Введение
В организме взрослого человека постоянно протекают два альтернативных, но взаимодополняющих процесса костного ремоделирования: разрушение костной ткани остеокластами и созидание нового матрикса остеобластами. Остеоремоделирование направлено на приспособление кости к функциональным нагрузкам, усиление их прочности, улучшение архитектоники и устранение повреждений костной ткани [1]. Более мобильная и менее продолжительная по времени резорбция кости является стимулом к активации продолжительного остеогенеза. Оcтеорезорбция осуществляется за счет остеокластов, активность которых регулируется гормонами, факторами роста, витаминами и в том числе провоспалительными цитокинами (трансформирующий ростовой фактор-a, фактор некроза опухоли-a, интерлейкин-1, интерлейкин-6) [2, 3]. Интерлейкин-6 (ИЛ-6) является мощным стимулятором трансформации преостеокласта в остеокласт. На плазматической мембране преостеокласта находятся два типа рецепторов к ИЛ-6. После связывания ИЛ-6 со специфическими рецепторами преостеокласта посредством задействования системы RANKL-RANK активируются механизмы остеокластогенеза [4]. Активация остеокластов сопровождается выраженным синтезом и секрецией в резорбтивную ямку, образованную мембраной остеокласта и костью, протеолитических ферментов (катепсина К, тартратрезистентной кислой фосфатазы). За счет ферментов происходит деградация минеральной и коллагеновой составляющих кости [5]. Следовательно, накопление ИЛ-6 в десневой жидкости является стимулом к активации остеорезорбции [6, 7]. Одновременное определение в жидкости зубодесневой борозды провоспалительного цитокина и маркера остеорезорбции при различных патологических процессах в полости рта позволит выявить остеоиммунологические аспекты взаимовлияния двух процессов — воспаления и деструкции в костной ткани при стоматологической патологии различного генеза. Остеорезорбция альвеолярного отростка челюстей является ключевым патоморфологическим субстратом при периимплантитах, хроническом пародонтите, раке альвеолярного отростка челюсти [8—10]. Насколько убыль костной ткани индуцирована накоплением провоспалительного цитокина при формировании периимплантационного кармана, пародонтального кармана и опухолевой деструкции при раке альвеолярного отростка / альвеолярной части челюстей в сравнительном аспекте и существуют ли особенности остеоиммунологических аспектов при каждом из заболеваний, неизвестно. Оcтеоиммунологические аспекты деструкции костной ткани при каждом из заболеваний изучаются отдельно [11], без учета генеза повреждения, что снижает клиническую значимость научных работ.
Цель исследования — изучить взаимосвязи между концентрацией провоспалительного цитокина интерлейкина-6 и маркера активации остеокластов катепсина К в десневой жидкости при остеорезорбции воспалительного (периимплантит, хронический генерализованный пародонтит) и злокачественного онкологического генеза (рак челюсти).
Материал и методы
Исследование было одобрено Локальным независимым этическим комитетом ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр стоматологии и челюстно-лицевой хирургии» Минздрава России и этическим комитетом ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр онкологии» Минздрава России.
Клиническая часть работы была проведена совместно: в ФГБУ «НМИЦ СЧЛХ» Минздрава России и ФГБУ «НМИЦО» Минздрава России. Всего в работе принимали участие 87 человек обоего пола в возрасте от 30 до 60 лет.
20 пациентов (1-я группа) с периимплантитом были обследованы на базе отделения имплантологии, 45 пациентов — на базе отделения терапевтической стоматологии ФГБУ «НМИЦ СЧЛХ» Минздрава России. Из 45 терапевтических пациентов 30 человек наблюдались с диагнозом хронический генерализованный пародонтит (ХГП) и составили 2-ю группу, а 15 человек представляли собой практически здоровые лица без патологии пародонта, которые вошли в группу контроля.
На базе ФГБУ «НМИЦО» Минздрава России были обследованы 22 пациента с плоскоклеточным раком верхнего и нижнего альвеолярного отростка / альвеолярной части и десны, которые составили 3-ю группу.
Стоматологическое обследование всех пациентов проходило по стандартному протоколу с определением глубины пародонтальных или периимплантационных карманов, дефектов костной ткани согласно нозологии.
Критерии включения пациентов в 1-ю группу были следующими: дентальный периимплантит (МКБ К05.3) I и II степени; возраст больных 30—60 лет.
При формировании 2-й группы учитывали следующие критерии включения: ХГП легкой и средней степени (МКБ К05.31); возраст больных 30—60 лет.
При формировании 3-й группы критериями включения были: рак верхнего и нижнего альвеолярного отростка и десны (МКБ10 С03.0-С03.1); возраст больных до 60 лет включительно; отсутствие до момента исследования специализированного лечения онкологического заболевания.
Критериями исключения из 1-й и 2-й групп явились: пациенты с глубиной периимплантационных или пародонтальных карманов ≥6 мм, а также в стадии обострения; с тяжелой общесоматической патологией — ВИЧ, СПИД, онкологические заболевания; пациенты, системно принимающие медикаментозные препараты общего или местного действия, в том числе стероидные или нестероидные противовоспалительные, антибиотики, антимикробные препараты; беременность или период лактации.
Критерии исключения больных из 3-й группы: наличие тяжелой сопутствующей патологии с декомпенсацией дыхательной, сердечно-сосудистой и мочевыделительной систем.
Группа контроля из 15 практически здоровых лиц (8 мужчин и 7 женщин) без патологии пародонта в возрасте 40—60 лет была сформирована для определения контрольных значений иммунологических показателей.
Всем пациентам были разъяснены цель и задачи исследования в устном и письменном виде. Пациенты, согласившиеся принять участие в исследовании, подписывали форму добровольного информированного согласия на проведение исследования.
Средний возраст пациентов 1-й группы составлял 45,8±2,24 года (медиана 46 лет), 2-й группы — 48,05±0,54 года (медиана 49 лет), 3-й группы — 53,2±2,5 года (медиана 51 год). В 1-ю группу вошли 14 (70%) женщин и 6 (30%) мужчин. Во 2-ю группу вошли 17 женщин (56,7%) и 13 (43,3%) мужчин, в 3-ю группу 15 мужчин (68%) и 7 (32%) женщин.
В 1-й группе чаще устанавливали внутрикостные дентальные имплантаты системы Astra Tech (n=13, 65%). У остального числа больных использовали имплантаты системы Thommen Medical (n=7, 35%). Длина имплантатов колебалась от 3,8 до 4,5 мм, высота имплантатов варьировала от 6 до 11 мм.
Пациенты 2-й группы с ХГП в зависимости от глубины пародонтальных карманов (ПК) были разделены на две подгруппы: с легкой степенью — 27 пациентов (45%), со средней степенью — 33 (55%).
В 3-ю группу больных с диагнозом рак верхнего или нижнего альвеолярного отростка и десны включали пациентов со стадией Т1-2N0M0. Размер первичной опухоли составлял от 2 до 4 см.
Лабораторную часть исследования проводили при помощи иммуноферментного анализа. В качестве исследуемого материала использовали десневую жидкость или содержимое периимплантационных или пародонтальных карманов. Сбор жидкости осуществляли при помощи стерильных бумажных эндодонтических штифтов размером №25, помещая его в карман или зубодесневую борозду при помощи пинцета не менее чем на 10 секунд на максимальную глубину. Объем жидкости определяли по разнице весов бумажного штифта до и после сорбции экссудата.
Содержание ИЛ-6 в десневой жидкости определяли методом иммуноферментного анализа с помощью тест-системы «ИЛ-6-ИФА-БЕСТ» (ЗАО «ВЕКТОР-БЕСТ», Новосибирск), а катепсина К с помощью набора реактивов Cathepsin K (CTSK) (Human) ELISA Kit (Cloud-Clone Corp., США). Использовали фотометр «Multiscan-Р 2» (Thermo Fisher Scientifi c Inc., Финляндия) при длине волны 450 нм.
Статистический анализ результатов исследования проводился с помощью программы Statistica 12.0 (StatSoft Inc., США) и применением теста на нормальность с использованием критерия Шапиро—Уилка, описательной статистики, дисперсионного анализа, корреляционного анализа, ROC-анализа.
Результаты и обсуждение
При клиническом стоматологическом осмотре у пациентов 1-й группы с периимплантитом отмечали наличие отека, кровоточивости, гиперемии, грануляций в периимплантационных мягких тканях. Глубина периимплантационных карманов колебалась от 3 до 6 мм, в среднем 4,9±0,3 мм. На рентгенологических снимках отмечали резорбцию костной ткани в пределах 1/3—1/2 длины имплантата. Во 2-й группе глубина пародонтальных карманов у пациентов с ХГП соответствовала тяжести воспалительных изменений пародонта и в целом по группе составляла 4,08±0,18 мм (при легкой — 2,85±0,17 мм и средней степени тяжести заболевания — 5,09±0,14 мм). У пациентов 3-й группы деструкция альвеолярного отростка/части имела форму краевых дефектов с неправильными очертаниями корытовидной, полуовальной и географической формы с нечеткими, неровными, «изъеденными» контурами. Длинник краевых дефектов челюсти превышал глубину поражения. Костная ткань дефектов была остеопорозна, на рентгенограммах около зубов имелись просветления. Верхушки межальвеолярных перегородок были поражены у всех больных 3-й группы, отсутствовало соответствие краевой узуры кости всей поверхности лунок.
Содержание провоспалительного цитокина ИЛ-6 у пациентов 1-й группы в содержимом периимплантационного кармана (25,34±1,51 пг/мл) и во 2-й группе в жидкости пародонтального кармана (29,14±2,53 пг/мл) многократно возрастало (p<0,001) относительно контрольного параметра у здоровых доноров без стоматологических заболеваний (2,39±0,42 пг/мл) (табл. 1). ИЛ-6 способен непосредственно индуцировать дифференцировку предшественников остеокластов или стимулировать стромальные клетки для производства RANKL с последующей активацией остеокластов [6, 12], обеспечивая воспалительно-индуцированную убыль костной ткани. У больных 3-й группы при злокачественном онкологическом заболевании содержание ИЛ-6 в десневой жидкости (13,72±1,51 пг/мл) было повышенным относительно контроля (p<0,001), однако по сравнению с аналогичным показателем в 1-й и 2-й группах уровень был ниже (p<0,001). ИЛ-6 наряду с другими цитокинами (ИЛ-11, лейкоз-ингибирующий фактор, онкостатин М, цилиарный нейротрофический фактор, кардиотрофин-1) при онкологических заболеваниях играет важную роль в регуляции сложных клеточных процессов, таких как активация генов, пролиферация и дифференцировка клеток [12]. Цитокины обмениваются друг с другом и клетками сигналами через активацию Jak киназ и транскрипционные факторы семейства STAT [6]. Сигнал от ИЛ-6 опосредуется через уникальную систему ИЛ-6-рецептора из двух функциональных мембранных протеинов: лиганд-связывающей цепи и несвязывающей-лиганд цепи, передающей сигнал (гликопротеин 130 — gp130) [13]. Связывание ИЛ-6 с соответствующими рецепторами преостеокласта способствует трансформации его в остеокласт посредством механизма RANKL-RANK.
Таблица 1. Концентрация ИЛ-6 и катепсина К в десневой жидкости и параметры корреляции между показателями у пациентов клинических групп
Table 1. The concentration of IL-6 and cathepsin K in the gingival fluid and the correlation between the parameters in patients of clinical groups
| Группа | Стат. величина | ИЛ-6, пг/мл | Катепсин К, пмоль/л | Коэффициент корреляции, р |
| 1-я (n=20) | M±m | 25,34±1,51 | 4,72±0,43 | R=0,71; p=0,004 |
| Me [25—75] | 24,4 [16,4—29,7] | 4,9 [2,5—5,9] | ||
| 2-я (n=30) | M±m | 29,14±2,53 | 2,78±0,26 | R=0,85; p=0,001 |
| Me [25—75] | 28,5 [13,5—35,7 | 2,7 [1,6—3,8] | ||
| 3-я (n=22) | M±m | 13,72±1,51 | 11,36±0,58 | R=0,57; p=0,03 |
| Me [25—75] | 12,8 [10,1—15,9] | 11,8 [6,7—14,3] | ||
| Контроль (n=15) | M±m | 2,39±0,42 | 1,71±0,34 | R=0,23; p=0,24 |
| Me [25—75] | 2,2 [1,6—3,0] | 1,8 [1,4—2,5] | ||
| р | р1-к, 2-к,3-к<0,001 р1—2=0,03 р1—3, 2—3<0,001 рмн<0,001 | р1-к, 3-к<0,001 р2-к=0,03 р1—2=0,02 р1—3, 2—3<0,001 рмн<0,001 |
Примечание. Me — медиана, [25—75] — межквартильный диапазон, при дисперсионном анализе использовали критерий Краскела—Уоллиса и Манна—Уитни, поправочный коэффициент на число сравниваемых пар Бонферрони, pмн — доверительная вероятность сравнения всех групп.
В сравнительном аспекте провоспалительный цитокин ИЛ-6 в десневой жидкости относительно контроля у здоровых доноров был многократно превышен (p<0,001) у пациентов 2-й группы с ХГП (в 12,2 раза) и 1-й группы с периимплантитом (в 10,6 раза) (рис. 1). У онкологических больных кратность превышения изучаемого показателя относительно нормального уровня была 5,7 раза (p<0,001) (рис. 1). Следовательно, локальное накопление провоспалительного цитокина ИЛ-6 было более выраженным при формировании пародонтального кармана у пациентов с ХГП.
Рис. 1. Кратность изменения ИЛ-6 в десневой жидкости у пациентов клинических групп по отношению к контрольной величине показателя у здоровых доноров.
* — изменения статистически значимы при p<0,05.
Fig. 1. The multiplicity of changes in IL-6 in the gingival fluid in patients of clinical groups in relation to the control value in healthy donors.
* — changes are statistically significant at p<0.05.
В качестве маркера активированных остеокластов в работе исследовали концентрацию катепсина К. При активации остеокластов происходит выделение в межклеточное пространство протеолитических ферментов, в том числе катепсина К, лизирующего матричные белки. В результате в костной ткани образуются резорбционные полости [14]. Таким образом, катепсин К, с одной стороны, является индикатором активности остеокластов, а с другой, принимает непосредственное участие в остеорезорбции — гидролизе фосфопротеинов, сиалопротеинов. Научно-практический интерес к лабораторным маркерам воспаления и костного ремоделирования в зубодесневой области как неинвазивным методам обследования стоматологических больных усиливается ввиду совершенствования и внедрения аналитических технологий лабораторной диагностики. Существуют сложности при биохимическом исследовании активности катепсина К, связанные с нестабильностью фермента из-за действия тканевых ингибиторов. Разработанная тест-система на основе иммуноферментного анализа позволила обойти аналитические биохимические проблемы и точно определить концентрацию фермента в биологической среде полости рта.
У здоровых доноров в десневой жидкости концентрация катепсина К составила 1,71±0,34 пмоль/л (табл. 1). В 1-й группе в содержимом периимплантационной борозды содержание катепсина К (4,72±0,43 пмоль/л) возрастало по сравнению с контролем в 2,8 раза (p<0,001) (рис. 2). Во 2-й группе в жидкости пародонтального кармана при ХГП (2,78±0,26 пмоль/л) изучаемый маркер остеорезорбции по сравнению с контрольным значением возрастал умеренно на 60% (p=0,03) (рис. 2). Многократное превышение концентрации катепсина К в десневой жидкости при раке альвеолярных отростков/части (11,36±0,58 пмоль/л) было установлено как относительно контрольного параметра у здоровых доноров, так и по сравнению с пациентами 1-й и 2-й групп. Таким образом, определение остеомаркера катепсина К в десневой жидкости, впервые реализованное в биологических средах полости рта, позволило определить норму лабораторного показателя, а также дать оценку изменения концентрации катепсина К при различной стоматологической патологии, злокачественном новообразовании, сопоставить показатель с клиническим симптомом остеорезорбции различного генеза, что раскрыло диагностическую информативность маркера. В исследовании было установлено, что маркер остеорезорбции катепсин К в большей мере накапливался в десневой жидкости при остеодеструкции онкологического генеза по сравнению с воспалительно-деструктивными процессами в 1-й и 2-й группах. При воспалительно-деструктивных процессах у пациентов с периимплантитом и ХГП маркер остеорезорбции накапливался в очаге поражения в большей мере в периимплантационной области.
Рис. 2. Кратность изменения катепсина К в десневой жидкости у пациентов клинических групп по отношению к контрольной величине показателя у здоровых доноров.
* — изменения статистически значимы.
Fig. 2. The multiplicity of changes in cathepsin K in the gingival fluid in patients of clinical groups in relation to the control value in healthy donors.
* — changes are statistically significant.
При изучении корреляционной связи между концентрацией ИЛ-6 и катепсина К в десневой жидкости наиболее тесная связь была установлена во 2-й группе в содержимом пародонтального кармана (R=0,85; p=0,001) (табл. 1). Тесная, но менее выраженная связь между изучаемыми воспалительным и остеотропным медиаторами была выявлена в содержимом периимплантационного кармана (R=0,71; p=0,004) (табл. 1). Связь между концентрацией ИЛ-6 и катепсина К в десневой жидкости при раке альвеолярных отростков / альвеолярной части и десны была умеренной (R=0,57; p=0,03) (табл. 1). Следовательно, при ХГП и периимплантите накопление ИЛ-6 в содержимом кармана явилось патогенетическим фактором. При раке альвеолярных отростков повышение концентрации ИЛ-6 в десневой жидкости хотя и способствовало активации остеокластов и секреции протеолитических ферментов, но не было ведущим фактором, способствующим развитию остеодеструкции. Между тем, накопление протеолитических ферментов, секретируемых остеокластами, при злокачественном новообразовании носило лавинообразный характер.
На следующем этапе с помощью ROC-анализа определяли разделительный уровень для изучаемых медиаторов, превышение которого сопряжено для пациентов с разными стоматологическими заболеваниями с прогрессией остеорезорбции альвеолярных отростков/альвеолярной части челюстей. У пациентов 1-й группы потерю костной ткани более 25% от длины имплантата, наличие периимплантационных карманов более 4 мм ранжировали как 1, в остальных случаях пациентам присваивали ранг 0. Во 2-й группе при ХГП ранг 1 получали пациенты с глубиной пародонтальных карманов 3—6 мм, а ранг 0 — при глубине карманов до 3 мм. При плоскоклеточной опухоли альвеолярных отростков/альвеолярной части в начальной стадии своего развития рак распространялся только в мягких тканях, рентгеновских признаков остеодеструкции не было (ранг 0). Часто опухолевое поражение слизистой оболочки альвеолярного отростка принимают за ограниченный хронический воспалительный процесс пародонта, производят удаление подвижного зуба, выскабливание выбухающих из лунки «грануляций», что сопровождается быстрым ростом опухоли. Далее опухоль распространяется в подлежащую костную ткань (ранг 1). С помощью ROC-анализа были найдены дифференциально разделительные концентрации медиаторов (cut-off), превышение уровня которых позволило сформировать прогноз формирования и прогрессии остеодеструктивных очагов альвеолярных отростков (табл. 2).
Таблица 2. Разделительные концентрации cut-off медиаторов ИЛ-6 и катепсина К в десневой жидкости для прогнозирования развития остеодеструкции различного происхождения
Table 2. Dividing points cut-off concentrations of IL-6 and cathepsin K in the gingival fluid to predict the development of osteodestruction of various origins
| Показатель | Группа | Точка cut-off | DSe | DSp | OR | AUC | p |
| ИЛ-6, пг/мл | 1 | 17,6 | 74,6 | 79,3 | 5,2 | 0,762±0,012 | 0,0004 |
| 2 | 14,9 | 87,9 | 88,4 | 9,6 | 0,897±0,006 | <0,0001 | |
| Катепсин К, пкмоль/л | 1 | 2,8 | 70,9 | 71,5 | 3,8 | 0,674±0,021 | 0,006 |
| 3 | 3,9 | 85,8 | 90,5 | 10,4 | 0,904±0,025 | <0,0001 |
Примечание. cut-off — точка разделения, DSe — диагностическая чувствительность, DSp — диагностическая специфичность, OR — отношение шансов, AUC — площадь под кривой ROC, p — доверительная вероятность.
У пациентов с периимплантитом при превышении в содержимом периимплантационных карманов концентрации ИЛ-6 уровня 17,6 пг/мл (диагностическая чувствительность 74,6%, специфичность 79,3%), а концентрации катепсина К выше 2,8 пмоль/л (диагностическая чувствительность 70,9%, специфичность 71,5%) прогнозируют прогрессивную убыль костной ткани. У пациентов с ХГП прогностическая ценность выявлена только у ИЛ-6. При превышении концентрации ИЛ-6 в содержимом пародонтальных карманов при ХГП выше 14,9 пг/мл шанс формирования остеодеструкции увеличивался в 9,6 раза (p<0,0001). У больных раком альвеолярных отростков/альвеолярной части и десен прогноз распространения опухоли на костную ткань с ее деструкцией повышался в 10,4 раза (p<0,0001) при превышении концентрации катепсина К в десневой жидкости уровня 3,9 пмоль/л. Высокая прогностическая информативность была характерна в большей мере для пациентов с ХГП и у онкологических больных, поскольку площадь под ROC-кривой имела высокие значения.
Выводы
1. При ХГП и периимплантите накопление ИЛ-6 в содержимом пародонтальных и периимплантационных карманов является патогенетическим фактором для активации остеокластов и секреции ими протеолитических ферментов остеорезорбции.
2. При раке альвеолярных отростков / альвеолярной части челюстей прирост маркера остеорезорбции катепсина К многократно превышает накопление ИЛ-6 в десневой жидкости, что снижает зависимость активации остеокластов от локального накопления провоспалительных цитокинов.
3. Для формирования прогноза прогрессивной убыли костной ткани у пациентов с периимплантитом необходимо контролировать в периимплантационном кармане концентрацию ИЛ-6 и катепсина К, при ХГП — концентрацию ИЛ-6 в содержимом пародонтального кармана, а у больных раком альвеолярных отростков / альвеолярной части — содержание катепсина К десневой жидкости.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов
The authors declare no conflict of interests.