жиров на стенке аорты [23].

Известно, что метилирование ДНК играет важную роль в поддержании стабильности генома путем сайленсинга ретротранспозонов - ретровирус-подобных последовательностей ДНК, способных дуплицировать и интегрировать самих себя по всему геному. Такие ретротранс­позоны, как Alu и LINE-1 интенсивно изучаются в различных эпигенетических исследованиях. Интересно отметить, что в клетках крови у больных с инсультом и ишемической болезнью сердца также детектировано гипометилирование ретротранспозона LINE-1, который занимает около 20% генома [24]. При этом сниженное метилирование LINE-1 оказалось независимым прогностическим фактором кардиоваскулярных заболеваний.

Однако связь атеросклероза и общего уровня метилирования усложняется противоречащими свидетельствами о повышенном глобальном уровне метилирования ДНК крови у больных ишемической болезнью сердца с ангиографически подтвержденным диагнозом [25]. Уровень гиперметилирования оказался более выраженным у пожилых пациентов. В работе М. Ким и соавт. [26] при изучении китайской популяции больных с выраженным атеросклерозом также показано глобальное гиперметилирование Alu-повторов, занимающих около 10% генома. Интересно отметить, что уровень гомоцистеина позитивно коррелировал с уровнем метилирования Alu, что противоречит данным R. Castro [21]. Возможно, это противоречие связано с небольшой величиной выборки у R. Castro, где в каждой группе было порядка 15 человек.

Еще более усложняют анализ роли глобального метилирования ДНК в развитии атеросклероза эксперименты с мышами, у которых произведен нокаут по гену APOE. Эти мыши характеризуются гиперлипидимией и склонны образовывать жировые полоски в аорте уже в 4-недельном возрасте. При этом в тканях аорты для отдельных участков генома было показано как гипометилирование, так и гиперметилирование ДНК. Этот же паттерн, только выраженный в большей степени, был обнаружен у 6-месячных мутантных мышей. Далее авторы продолжили исследование на модельной культуре макрофагов человека THP-1. Они обработали клетки смесями липопротеидов, воспроизводящими их соотношение в крови у нормальных и мутантных мышей. Было показано, что стимуляция клеток атерогенной смесью липопротеидов вызывает значительное гиперметилирование ДНК [27]. Эти данные свидетельствуют, что в отличие от продвинутых стадий атеросклероза, которые характерны, по крайней мере, для представителей европеоидной популяции, скорее глобальным гипометилированием ДНК, при начальных стадиях болезни происходит как гипометилирование, так и гиперметилирование отдельных локусов генома.

Согласно некоторым данным, уровень метилирования падает с возрастом [28]. В одном из исследований было продемонстрировано последовательное снижение среднего уровня метилирования ДНК повторяющихся последовательностей, таких как Alu и LINE-1 в течение 8 лет [29]. В другой работе полногеномный профиль метилирования ДНК клеток крови, полученной с разницей в 11-16 лет при исследовании двух когорт из Исландии и из штата Юта, демонстрирует как повышение, так и понижение уровня метилирования отдельных локусов [30]. При этом возраст не оказал влияния на уровень глобального метилирования. Глобальное гипометилирование ДНК, происходящее с возрастом, может быть ответственно за аберрантную экспрессию генов и вносить вклад в развитие возраст-зависимых заболеваний, в том числе атеросклероза. Важно отметить, что снижение в метилировании Alu и LINE-1 может сопровождаться реактивацией различных групп молчащих генов, которые могут быть ответственны за противоположные эффекты, связанные с риском кардиоваскулярных патологий. Причиной глобального гипометилирования ДНК при атеросклерозе может быть повышенная пролиферация лейкоцитов крови, вызванная продукцией провоспалительных цитокинов или гладкомышечных клеток в атеросклеротических бляшках.

Таким образом, в то время как эпигенетическая регуляция очевидно имеет место при атеросклерозе, пока нет ясности относительно эффектов изменения глобального уровня метилирования ДНК относительно предрасположенности к атеросклерозу.

Эпигенетическая регуляция ряда генов, ответственных за пролиферацию, редокс-гомеостаз, метаболизм и иммунные функции, продемонстрирована при атеросклерозе.

Экстраклеточная супероксиддисмутаза (ec-sod) - один из первых генов, для которого показано, что его экспрессия регулируется посредством метилирования при атеросклерозе [31]. Был охарактеризован CpG-остров, находящийся в кодирующей части этого гена. В то время как ген ec-sod полностью неметилирован в зародышевой линии, при эмбриогенезе происходит его метилирование и инактивация. Было показано, что при атеросклерозе происходит деметилирование CpG-острова, находящегося в начале гена ec-sod. Анализ экспрессии с помощью нозерн-блоттинга свидетельствует о тканеспецифической экспрессии ec-sod в стенке сосудов. Эти результаты согласуются с более ранними данными о том, что экспрессия ec-sod повышается на ранних стадиях атеросклероза, но снижена в прогрессировавших атеросклеротических бляшках. Гипометилирование ec-sod может быть частично связано с повышенной пролиферацией клеток, являющейся характерной чертой атеросклероза [31]. Повышенная экспрессия ec-sod на ранних стадиях атеросклероза может быть связана с ответной реакцией организма на повышенный окислительный стресс.

Оксид азота играет важную роль в защите от кардиоваскулярных заболеваний, регулируя тонус сосудов и кровяное давление, ингибируя агрегацию тромбоцитов и адгезию лейкоцитов, а также предотвращая пролиферацию клеток гладких мышц сосудов [32]. В связи с этим интересно отметить, что эндотелиальная (eNOS) и индуцибельная (iNOS) синтазы оксида азота регулируются эпигенетически. Так, в работе Y. Chan и соавт. [33] продемонстрировано, что в то время как в эндотелиальных клетках промотор eNOS либо неметилирован, либо слабо метилирован, в остальных типах клеток, включая гладкомышечные клетки сосудов, он метилирован в значительной степени [33]. Однако в выраженных атеросклеротических бляшках экспрессия eNOS снижена.

Индуцибельная синтаза оксида азота iNOS, которая не присутствует в эндотелиальных клетках в норме, активно экспрессируется в прогрессирующих атеросклеротических бляшках, содержащих макрофаги, эндотелиальные клетки и клетки интимы, имеющие мезенхимальное происхождение [34]. Интересно отметить, что сайленсинг iNOS в эндотелиальных клетках также определяется метилированием промотора этого гена. Учитывая, что промотор iNOS активируется провоспалительными стимулами (например, липополисахаридом), можно предполагать, что провоспалительный сигналлинг активирует экспрессию iNOS при прогрессирующем атеросклерозе [35].

Известно, что эстрогены являются защитным фактором при атеросклерозе. Так, эстрогеновая терапия, которая была инициирована в течение 10 лет после менопаузы, снижает количество сердечно-сосудистых осложнений [36]. Кроме того, применение эстрогенов снижает толщину стенки каротидных артерий на животных моделях [37]. Эстрогеновые рецепторы ERα и ERβ, являющиеся транскрипционными факторами, экспрессируются как в эндотелиальных, так и в гладкомышечных клетках сосудов и могут опосредовать кардиопротекторный эффект эстрогенов [38]. Центральная роль ERα в формировании и регуляции эндотелиальных прогениторных клеток может частично объяснять усиленную прогрессию атеросклероза у мужчин с полиморфизмами/мутациями в этом гене [39]. Экспрессия ERα регулируется эпигенетически и снижается с возрастом. Так, показано, что степень метилирования гена ERα хотя и варьирует в разных тканях сосудов, возрастное увеличение степени метилирования происходит в правом предсердии. Кроме того, метилирование гена усилено в атеросклеротических бляшках [40]. Важно отметить, что эстрогены напрямую ингибируют пролиферацию гладкомышечных клеток сосудов. В связи с этим было продемонстрировано, что метилирование и сайленсинг гена ERα происходят селективно в дедифференцированных и активно пролиферирующих гладкомышечных клетках сосудов, находящихся в атеросклеротических бляшках [41].

Экспрессия ERβ во всех трех слоях стенки сосуда превышала экспрессию ERα. При этом количество ERβ в значительной степени коррелирует с количественными показателями развития атеросклероза - площадью бляшки и площадью кальцификации. При этом экспрессия ERβ не коррелирует с возрастом [42]. Интересно отметить, что метилирование промотора ERβ в бляшках значительно более выражено, чем в непораженных участках. Связь экспрессии и метилирования в этом случае еще предстоит выяснить.

Одним из белков, вовлеченных в развитие атеросклероза, является p66shc. Это адапторный белок, играющий важную роль в регуляции продукции активных форм кислорода. Делеция p66shc у мышей предотвращает развитие эндотелиальной дисфункции [43], а также атеросклероза, вызванного жирной диетой [44]. Генетический нокдаун p66shc повышал активность eNOS и улучшал зависимое от эндотелия расширение сосудов [45]. На культуре клеток эндотелия было показано, что гомоцистеин стимулирует деметилирование гена p66shc и усиливает его транскрипцию. При этом нокдаун p66shc ингибирует повышение активных форм кислорода и снижение продукции оксида азота, вызванные гомоцистеином. В подтверждение предыдущим данным уровень гомоцистеина в плазме крови обратно ассоциирован с метилированием промотора p66shc в периферических лимфоцитах крови у больных атеросклерозом [46]. В другой работе этих же авторов [47] показано, что липопротеиды низкой плотности также стимулируют экспрессию p66shc через гипометилирование его промотора в культуре эндотелиальных клеток человека. При этом p66shc опосредует адгезию моноцитов к эндотелиальным клеткам.

Таким образом, приведены данные о нескольких генах, играющих определенную роль в развитии атеросклероза, экспрессия которых регулируется путем метилирования. Поиск всего спектра генов, которые могут регулироваться эпигенетическими механизмами, является важной задачей будущих исследований.

Одной из первых работ, в которой применили методы полногеномного анализа для поиска эпигенетической компоненты в атеросклерозе, стала работа М.С. Назаренко и соавт. [48]. Анализ профиля метилирования ДНК был проведен с помощью микрочипа Infinium Human Methylation27 BeadChip («Illumina») для образцов тканей из сонной, внутренней грудной артерий, а также большой подкожной вены нижней конечности у девяти мужчин с выраженным атеросклерозом. В качестве контроля брали неизмененную прилежащую стенку сонной артерии. Было показано дифференциальное метилирование для 314 CpG из 286 генов. Наиболее выраженными были гипометилирование гомеобоксных генов HOXA2, HOXD4 и белка, относящемуся к суперсемейству α/β-гидролаз MEST в бляшках, выделенных из сонных артерий.

В другой работе [49] исследовали профиль метилирования в атеросклеротических бляшках коронарных артерий 45 больных. В качестве контроля брали фрагменты аорты больных без атеросклероза коронарных артерий. Для анализа 10 367 CpG-островов использовали микрочипы HCG115K, разработанные в UHN Microarray Centre: 115 CpG-островов оказались гипометилированы при атеросклерозе, в то время как 17 - гиперметилированы. Около 40% дифференциально метилированных генов кодировали регуляторные белки. В целом эти транскрипционные факторы и сигнальные белки вовлечены в регуляцию ангиогенеза, модуляцию фенотипа гладкомышечных клеток сосудов и воспаление. К этим белкам относятся гомеобоксные белки HOXC и HOXD10, промотирующие ремоделлинг сосудов и ингибирующие ангиогенез во взрослом возрасте, соответственно. Кроме того, была показана активация еще двух генов, вовлеченных в ангиогенез - NOTCH1, EGFL7 - и инактивация гена VASH2, участвующего в ингибировании ангиогенеза во взрослом возрасте. Также было обнаружено снижение экспрессии транскрипционного фактора FOXP1, вовлеченного в ингибирование активации макрофагов.

Этот обзор написан с целью дать краткое и необходимое описание эпигенетических механизмов, связанных с метилированием ДНК, которые могут играть роль в развитии атеросклероза. На данный момент эта область находится только в начале своего развития. Оценки связи глобального уровня метилирования ДНК и рисков развития атеросклероза противоречивы. Для небольшого набора генов, роль которых в развитии атеросклероза установлена, показано, что их регуляция происходит посредством метилирования ДНК. В дополнение к существующим в ближайшее время появятся новые полногеномные исследования профиля метилирования ДНК, однако роль отдельных генов предстоит тщательно проверять на различных моделях организмов. Понимание роли эпигенетических механизмов может дать ответ о роли средовых факторов, объяснить часть «неучтенной генетической компоненты» в развитии атеросклероза, а также открыть путь к созданию новых подходов к терапии этого заболевания.

Конфликт интересов отсутствует.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования - А.М., Е.Г.

Сбор и обработка материала, написание текста - Е.Г.

Редактирование - А.М.