Проблема установления прижизненности и давности механических повреждений (ДМП) остается в числе актуальных в судебной медицине. Как известно, классические гистологические методы, служащие базой экспертной оценки ДМП, имеют значительные недостатки [1]. Так, в частности, в ранние сроки, до 3-5 ч после травмы, ориентируются по выраженности и характеру кровоизлияний, по сосудистой реакции и выраженности ранних экссудативных реакций, оценка которых неточная и часто субъективная. В сроки от 5-7 ч до 2-3 сут ДМП оценивают по интенсивности преимущественно клеточной реакции и реже по степени некротических изменений тканей. Их оценка малообъективна. Наконец, в срок от 1 нед до 1 мес ДМП определить точно весьма затруднительно, так как в этот период преобладают макрофагальная реакция, ранний фибро- и ангиогенез (развитие грануляционной ткани). Возраст этих процессов установить трудно, тем более давность созревающего рубца. Значительные сложности для определения давности травмы возникают, если смерть наступила в так называемые «немые дни» посттравматического периода. Это сроки, при которых качественных изменений реактивных процессов при стандартном гистологическом исследовании не отмечается. Такая ситуация наблюдается при дальнейшем течении травмы на 4-6-е и 8-14-е сутки после травмы [1].

Существенную помощь в уточнении давности травмы могут оказать современные методы иммуногистохимии (ИГХ).

ИГХ - это совокупность разнообразных методов, позволяющих проводить иммунологический анализ срезов тканей или цитологического материала. Исследования с применением ИГХ - относительно новое направление судебно-медицинской гистологии как прикладной дисциплины в рамках судебной медицины. Метод основан на обнаружении в тканях тех или иных антигенов с помощью специфических антител [2].

Методики ИГХ в странах с высокоразвитой морфологической диагностикой являются обязательной частью многих исследований. Например, их используют в онкоморфологии, так как только они обеспечивают специфическую визуализацию локализации в тканях различных клеток, их рецепторов, ферментов, иммуноглобулинов, компонентов клеточного цитоскелета (сократительные и промежуточные филаменты) и даже отдельных генов. С помощью таких методик изучают секреторные, экссудативные и репаративные процессы.

При проведении иммуногистохимических реакций возможно применение моно- и поликлональных антител.

Поликлональные антисыворотки, получаемые при иммунизации животных, обычно кроликов, коз или овец, содержат антитела к различным эпитопам иммуногена. Наиболее важным преимуществом поликлональной антисыворотки является то, что она образует крупные нерастворимые, интенсивно окрашивающиеся при иммуногистохимическом исследовании комплексы с антигеном благодаря одновременному связыванию антител с многими эпитопами антигена, вследствие чего они менее чувствительны к конформационным изменениям антигена. Недостатки использования поликлональных антисывороток - их меньшая специфичность и возможность так называемых перекрестных реакций.

Моноклональные антитела продуцируются в большом количестве одиночными клонами клеток гибридомы. Они идентичны по молекулярной организации, специфичности и сродству к антигену. Гомогенность моноклональных антител делает предсказуемой их концентрацию, что обеспечивает более высокую воспроизводимость результатов, а высокая специфичность делает возможной идентификацию антигена в смеси похожих по структуре антигенов. Антитела связываются только с одним участком молекулы антигена. Это обусловливает невысокую чувствительность метода, проявляющуюся в слабом иммуноокрашивании на срезах, к тому же при единственном эпитопе высока вероятность того, что фиксатор сделает его недоступным для антител, в результате чего не произойдет реакции.

Необходимым этапом применения любого метода ИГХ является визуализация результатов реакции антиген-антитело. Выявить антитела, связавшиеся с антигеном, можно, используя различные метки, связанные с Fc-фрагментом антител. Такими метками могут быть ферменты, флюорохромы, металлы и металлопротеиды, радиоизотопы, промежуточные связующие вещества, например биотин, дигоксин.

Данные метки могут быть присоединены как к первичным антителам (прямой метод), так и к вторичным (непрямой метод).

Методы ИГХ предназначены для исследования процессов, происходящих в организме на молекулярном уровне. От гистохимических они отличаются высокой специфичностью, возможностью визуализации распределения исследуемого вещества в тканевых и клеточных структурах и его полуколичественного определения в них. Таким образом, метод подобен применяемым в судебной биологии реакции иммунофлюоресценции и иммуноферментному анализу, хотя имеет ярко выраженную структурно-локализационную направленность [3]. Благодаря современным методам обработки материала не существует никаких серьезных препятствий для применения ИГХ в судебно-медицинских целях, исключая случаи далеко зашедших гнилостных изменений, при которых грубо и необратимо разрушается антигенная специфичность клеток [3].

Метод ИГХ может существенно помочь в установлении прижизненности и давности повреждений. При всяком повреждении в самые первые минуты происходит активация эндотелия посткапиллярных венул и запускается гуморальный каскад ранних фаз так называемого экссудативно-деструктивного воспаления. Выявление его медиаторов с помощью ИГХ может свидетельствовать как о прижизненности, так и о небольшой давности повреждения. Такими медиаторами являются интерлейкины, компоненты системы комплемента, эйкозаноиды и плазменные ранние компоненты экссудата (фибриноген, плазмин, фибронектин и др.). Ранние медиаторные процессы (активация системы комплемента, повышение экспрессии интерлейкинов, биогенных аминов, модуляции в системе селектинов и др.) в зоне повреждения, а также ранние этапы экссудации плазменных белков и гликопротеинов возможны только при наличии гемоциркуляции, что позволяет принципиально решать вопросы прижизненности травмы. Выявление с помощью ИГХ соответствующих веществ должно дать более достоверные результаты, чем применявшиеся ранее гистологические, биохимические и гистохимические методы, не учитывающие распределение веществ в тканях либо не позволяющие точно идентифицировать выявляемые субстанции и получать воспроизводимые результаты.

Обзорные методические публикации, посвященные применению метода ИГХ в судебной медицине, практически отсутствуют. Исключением является работа A.M. Хромовой и Ю.П. Калинина из Казани [3]. Такие исследования ведутся и, в частности, для решения вопроса прижизненности и давности повреждений.

J. Dressler и соавт. [4, 5] решили эту задачу, используя ИГХ для количественного определения клеточных адгезивных молекул (cell adhesion molecules - CAMs) лейкоцитов и эндотелиальных рецепторов к ним в тканях кожных ран. Эти белки определяют краевое стояние лейкоцитов в сосудах и их прохождение через стенку последних. Экспрессия CAMs в различные сроки после повреждений достоверно различается.

Установить прижизненность и давность черепно-мозговой травмы на ранних сроках может помочь определение экспрессии так называемых ранних генов. Такие гены кодируют факторы транскрипции, т.е. обеспечивают последующий синтез таких белков-медиаторов воспаления, как фактор роста нервов, глиальный фибриллярный кислый белок - ГФКБ и др. Экспрессия этих генов в поврежденных тканях возрастает уже в первые минуты после травмы [6].

Из отечественных работ необходимо отметить статью А.М. Хромовой [7] о Р-селектине как маркере ранней прижизненной реакции в поврежденных мягких тканях. Р-селектин образуется в клетках эндотелия и содержится в них в неактивной форме в тельцах Вейбеля-Паладе. При повреждении тканей медиаторы (гистамин, тромбин и др.) вызывают быстрый выход Р-селектина на поверхность эндотелиальных клеток, где он участвует в адгезии и миграции лейкоцитов и может быть выявлен с помощью ИГХ. Положительная реакция на Р-селектин отмечается уже в первые 2-3 мин после травмы, достигает максимума через 1-2 ч и сохраняется до 6 ч от момента травмы, что позволяет использовать ее для установления как прижизненного характера травматизации, так и давности повреждения.

Примером использования ИГХ в процессе уточнения танатогенеза и давности нанесения повреждений может быть наше наблюдение асфиксии, в котором решали вопрос о ее характере - самоповешение или относительно длительное удавление твердым тупым предметом. Следственные и макроскопические экспертные данные допускали оба варианта. При гистологическом исследовании препаратов легких погибшей обратили внимание на очень густой эозинофильный характер транссудата, расположенного очагово в альвеолах легких на фоне типичной для асфиксии иррегулярной альвеолярной легочной эмфиземы. Применив ИГХ-окраску на фибриноген, установили, что необычный характер транссудата объясняется именно наличием в нем предшественника фибрина. Следовательно, имел место ранний респираторный дистресс-синдром, характерный в большей степени для пролонгированной механической асфиксии. Во взятом для сравнения материале из наблюдения кардиогенного отека легких примеси фибриногена к транссудату не выявили.

А. Fieguth и соавт. [8] предложили способ установления прижизненности странгуляции, используя методики ИГХ для обнаружения миоглобина и фибронектина в тканях шеи, подвергшихся сдавлению. Маркеры длительности странгуляции до сих пор не разработаны.

Плазменный субстрат (фибриноген) выявляют в сосудах и с меньшей экспрессией периваскулярно в зоне прижизненных повреждений мягких тканей при наступлении смерти в первые минуты после травмы, чего не наблюдается при посмертных повреждениях. Таким образом, обнаружение экспрессии плазменных субстратов в зоне повреждения свидетельствует о сохранении кровотока и, следовательно, о прижизненности травмы. В подобных случаях не наблюдается достоверных признаков прижизненности при окраске рутинными методиками.

Другим примером может служить наше пилотное исследование давности повреждений с использованием относительно небольшой панели антител. Так, при ИГХ-анализе гистологического материала, полученного из поврежденных тканей различной давности, отмечали следующее: раннюю экссудацию фибриногена при смерти в ближайшем посттравматическом периоде; виментин как верификатор деструкции жировой ткани; постепенное нарастание экспрессии лимфоцитарных маркеров по мере увеличения посттравматического периода.

R. Hansmann и соавт. [9] изучали давность травмы, используя определение экспрессии маркера p53. Эффективность этого маркера оказалась особенно высока в фазу пролиферации, когда другие методы малоинформативны.

Г.М. Харин и соавт. [10, 11] в коже из области раны исследовали экспрессию ядерного антигена пролиферирующих клеток (PCNA), маркеров апоптоза кератиноцитов и клеток соединительной ткани. Авторы показали, что интенсивность пролиферации и запрограммированной гибели клеток в зоне репаративной регенерации кожи отражает давность причинения повреждений.

Исследования апоптоза заслуживают более широкого применения в судебно-медицинской практике: например, при оценке давности повреждения мозга. В настоящее время выделяют как минимум 3 типа гибели нервных клеток при повреждении: онкоз (самый быстрый вид смерти с резким энергетическим дефицитом, нарушениями водно-электролитного баланса, набуханием и лизисом клетки), ишемический тип (более медленный, с не столь резким дефицитом энергии) и апоптоз - запрограммированную клеточную гибель, требующую для своего развития наибольшего времени [12]. Первые 2 типа легко распознаются при окраске нервных клеток по Нисслю и даже гематоксилином и эозином, но апоптоз требует применения ИГХ [13]. По его интенсивности можно судить о давности травмы.

Имеется множество других, помимо упомянутых, факторов, регулирующих пролиферацию: фактор стимуляции фибробластов, трансформирующие ростовые факторы, фактор некроза опухолей, кадгерин и т.д. Данные об использовании их в судебной медицине при ИГХ в литературе не обнаружены. Это же касается маркера фибробластов - β-субъединицы пролил-4-гидроксилазы, который мог бы помочь более полно оценить динамику репаративной регенерации [14].

Большое внимание за рубежом уделяют исследованию так называемых белков теплового шока (heat shock protein - HSP), которые образуются в тканях в ответ на любой стресс и оказывают защитное действие, стабилизируя цитоскелет [15]. Различные повреждающие факторы вызывают образование разных белков теплового шока, причем различается не только их молекулярная масса, но и их защитный эффект: одни белки являются нейропротекторами, другие - кардиопротекторами и т.д. Соответственно в разных органах синтезируются различные белки [16, 17]. Эти данные нашли применение в зарубежной судебной медицине. ИГХ-исследование белка теплового шока убиквитина (ubiquitin) в среднем мозге показало, что увеличение его содержания в ядрах нейронов черной субстанции может служить признаком прижизненности ожоговой травмы и доказательством, что смерть наступила именно от нее, а не от другой травмы или кардиальной патологии [18]. Количественное определение белков теплового шока в первые 2 сут после травмы может помочь более точно установить давность повреждения [19].

Средние сроки от 5-7 ч до 2-3 дней могут быть уточнены с помощью обнаружения маркеров клеток инфильтрата - лейкоцитов, в том числе нейтрофильных и мононуклеарных. В эти сроки развертывается картина экссудативно-деструктивного воспаления с богатыми межклеточными взаимодействиями, уловить структуру которых можно, используя ИГХ (определяя содержание интерлейкинов, изучая ростовые факторы, факторы раннего ангиогенеза, факторы, тормозящие миграцию, и многие другие).

М. Oehmichen [20] исследовал методами ИГХ экспрессию маркеров различных клеток воспаления вокруг кровоизлияний на протяжении до 48 ч после травмы кожи (например, макрофагов - по антигену CD68). Это позволило достоверно оценить не только виды, но и количество различных клеток, в том числе тех, которые невозможно дифференцировать при световой микроскопии. По их данным, количество Т-лимфоцитов в краях раны со временем снижается, а предшественников миелоцитов нарастает.

Другим направлением ИГХ-исследований реакций организма на травму является изучение различных субпопуляций лимфоцитов. В 2005 г. В.П. Новоселов и соавт. [21] предложили использовать в судебной медицине методики ИГХ, позволяющие выявлять лейкоцитарные антигены: CD3 (Т-лимфоциты вообще), CD4 (Т-лимфоциты-хелперы) и CD20 (В-лимфоциты). Это дало возможность более дифференцированно оценить клеточные реакции, а следовательно, получить более полную информацию для определения давности образования повреждения селезенки.

Также при исследовании с помощью ИГХ реакций организма на травму известно, что эндотелиальный фактор роста сосудов (Vascular Endothelial Growth Factor - VEGF) - главный фактор ангиогенеза, индуцирующий пролиферацию эндотелиоцитов, усиленно экспрессируется на клеточных мембранах на 2-4-е сутки после травмы [22].

В поздние сроки преобладают явления пролиферации. Формируются грануляционая ткань и рубец. Период созревания последнего является одним из наиболее сложных для определения давности травмы. В это время целесообразно оценивать состояние экстрацеллюлярного матрикса соединительной ткани, который в ходе созревания рубца претерпевает закономерные изменения.

Приблизиться к решению рассматриваемой нами задачи можно посредством количественного ИГХ-исследования межклеточного матрикса. Р. Betz и соавт. [23] использовали определение наличия в тканях компонентов соединительной ткани (ламинин и гепаран-сульфат), а также экспрессии различных видов коллагенов. Компоненты соединительной ткани появляются в зоне травмы через 5 сут, максимальное содержание их в тканях наступает к 7-му дню после травмы, затем стабилизируется и постепенно сходит на нет.

В России метод ИГХ для решения судебно-медицинских задач впервые применили в 1998 г. авторы настоящего сообщения [24]. Они предложили определять давность образования рубцов по экспрессии различных типов коллагенов с помощью антител. Установили, что в процессе созревания рубца экспрессия основных типов коллагена и наличие в тканях некоторых плазменных гликопротеинов закономерно изменяются со временем, что создает возможность достоверного решения вопроса о давности травмы. Зарубежных аналогов этого метода обнаружить не удалось.

Успешным примером использования методов ИГХ в поздний период травмы является исследование М.Н. Меджидова и одного из авторов настоящего сообщения [25].

В этом исследовании показана возможность установления давности повреждения слизистой оболочки рта по спектру коллагенов и иммуноглобулинов, содержанию фибрина и фибронектина, а также маркеров Т-лимфоцитов-хелперов и макрофагов.

Заслуживают внимания исследования динамики репарации в артериальных протезах, которые могут стать теоретической базой для судебно-медицинского установления давности повреждения сосудов по спектру коллагенов, наличию фибронектина, ламинина, виментина и антигенов сократительных волокон гладкомышечных клеток [26-28]. В гранулирующей ране за счет базальных мембран многочисленных сосудов преобладает коллаген IV типа, в незрелом рубце содержится много фибронектина и других плазменных белков, преобладает коллаген III типа (иногда также V типа), по мере созревания увеличивается содержание коллагена I типа и уменьшается IV типа вследствие редукции сосудистого русла [24].

В поздние сроки (от 1 нед до 1 мес) давности повреждения мозга высокоинформативно исследование глиальной реакции. Реакция олигодендроглии определяется по степени и распространенности экспрессии миелин/олигодендроглиоцитарного специфического белка [29], реакция астроглии - по экспрессии в ней виментина и глиального фибриллярного кислого белка (ГФКБ, GFAP) [30, 31]. Виментин - это промежуточный филамент, характерный в основном для незрелых клеток, ГФКБ - тоже промежуточный филамент, но характерный для зрелых астроцитов [32]. Исследования этих веществ показали, что в число реакций на выявление травмы входит не пролиферация глиальных клеток, как полагали раньше, а созревание предшественников астроглиоцитов [32, 33]. Нарастание экспрессии в реактивных глиоцитах указанных белков может использоваться для оценки давности травмы.

О давности повреждения мозга можно судить также по интенсивности потери нейронами составных частей цитоскелета [34].

Более современные молекулярно-биологические методы основаны не на выявлении самого исследуемого вещества, а на установлении наличия и степени экспрессии генов, отвечающих за его синтез. Для этого гистологические препараты исследуют методами молекулярной генетики, применяя, в частности, гибридизацию in situ для идентификации исследуемых специфических последовательностей ДНК или РНК и выяснения их распределения в тканях [14].

Все новейшие методы ДНК-анализа находят применение в современной патологии. Новая молекулярная техника, объединившая высокую чувствительность полимеразной цепной реакции (ПЦР) и клеточную локализацию последовательностей, выявляемых гибридизацией in situ, получила название ПЦР in situ. Расшифровка полной геномной последовательности человека и других видов живых организмов привела к постепенному развитию и внедрению метода, основанного на сиквенс-анализе (определение последовательности) генов [35].

Таким образом, скорейшее внедрение методов ИГХ в науку и практику судебно-медицинской экспертизы позволит ответить на большое количество вопросов, многие из которых сегодня остаются без внятного высокоаргументируемого ответа.