KO — номенклатура KEGG Orthology

АБП — алкогольная болезнь печени

АЦП — алкогольный цирроз печени

ГГТП — γ-глутамилтранспептидаза

МБ — микробиота

ЦП — цирроз печени

Россия, по данным ВОЗ, занимает четвертое место по уровню потребления алкоголя, измеряемого в литрах чистого этилового спирта (этанола) на душу населения [1]. Алкоголь является вторым по частоте этиологическим фактором (20—25%) цирроза печени (ЦП) после вирусного гепатита С, служа причиной около 50% всех госпитализаций среди пациентов с Ц.П. Следовательно, выявление дополнительных прогностических маркеров развития ЦП на фоне хронического употребления алкоголя со временем приобретает все большую актуальность.

Хроническое злоупотребление алкоголем является необходимым, но недостаточным фактором для развития алкогольной болезни печени (АБП). ЦП развивается у 10—15% больных, страдающих алкоголизмом [2]. Какую роль в патогенезе АБП играет кишечная микробиота (МБ)? Предполагается, что эндотоксины — части внешних мембран клеточных стенок грамотрицательных бактерий — участвуют в поражении печеночной ткани: уровень эндотоксина в сыворотке крови коррелирует с тяжестью АБП (наблюдается увеличение уровня эндотоксина у людей с АБП). В норме кишечная стенка препятствует попаданию эндотоксинов в кровоток, но ацетальдегид — промежуточный продукт метаболизма этанола увеличивает проницаемость кишечной стенки путем перераспределения белков плотного контакта (белок Zonula occludens 1-го типа) и белков адгезионного контакта (кадгерины, катенины) в результате приводит к эндотоксемии. Распознание эндотоксинов TLR4-рецепторами на поверхности макрофагов и других клеток печени ведет к включению нисходящих сигнальных путей, отвечающих за активацию транскрипционных факторов, таких как ядерный фактор κВ и активатор протеина-1. Затем начинают усиленно синтезироваться провоспалительные цитокины и оксиданты, такие как α-фактор некроза опухоли, интерлейкин-6, уровень которых прямо пропорционален воспалению и развитию фиброза. Снижение уровня эндотоксинов после антибиотикотерапии, приема пре- и пробиотиков улучшает индуцированное этанолом поражение печени у крыс [3].

Развитие высокопроизводительных молекулярно-генетических методов анализа микробных сообществ за последние годы позволило детально исследовать состав МБ человека. Одно из наиболее перспективных из них — метагеномное ДНК-секвенирование, наиболее распространенным форматом которого является секвенирование последовательностей генов 16S рРНК. Данный подход позволяет количественно охарактеризовать таксономический состав МБ, включая некультивируемые виды. То, что более половины кишечных видов не поддаются традиционным методам культивирования, а также высокая производительность при умеренной стоимости сделало секвенирование последовательностей генов 16S рРНК важным инструментом биомедицинских исследований МБ человека при различных заболеваниях.

С помощью этого формата секвенирования, а также метода полимеразной цепной реакции в реальном времени в ряде исследований идентифицированы количественные и качественные изменения состава МБ, ассоциированные с алкоголизмом и нарушениями функций печени. Согласно одному из исследований хронический прием алкоголя сопровождается дисбактериозом, который заключается в увеличении числа протеобактерий (отдел Proteobacteria) по сравнению с бактероидами (отдел Bacteroidetes) [4]. Существуют данные о корреляции степени дисбактериоза и стадии АБП. В кале пациентов с ЦП выявлено преобладание патогенных Enterobacteriaceae, сопровождающееся уменьшением числа представителей нормальной микрофлоры (семейства Clostridiales incertae sedis XIV, Ruminococcaceae, Lachnospiraceae); последние являются важными производителями короткоцепочечных жирных кислот и препятствуют синдрому избыточного роста бактерий [5]. Среди других описанных ранее изменений таксономического состава МБ при алкоголизме — повышение представленности таксонов Proteobacteria [6], Gammaproteobacteria [7], Bacilli (Enterocuccus, Lactobacillus) [7], Escherichiacoli, Staphylococcus [8], а также понижение Clostridia [6], Bacteroidetes [7], пробиотических Lactobacillus и Bifidobacterium, семейства Ruminococcaceae (в том числе Faecalibacterium, ассоциированных с противовоспалительной активностью) [9].

Современный подход к исследованию кишечной МБ — метагеномное секвенирование образца кала в полногеномном формате позволяет оценить не только таксономический состав МБ на уровне видов, родов и т. п., но и функциональный на уровне генов, специфических функциональных групп генов и метаболических путей. Это позволяет оценить изменения метаболического потенциала всей МБ в отношении тех или иных функций — деградации полисахаридов, синтеза витаминов и др. Недавно в этом формате проведено обследование 98 пациентов с ЦП; классификация на основании 15 микробных генов позволила отличить пациентов с ЦП от здоровых индивидуумов [10].

МБ кишечника — метаболически активная часть системы человек—М.Б. Помимо основных функций, таких как расщепление неперевариваемых человеком полисахаридов, многими исследователями отмечено, что кишечные бактерии могут производить (обычные сбраживатели [11]), а также метаболизировать этанол до ацетальдегида, а некоторые из них (Lactobacillus и Bifidobacterium) — до ацетил-КоА (показано in vitro для 8 выделенных из кишечника штаммов [12]). Таким образом, представляет интерес изучение роли вклада микробов кишечника в переработку или, наоборот, производство дополнительного этанола при алкогольном ЦП (АЦП), поскольку МБ может стать дополнительным фактором патогенеза или, напротив, оказывать протективный эффект при данной патологии.

Учитывая различия в таксономическом и функциональном составе МБ кишечника при ЦП неалкогольной этиологии, а также соответствующие отличия при алкоголизме, можно предположить, что при АЦП МБ состав кишечника также будет изменен. Выявление данных изменений позволит определить бактериальные маркеры, характерные для АЦП и его осложнений, и впоследствии создать диагностический инструмент, позволяющий выявлять подобные изменения на ранних стадиях развития заболевания, а также прогнозировать развитие осложнений.

Цель данного исследования состояла в определении диагностической и прогностической ценности таксономического состава, а также функционального потенциала МБ кишечника у больных ЦП алкогольной этиологии.

Клиническая группа. В исследование включены 20 больных, которые проходили лечение в отделении хронических заболеваний печени Московского клинического научного центра с диагнозом ЦП алкогольной этиологии (АЦП), из них 70% на стадии декомпенсации. В том числе 70% больных — мужского пола, средний возраст 45,7 года. Критерии включения в изучаемую группу: диагноз АЦП, возраст старше 18 лет, злоупотребление алкоголем в анамнезе. Критерии исключения: отсутствие других (помимо АЦП) заболеваний печени, нарушения стула, применение про-, пребиотиков, антибиотиков и ингибиторов протонного насоса менее чем за 3 мес до обследования. Диагностику проводили с помощью стандартных тестов (биохимический анализ крови, общий анализ крови, коагулограмма), эзофагогастродуоденоскопии, ультразвукового исследования органов брюшной полости. Степень декомпенсации и тяжести определяли по индексу Чайлд—Пью, воспалительную активность — по цитолизу (согласно уровню аланинаминотрансферазы, аспартатаминотрансферазы), степень холестаза — по уровню γ-глутамилтранспептидазы (ГГТП), билирубина. У всех пациентов наблюдалась портальная гипертензия.

Сбор и обработка клинического материала. Забор кала у пациентов осуществляли в индивидуальный пластиковый контейнер, избегая попадания мочи и туалетной бумаги. Образец массой 10—20 г подвергали немедленной заморозке и хранили при температуре –20 °C. Из образцов кала выделяли тотальную ДНК согласно методике, разработанной в рамках выполнения работ по соглашению № 14.604.21.0119 при поддержке Минобрнауки Р.Ф..

Метагеномное секвенирование. Подготовка полногеномных библиотек и их секвенирование с использованием генетического анализатора SOLiD 5500 («Life Technology», США) осуществлена согласно рекомендациям производителя с использованием наборов 5500 SOLiD Fragment Library Core Kit, SOLiD Fragment Library Barcoding Kit, SOLiD FlowChip Kit, SOLiD FWD SR S50 Kit, SOLiD Run Cycle Buffer Kit. Фрагментные библиотеки созданы из 5 мкг тотальной ДНК для каждого образца с баркодами. Получены геномные прочтения длиной 50 нуклеотидов, среднее число ридов ^​*​ на образец составило 16 млн.

Биоинформатическая обработка. Обработка результатов полногеномного секвенирования включала определение таксономического и функционального состава (количественное профилирование наличия бактериальных таксонов и функциональных групп генов соответственно). Данный анализ осуществляли с помощью вычислительного конвейера, разработанного и реализованного в лаборатории биоинформатики ФГБУН НИИ ФХМ ФМБА России [13, 14]. Основными этапами анализа являются фильтрация ридов по качеству; фильтрация ридов, картирующихся на геном человека; картирование на референсные каталоги бактериальных геномов и генов; вычисление относительной представленности бактериальных видов и групп генов на основании нормализации значений величины глубины покрытия метагеномными ридами референсных последовательностей, входящих в указанные каталоги. В качестве референсного каталога геномов использован неизбыточный каталог из 353 геномов микроорганизмов, характерных для МБ кишечника (из [14]), а для генов — каталог из 3,3 млн генов МБ кишечника человека, полученный ранее в ходе крупного метагеномного исследования здорового населения Западной Европы [15]. В результате анализа получали вектора относительной представленности бактерий или генов (суммарной длины ридов картировавшихся на соответствующий геном или ген).

При сравнительном анализе в качестве контрольных групп использован набор из анализированных ранее метагеномов от здорового населения РФ (n=96) [14], США (n=137) [16], Китая (n=69) [17], Дании (n=85) [15]. Для подсчета попарных расстояний между метагеномами на основе векторов относительной представленности бактериальных видов использована мера Брея—Кертиса. Идентификацию родов (или генов), относительная представленность которых значительно различается между группами метагеномов, проводили с использованием рангового критерия Манна—Уитни (поправку на множественные сравнения выполняли по методу Бенджамини—Хохберга; в качестве статистически значимых принимали различия с откорректированным p не более 0,01).

Для оценки метаболического потенциала МБ к переработке и синтезу этанола из базы данных KEGG [18] получены соответствующие метаболические цепочки и входящие в них группы генов. Всего отобрано 15 бактериальных функциональных групп в номенклатуре KEGG Orthology (KO). Для каждого метагенома относительная представленность каждой KO-группы получена путем суммирования относительной представленности тех генов референсного каталога генов, которые принадлежали соответствующей KO-группе, согласно исходной аннотации каталога [15]. Полученные значения относительной представленности KO-групп использовали для сравнительного анализа.

Статистический анализ выполнен на языке программирования R, версия 3.1.0. При поиске бактериальных видов, характерных для ротовой полости в качестве дополнительного метода профилирования таксономического состава использован программный пакет MetaPhlAn версии 1.7.7, основанный на детекции уникальных видоспецифичных генных маркеров [19]. Идентификация проводилась на уровне вида (параметры запуска программы: -t rel_ab --tax_lev s); этап выравнивания ридов в рамках данного анализа проводился с помощью программного пакета Bowtie [20]. Среди результатов идентификации выделена та часть, которая соответствует бактериальным видам ротовой полости согласно списку из публикации по неалкогольному ЦП [10].

Клинические параметры и описание пациентов. При изучении цитолитической активности у пациентов данной группы установлено, что уровень АлАТ близок к норме (повышение в 1,5 раза и меньше) или минимально повышен (в 1,5—3 раза выше нормы). Средний уровень АлАТ составил 35,3±14,1 ед/л. Уровень АсАТ подвергся гораздо более значительным колебаниям: средний уровень 52,5±39,5 Ед/л. Среднее содержание общего билирубина у лиц данной группы составило 63,2±85,5 мкмоль/л, при этом тяжелый алкогольный гепатит на фоне ЦП отмечен у 1 больного. Средний уровень ГГТП составил 166±135 ед/л. Уровни щелочной фосфатазы, альбумина, протромбина, тромбоцитов и международное нормализованное отношение составили 161,1±138,15, 35±7,91, 58,05±18,99, (124,15±60,4)·10⁹/л и 1,65±0,4 соответственно. При оценке выраженности печеночной недостаточности выявлено снижение уровня альбумина у 25% пациентов, протромбина у 65%. По индексу Чайлд—Пью пациенты распределились следующим образом: класс, А — у 30%, класс B — у 35%, класс С — у 35%.

Таксономический состав МБ кишечника у пациентов с АЦП. Первичная обработка метагеномных данных (ридов), накопленных для группы пациентов с АЦП, показала их соответствие стандартному диапазону для данного типа данных, биоматериала и алгоритма: 32,09±11,05% ридов легли на референсный каталог геномов бактерий кишечника (сравнить с 23,87±6,54% в [14]). Для большинства образцов доля ДНК человека составила 1,44±4,88%, что также соответствует норме. Для одного образца (А103) данная величина составила 21,9%. Предположительно это может свидетельствовать о наличии воспалительных процессов в кишечнике [21]. Исследование общего таксономического состава МБ пациентов с АЦП выявило наличие 70 родов и 226 видов бактерий (рис. 1).

Анализ видового состава МБ у пациентов с АЦП по сравнению с контрольными группами. Для выявления отличительных особенностей таксономического состава МБ, ассоциированных с заболеванием АЦП, проведено сопоставление наших данных с аналогичными, полученными по четырем контрольным выборкам от здорового населения стран мира (всего 387 метагеномов; см. выше). Визуализация вариабельности состава с помощью многомерного шкалирования показала, что большая часть метагеномов пациентов с АЦП находится близко к основной массе метагеномов контрольных групп (рис. 2); это отражает, что у большинства пациентов наиболее преобладающие бактериальные виды соответствуют таковым у здорового населения. Вместе с тем на графике наблюдается ряд точек (выбросов), соответствующих метагеномам с аномальной структурой микробного сообщества. Для трех визуально наиболее выделяющихся образцов A122, A103, A113 расстояние до всех остальных образцов составило 0,96±0,05, 0,71±0,08 и 0,78±0,06 соответственно, что статистически значимо выше, чем попарное расстояние между всеми проанализированными метагеномами (0,44±0,12; критерий Уэлча p<0,05).

Действительно, при более детальном рассмотрении выявлено, что в метагеноме A122 большая часть относительной бактериальной представленности приходится на роды Escherichia и Enterococcus (в основном за счет Escherichia coli — 32,2%, Escherichia spp. — 25,4% и Enterococcusfaecium — 21%) — для обоих родов данные значения на 1—2 порядка превышают норму для микрофлоры кишечника. В метагеноме A113 наблюдается относительное преобладание различных видов Streptococcus (27%, в том числе S. salivarius 14,5%, S. vestibularis 4,4%), Lactobacillus (20%, в том числе L. salivarius 22%, L. crispatus 2,5%) и Veillonella (17%, в том числе V. spp. 6,4%, V. atypica 5,8%, V. parvula 4,6%, V. dispar 3,5%) — бактерии этих таксонов более характерны для ротовой, а не кишечной микрофлоры. Что касается метагенома A103, он не отличается высоким содержанием ненормальной микрофлоры, а формирует точку (выброс) за счет низкого разнообразия: 76% от общей представленности составляет комменсальный род Bacteroides.

Сравнительный анализ относительной представленности отдельных бактериальных таксонов в группе пациентов с АЦП и каждой из контрольных групп выявил ряд статистически значимых отличий (результаты по наиболее представленным видам отражены на рис. 3,). В частности, по сравнению с МБ здорового населения РФ выявлено повышенное содержание 17 видов и пониженное — 45 видов (p<0,01). Среди видов со статистически значимо повышенной представленностью у пациентов различные оппортунистические патогены Streptococcus и Veillonellа, а также род Lactobacillus. В то же время понижен уровень комменсальных бактерий Clostridium, Ruminococcus, а также пробиотических видов Faecalibacterium prausnitzii и Bifidobacterium adolescentis, обратно ассоциированных с воспалительными заболеваниями кишечника [9].

Определение микроорганизмов, характерных для ротовой полости человека, в МБ кишечника пациентов с АЦП. В недавно опубликованном исследовании метагенома кишечника у пациентов с ЦП отмечено значительно повышенное по сравнению с контрольной группой наличие бактерий, населяющих ротовую полость у здоровых людей [10]. Геномы этих видов не содержатся в используемом нами референсном каталоге, поскольку он оптимизирован под высокопроизводительное профилирование кишечных метагеномов. Поэтому использован метод метагеномного профилирования на основании идентификации видоспецифичных генных маркеров MetaPhlAn [19], который позволяет определять геномы бактерий ротовой полости (см. выше). По результатам анализа метагеномов пациентов с АЦП с помощью данного алгоритма выявлены 7 образцов, в которых относительная представленность, по крайней мере одного бактериального вида, населяющего ротовую полость, составляла более 1% (см. таблицу). Данные роды принадлежат Lactobacillus, Streptococcus и Veillonella. Максимальное присутствие составило 34,84% (вид Lactobacillussalivarius в образце A113).

Анализ метаболического потенциала МБ кишечника у пациентов с АЦП. Предположительно М.Б. кишечника у лиц, страдающих алкоголизмом, обладает измененной способностью к переработке алкоголя и его продуктов. Чтобы проверить эту гипотезу на имеющихся метагеномных данных, мы провели количественное профилирование генов, относящихся к метаболизму этанола (см. выше). На рис. 4 приведены метаболические цепочки, выбранные из метаболической базы данных KEGG для этого анализа.

В результате сравнительного анализа представленности генов данных цепочек у пациентов с АЦП и контрольной группой из числа населения РФ обнаружено, что у группы пациентов повышена представленность генов альдегиддегидрогеназ (K00138, K04021) и понижена представленность ацетил-КоА-синтетаз (K01905, K01895); отношение средних по группам значений величин находится в диапазоне 4—16 раз (рис. 5). Сравнение группы пациентов с контрольными группами населения других стран мира показало более значительные отличия: у пациентов оказались повышены уровни большинства проанализированных KO-групп, за исключением некоторых генов алкоголь- и альдегиддегидрогеназ.

Представленное пилотное исследование МБ кишечника у группы пациентов с АЦП в формате метагеномного анализа — первое в Российской Федерации исследование такого масштаба. Оно позволило выявить значительные особенности как таксономической структуры, так и функционально-метаболического потенциала данного микробного сообщества. В целом состав микрофлоры изучаемой группы с АЦП принципиально не отличается от состава микрофлоры у контрольных групп здорового населения стран мира и состоит в основном из представителей нормальной МБ. У пациентов наблюдается снижение представленности потенциально полезных родов бактерий, в том числе Bifidobacterium, фирмикут Ruminococcus и Faecalibacterium, производящих бутират. На этом фоне наблюдается относительное повышение содержания оппортунистических патогенов родов Escherichia, Enterococcus. Кроме того, повышена доля видов, характерных для ротовой полости (из родов Veillonella, Lactobacillus, Streptococcus). Это наблюдение согласуется с ранее опубликованными результатами [10]. Как известно, ЦП сопровождается снижением функций врожденного иммунитета, секреции желудочного сока и желчи. Возможно, одной из причин миграции бактерий из ротовой полости в кишечник является иммунный дисбаланс. Другой возможной причиной может быть изменение продукции желчных кислот, так как в норме желчь является одним из факторов модуляции структуры и численности бактериальных популяций. Найденные бактерии ротовой полости преимущественно ассоциированы с различными оппортунистическими инфекциями: Veillonella могут быть причиной раневых, гнойных инфекций и воспалительного процесса в толстой кишке [22]; Enterococcus обеспечивают колонизационную резистентность слизистых оболочек и способные вызвать аутоинфекции в условиях иммунодефицитных состояний [23]. В перспективе наличие в МБ кишечника видов, типичных для ротовой полости, можно рассматривать как диагностический маркер для оценки функционального статуса печени.

В организме человека основная переработка этанола происходит в печени, где он метаболизируется в токсичный ацетальдегид, а затем в ацетил-KoA. При нарушении функций печени ацетальдегид перерабатывается неполностью, что ведет к его накоплению и повышению степени токсического воздействия на организм. Показано, что ацетальдегид может принимать участие в процессе канцерогенеза. Ферменты, расщепляющие этанол, экспрессируются в основном в гепатоцитах, но кишечные эпителиоциты и кишечные бактерии также участвуют в метаболизме этанола. При патологиях печени, с одной стороны, МБ может перерабатывать этанол в альдегид, что приводит к увеличению уровня ацетальдегида в просвете кишечника [24] и способствует повышению проницаемости кишечника и воспалению [9]. С другой стороны, МБ может служить резервом ферментов переработки ацетальдегида (и оказывать положительный эффект) [12]. Кроме того, МБ может продуцировать эндогенный этанол при расщеплении углеводов. Таким образом, исследование метаболических способностей МБ при алкоголизме и заболеваниях печени может указать на новые факторы в патогенезе этих заболеваний.

Метагеномный анализ функционального потенциала МБ показал, что у пациентов с АЦП наблюдается повышение относительной представленности бактериальных генов альдегиддегидрогеназ и понижение — для генов ацетил-КоА-синтетаз. Дополнительно нами обнаружено повышение потенциала метаболизма этанола в МБ контрольной группы РФ по сравнению с контрольными группами из других стран. Можно предположить, что в российской группе кишечная микрофлора как здоровой популяции, так и с АЦП изначально более адаптирована к метаболизму этанола по сравнению с МБ контрольных групп из других стран. Такие различия могут коррелировать со значительными высокоуровневыми вариациями таксономического состава — на уровне соотношения основных отделов Bacteroidetes, Firmicutes и Actinobacteria. Так, у контрольной группы из США абсолютно преобладают Bacteroides, в геномах которых в принципе понижено содержание этих генов. При этом у пациентов с АЦП по сравнению с когортами из других стран повышена доля Lactobacillus, в геномах которых полностью представлены все гены ферментов изученного пути [12]. Наш подход в силу формата данных не дает ответ на преобладающее направление исследуемых реакций превращения этанола и его продуктов; таким образом, невозможно различить потенциал синтеза и деградации этанола в силу обратимости большинства изучаемых реакций. Данное исследование не предполагало оценку экспрессии генов (например, с помощью метатранскриптомного и/или метапротеомного подхода) и отражает лишь гипотетические возможности М.Б. Тем не менее предположительно эти различия влекут за собой и изменения в реальном уровне переработки этанола и продуктов его метаболизма МБ, что имеет существенное значение для организма человека.

Проведенный нами метагеномный анализ МБ кишечника на ограниченной выборке пациентов с АЦП позволил выявить особенности, свидетельствующие о смещении таксономической структуры микробного сообщества. Выявленное повышение представленности генов метаболизма этанола указывает на потенциальную адаптацию МБ к хроническому употреблению алкоголя и нарушениям функций печени. Ожидается, что исследование обнаруженных тенденций на более широкой выборке пациентов позволит углубить понимание роли МБ в патогенезе данного заболевания, в частности ее роли в изменении метаболизма этанола и продуктов его деградации.

Финансовая поддержка

Данное исследование осуществлялось за счет средств государственного контракта №RFMEFI60414X0119 при финансовой поддержке государства в лице Минобрнауки России, с использованием оборудования Междисциплинарного ЦКП Казанского федерального (Приволжского) университета (ГК № 14.594.21.0003, уникальный идентификатор RFMEFI59414X0003).

Конфликт интересов отсутствует.