Развитие нового направления современной стоматологии — реконструктивно-пластической хирургии полости рта — определило высокие эстетические и функциональные требования к проведению оперативных вмешательств на мягких тканях и слизистой оболочке, выполнение которых зависит не только от мастерства хирурга, но и от средств, оказывающих влияние на состояние постоперационной раны [1].

Раневой процесс в полости рта протекает сложно и непредсказуемо. Все хирургические раны на невоспаленных тканях в полости рта являются первично инфицированными [2]. Не представляется возможным полностью изолировать раневую поверхность от влияния механических, химических и физических факторов, что нарушает нормальный ход регенераторного процесса и приводит к развитию осложнений в послеоперационном периоде [3, 4]. Таким образом, актуальным является поиск новых методов и средств, стимулирующих регенерацию тканей в области раневой поверхности слизистой оболочки полости рта.

В настоящее время значительно расширился диапазон применения современного метода лечения — фотодинамической терапии (ФДТ). Механизм ее действия основан на взаимодействии оптического излучения с определенной длиной волны и фармакологического препарата — фотосенсибилизатора (ФС), который применяется системно или местно и способен накапливаться преимущественно в патологически измененных тканях. После фотоактивации происходит переход ФС в возбужденное состояние, что приводит к запуску фотодинамической реакции с образованием свободных радикальных соединений, в том числе и синглетного кислорода. Возникает каскад фотохимических реакций, ведущий к разрушению мембранных структур клетки и нарушению механизмов, отвечающих за пролиферацию и процессы биосинтеза [5]. Непосредственное цитотоксическое действие, а также сосудистые и иммунные механизмы объясняют активное применение ФДТ при широком спектре заболеваний в качестве противоопухолевого, антимикробного и противовоспалительного методов лечения [6, 7].

Одним из направлений дальнейшего развития ФДТ являются обоснования новых показаний к ее применению. Модификация параметров процедуры ФДТ, в частности, изменение плотности энергии, мощности, использование нестандартных длин волн в качестве альтернативного или комплементарного светового воздействия, позволит получить иные эффекты. Проводимые в последние годы исследования показали, что снижение плотности энергии по сравнению с обычно используемым при лечении злокачественных опухолей приводит к снижению количества повреждающих факторов и способствует стимуляции репаративных процессов и регенерации тканей и органов [8]. Фотодинамическая стимуляция регенерации применяется в фундаментальных научных исследованиях, реконструктивно-пластической и регенеративной медицине в качестве метода лечения возрастных измнений кожи, а также для стимуляции процессов заживления [9]. Представленные научные исследования позволили нам предположить наличие выявленного эффекта при применении ФДТ с целью активации и стимуляции регенерации раневого процесса на слизистой оболочке полости рта [10]. Однако в первую очередь перед нами встал вопрос о выборе оптимального режима ФДТ для исключения повреждающего действия активных форм кислорода (АФК), в том числе синглетного кислорода, которые являются продуктами фотодинамической реакции [11].

В последнее время большое внимание уделяется изучению процесса свободно-радикального окисления белков — окислительной модификации белков (ОМБ), опосредуемой их взаимодействием с АФК, продуктами перекисного окисления липидов (ПОЛ). Высокоактивные радикальные соединения, образующиеся на всех стадиях реакций ОМБ, также способны к генерации новых радикалов, что обеспечивает каскадный процесс окисления. Существует предположение, что в процесс свободно-радикального окисления в первую очередь вовлекаются белки клеточных мембран. Высокая специфичность и стабильность продуктов ОМБ, как и продуктов ПОЛ, определяет возможность их использования в качестве биомаркеров интенсивности протекания окислительных процессов [12].

Поддержание интенсивности свободно-радикальных процессов на постоянном физиологически важном внутриклеточном уровне обеспечивается активностью многокомпонентной антиоксидантной системы (АОС) защиты организма, представленной ферментативным и неферментативным звеньями. Ферментативная АОС включает несколько соединений, работающих преимущественно в комплексе в ходе реакций восстановления кислорода. Так, супероксиддисмутаза (СОД) — единственный антиоксидантный фермент, обрывающий цепи кислородзависимых реакций. Ее синергистом в клетке является каталаза. Она препятствует накоплению перекиси водорода, катализируя ее восстановление до воды, и тем самым исключая образование активных инициаторов свободно-радикального окисления. В АОС защиты работают и вспомогательные ферменты, такие как глутатионредуктаза (ГР). Она катализирует восстановление окисленного глутатиона. В невозбужденном состоянии он является донором электронов и активным центром глутатионпероксидазы, основного фермента, сдерживающего накопление перекисей липидов.

В случае, когда генерация свободных радикалов значительно превосходит защитные возможности АОС, развивается окислительный стресс. Повреждающее действие продуктами свободно-радикального окисления вызывает нарушение структурно-функционального состояния клеточных мембран [13, 14]. Про-антиоксидантный баланс способствует стабилизации регенераторных механизмов в сторону более благоприятной динамики течения раневого процесса. Таким образом, выбор оптимального режима воздействия, позволяющий поддерживать этот баланс, является важной детерминантой в ведении раневой поверхности с использованием ФДТ.

Цель исследования — изучить состояние про-антиоксидантного баланса гомогенатов тканей раневой поверхности в полости рта в эксперименте in vivo при фотодинамическом воздействии комбинированного двухволнового излучения для исключения его повреждающего влияния на структуры клеточных мембран.

Материал и методы

Экспериментальное исследование проводилось на базе вивария Университетской клинки ФГБОУ ВО «ПИМУ» Минздрава России. Лабораторные исследования осуществлялась на кафедре Клинической лабораторной диагностики ФДПО и отдела физико-химических исследований ЦНИЛ ПИМУ. В ходе научно-исследовательской работы были использованы половозрелые женские аутбредные особи крыс стока линии Wistar (n=72), весом 200—250 г.

Исследование было выполнено в соответствии с руководством ARRIVE (Animal Research: Reporting of In Vivo Experiments) [15] и правилами работы с животными на основе положений Хельсинкской декларации и рекомендаций, содержащихся в Директиве ЕС 86/609/ECC и Конвенции Совета Европы по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей. Протокол экспериментального исследования с участием животных одобрен и утвержден Локальным этическим комитетом ФГБОУ ВО «ПИМУ» Минздрава России (протокол №14 от 17.07.19).

В работе использовался аппарат фотодинамический светодиодный АФС «Гармония» (ООО «Лазер-Медцентр», Россия). В качестве ФС в исследовании был взят препарат «Гелеофор» на основе натурального производного хлорофилла — хлорина Е6 (ООО «Лазер-Медцентр», Россия).

Под общей анестезией с применением препаратов «Золетил 100» (Virbac, Франция) в дозировке 60 мг/кг и «Ксила» (Pharmamagist Ltd., Венгрия) — 6 мг/кг внутримышечно у животных были смоделированы экспериментальные раневые поверхности. Все особи были разделены на две группы: контрольную (n=36) и экспериментальную (n=36). На слизистую оболочку щек животных наносили дефекты круглой формы 3 мм в диаметре с помощью устройства для биопсии кожи EPITHEASY (Medax S.r.l., Италия) (рис. 1). Полученные образцы неизмененной ткани отправляли в лабораторию с целью получения биохимических показателей до воздействия.

Рис. 1. Экспериментальная модель раневой поверхности.

В обеих группах раневая поверхность заживала вторичным натяжением. В отличие от контрольной в экспериментальной группе на 1-е послеоперационные сутки проводилось однократное фотодинамическое воздействие при предварительном локальном нанесении ФС с экспозицией 30 мин и облучении последовательно на двух длинах волн с суммарной дозой 15 Дж/см²: длина волны — 660 нм, плотность энергии (Е) — 7,5 Дж/см²; плотность мощности излучения — 0,2 Вт/см², продолжительность воздействия (t) — 37,5 с; длина волны — 405 нм, Е — 7,5 Дж/см²; плотность мощности излучения — 0,1 Вт/см², t — 75 с. Выбор данного режима воздействия обусловлен результатами наших предыдущих исследований [10].

Сроки наблюдения составили 3, 7 и 14 сут. Забор материала на этапах выполнялся аналогичным устройством для биопсии большего диаметра (5 мм), что позволило полностью иссечь ткани раневой поверхности. Полученные биоптаты подвергались дополнительной механической обработке до образования гомогената ткани, являющегося объектом для дальнейших лабораторных исследований. Выведение животных из эксперимента осуществлялось в вышеуказанные сроки путем декапитации.

С целью определения состояния про- и антиоксидантного потенциала ткани в течение раневого процесса были применены методы индуцированной биохемилюминисценции, определения уровня продуктов липопероксидации клеточных мембран, степени ОМБ и уровня активности ферментов АОС-защиты.

Для регистрации индуцированной биохемилюминесценции использовали аппарат биохемилюминометр БХЛ-07 (Нижний Новгород, Россия), сопряженный с компьютером IBMPC/AT в диалоговом режиме; спектрофотометр СФ 2000 (ОКБ «Спектр» Россия), биохимический анализатор Stat Fax 1904 (США). Анализировали следующие параметры:

— индекс Imax, мВ — максимальная интенсивность свечения, показывающая потенциальную способность биологической системы к свободно-радикальному окислению;

— индекс S, мВ/30 с — светосумма хемилюминесценции за 30 с — величина, отражающая содержание свободных радикалов, соответствующая обрыву цепи СРО и поэтому обратно пропорциональная общей антиоксидантной активности;

— Z, относительные единицы (отн. ед.) — показатель уровня работы общей АОС защиты, равный отношению индексов S и Imax [16].

При определении уровня продуктов липопероксидации клеточных мембран учитывались следующие показатели: содержание диеновых конъюгатов (ДК), триеновых конъюгатов (ТК) и оснований Шиффа (ОШ). Расчеты представлялись в отн. ед. Направленность процессов окисления в субстратах оценивалась по уровню коэффициента окисления Ко, выражающегося в отн. ед. и рассчитывающегося по формуле: ОШ/ДК +ТК [17].

Степень ОМБ определялась по уровню карбонильных производных. ОМБ образуются при окислении свободными радикалами отдельных группировок в аминокислотах. Продуктами этой реакции являются альдегидные и кетонные группировки аминокислотных остатков, так называемые карбонильные группы. Полученные данные выражали в единицах оптической плотности на 1 г общего белка [18].

Изучение активности ферментов АОС защиты — СОД, каталазы и ГР — проводили с использованием спектрофотометрических методов, основанных на окислительно-восстановительных реакциях с участием субклеточных фракций, содержащих ферменты. Активность СОД выражали в % ингибирования, каталазы — в мкмоль H₂O₂ и ГР — в мкмоль НАДФН за 1 мин на 1 г ткани [19—20].

Обработку полученных данных проводили общепринятыми методами статистики с помощью пакета прикладных программ Statistica 10.0 (StatSoft Inc., США). Расчет показателей выполнен в средних значениях (M) и ошибки среднеквадратического отклонения (σ). Оценку достоверности результатов проводили с использованием t-критерия Стьюдента для параметрических методов исследования и малых выборок. Достоверными считали различия при уровне значимости p≤0,05.

Результаты и обсуждение

При макроскопическом исследовании раневой поверхности перед иссечением на 3-и сутки в экспериментальной группе определялись умеренная гиперемия без признаков кровоточивости и слабый отек окружающих мягких тканей. Края раны гладкие и неприподнятые, неровные и четкие. В эти же сроки в группе контроля наблюдались отек и гиперемия раны, кровоточивость при зондировании. Местами отмечалось присутствие белесоватого фибринозного налета с приподнятыми краями раны (рис. 2).

Рис. ٢. Состояние раневой поверхности на ٣-и сутки исследования.

а — экспериментальная группа; б — контрольная группа.

На 7-е сутки исследования в экспериментальной группе животных новообразованная слизистая оболочка в полости рта была физиологической окраски, гладкая, блестящая, без признаков отека окружающих тканей. В контрольной группе рана сохранялась и имела гиперемированную поверхность, неровные, четкие и неприподнятые края (рис. 3).

Рис. ٣. Состояние раневой поверхности на ٧-е сутки исследования.

а — экспериментальная группа; б — контрольная группа.

Полная эпителизация ран в контрольной группе животных была отмечена на 14-е сутки. Причем в отличие от экспериментальной группы здесь присутствовала умеренная гиперемия в зоне раневой поверхности (рис. 4).

Рис. 4. Состояние раневой поверхности на 14-е сутки исследования в контрольной группе животных.

В результате анализа параметров хемилюминограммы Imax и S было установлено снижение интенсивности процессов свободно-радикальных процессов в тканях в экспериментальной группе. В обеих группах животных на 3-и сутки отмечалось снижение данных показателей в среднем в 2 раза. Далее в группе ФДТ отмечалось резкое падение показателя Imax в 28 раз на 7-е сутки наблюдения по сравнению с исходными данными. В контрольной группе схожих изменений отмечено не было (рис. 5). Подобная динамика характерна для показателя индекса S. Это может быть связано с изменением качественного состава биоптата, а именно с повышением в тканях уровня содержания липидов, являющихся субстратом для процессов свободно-радикального окисления.

Рис. 5. Значение индекса Imax, mv (M±σ).

* — различия статистически значимы по сравнению с нормой (p≤05); ^а — различия статистически значимы по сравнению с контролем (p≤05).

При анализе содержания ОМБ было установлено, что в контрольной группе животных к 3-м суткам количество ОМБ снижается, а к 14-м восстанавливается до исходного уровня. Однако в экспериментальной группе в это же время отмечается статистически значимое повышение показателей по сравнению с исходным уровнем и контрольной группой. Такой результат может свидетельствовать о восстановлении тканей с большим количеством белка.

Величина показателя Z по сравнению со значениями до нанесения раны в контрольной группе к 14-м суткам снизилась в 3,3 раза, в то же самое время в экспериментальной группе наблюдалось такое же уменьшение показателя на 3-и сутки (рис. 6). Затем он продолжал постепенно снижаться и оставался ниже, чем в контрольной группе, что свидетельствовало о постепенном повышении активности АОС защиты и коррелировало с результатами изучения антиоксидантной активности ферментов (СОД, каталазы, ГР).

Рис. 6. Значение показателя Z, отн. ед. (M±σ).

* — различия статистически значимы по сравнению с нормой (p≤05); ^а — различия статистически значимы по сравнению с контролем (p≤05).

С показателями свободно-радикального окисления совпадали изменения в уровнях содержания молекулярных продуктов ПОЛ. Содержание первичных молекулярных продуктов — ДК и ТК — уменьшалось в обеих группах и к 14-м суткам зафиксировано резкое падение их уровня. В экспериментальной группе показатель ДК снизился в 26,8 раз и ТК в 280 раз, а в контрольной, соответственно, в 5,9 и в 3,3 раза по сравнению с исходным уровнем.

Наиболее интересны результаты анализа уровня содержания ОШ: наблюдалось его статистически значимое снижение в обеих группах. Но наиболее выраженным оно было в экспериментальной группе на 14-е сутки исследования. Наблюдалось уменьшение содержания продуктов в 28 раз, при этом в контрольной группе оно было выше в 5 раз, чем в экспериментальной (рис. 7). Это можно расценить как эффективное воздействие ФДТ на мембраны клеток, так как ОШ являются токсичными жесткими продуктами, повреждающими клеточные мембраны.

Рис. 7. Уровень содержания ОШ, отн. ед. (M±σ).

* — различия статистически значимы по сравнению с нормой (p≤05); ^а — различия статистически значимы по сравнению с контролем (p≤05).

Одновременно происходило повышение коэффициента Ко в экспериментальной группе к 14-м суткам в 1,7 раза. В то же самое время в контрольной группе он приближался к исходному значению (рис. 8). При низких уровнях ДК и ТК это свидетельствует о снижении интенсивности свободно-радикальных реакций в экспериментальной группе животных.

Рис. 8. Значение коэффициента Ко, отн. ед. (M±σ).

* — различия статистически значимы по сравнению с нормой (p≤05); ^а — различия статистически значимы по сравнению с контролем (p≤05).

Выраженные и статистически значимые различия в показателях свободно-радикального и перекисного окисления объясняются активацией антиоксидантных ферментов. В контрольной группе животных уровень активности ферментов статистически значимо не отличался от исходного состояния. В экспериментальной группе животных, напротив, наблюдалось повышение их активности. Активность СОД увеличивалась по сравнению с исходным состоянием в 1,8 раз и по сравнению с контрольной группой — в 1,5 раза, и на 14-е сутки возвращалась к исходному значению (рис. 9). Анализ полученных результатов показал схожую динамику в изменении уровней активности фермента ГР и работающего в паре с СОД фермента каталазы. Активность ГР и каталазы возрастала, соответственно, в 0,7 раз и в 1,7 раза на 7-е сутки, а к 14-м суткам активность каталазы приближалась к исходному состоянию, а ГР оставалась на повышенном уровне.

Рис. 9. Показатель активности СОД, % ингибирования/мин·мг белка (M±σ).

* — различия статистически значимы по сравнению с нормой (p≤05); ^а — различия статистически значимы по сравнению с контролем (p≤05).

Заключение

Проведенное нами экспериментальное исследование состояния про-антиоксидантного баланса тканей раневой поверхности в полости рта in vivo при ФДТ свидетельствует об активации АОС защиты и снижении интенсивности свободно-радикальных реакций в гомогенатах тканей животных, что подтверждает безопасность и низкую инвазивность при использовании предлагаемой методики. Особенность реагирования первичных продуктов ПОЛ (ДК и ТК), вероятнее всего, связана с их преобразованием во вторичные продукты, повреждающие мембраны клеток, что подтверждается уровнем содержания ОШ. Однако он снижается постепенно по мере заживления раны статистически более значимо в экспериментальной группе животных по сравнению с контролем, что свидетельствует об отсутствии активного свободно-радикального окисления на фоне используемых характеристик фотодинамического воздействия. Подтверждением этого установленного факта является и динамика индекса Ко.

Изучение интенсивности окисления белков клеточных мембран является важным критерием безопасности терапии, так как именно эти продукты, находясь на наружной поверхности клеточных мембран, первыми встречают на своем пути свободные радикалы кислорода при ФДТ. Можно предположить, что образование ОМБ запускается в ответ на фотодинамическое воздействие и имеет накопительный эффект. В свою очередь, ОМБ могут служить триггером для регенераторных процессов в тканях и коллагенообразования. Для подтверждения этой гипотезы требуется дополнительное проведение совместного анализа клинических и гистологических исследований тканей раневой поверхности в эксперименте in vivo. Однако уже на данном этапе не вызывает сомнений, что ФДТ при выбранных параметрах воздействия демонстрирует безопасность и низкую инвазивность на слизистой оболочке полости рта. На сохранение высокого уровня антиоксидантной защиты тканей указывает динамика местного антиоксидантного потенциала, характеризующаяся Z-параметром и уровнем активности ферментов (СОД, каталазы и ГР), что, в свою очередь, позволяет контролировать интенсивность окисления в ране.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflict of interests.