АО — абдоминальное ожирение

АТФ-КК — зависимый от АТФ калиевый канал

ДАД — диастолическое артериальное давление

ДИ — доверительный интервал

ИМТ — индекс массы тела

ИР — инсулинорезистентность

ЛПВП — липопротеиды высокой плотности

ЛПНП — липопротеиды низкой плотности

М — маркер молекулярной массы ДНК

МС — метаболический синдром

ОБ — окружность бедер

ОТ — окружность талии

ОХС — общий холестерин

ОШ — отношением шансов

ПЖ — поджелудочная железа

ПЦР — полимеразная цепная реакция

САД — систолическое артериальное давление

СД-2 — сахарный диабет 2-го типа

ТГ — триглицериды

УГК — уровень глюкозы в крови

ХС — холестерин

Сахарный диабет 2-го типа (СД-2) — одно из самых распространенных неинфекционных заболеваний XXI века [1]. Проблема СД-2 существует и в Кыргызской Республике. Согласно данным Республиканского медико-информационного центра Министерства здравоохранения в Кыргызстане в 2013 г. зарегистрировано 15 566 случаев СД-2 у мужчин и 26 506 у женщин. В 2014 г. заболеваемость СД-2 выросла, составив у мужчин 16 997, у женщин 27 218 случаев.

СД-2 — многофакторное заболевание, возникающее в результате взаимодействия комплекса внешнесредовых и генетических факторов [1].

В настоящее время на различных хромосомах выделено более 100 генов, ассоциированных с высоким риском развития СД-2, среди которых наибольший интерес представляют полиморфные локусы G276T гена адипонектина (ADIPOQ), Glu23Lys гена KCNJ11 (potassium channel, inwardly rectifying subfamily J, member 11) и IVS3C>T гена TCF7L2 (transcription factor 7-like 2), ассоциированные с инсулинорезистентностью и дисфункцией β-клеток поджелудочной железы (ПЖ) [2, 3].

Ген ADIPOQ кодирует секретирующийся преимущественно адипоцитами жировой ткани полифункциональный белок адипонектин, который участвует в нескольких физиологических процессах, в том числе в регуляции уровня глюкозы в крови (УГК) посредством повышения чувствительности тканей к инсулину [4]. Ген KCNJ11 кодирует белок kir6.2, являющийся одной из субъединиц зависимого от АТФ калиевого канала (АТФ-КК), который участвует в секреции инсулина, стимулированной глюкозой [5]. Ген TCF7L2 кодирует транскрипционный фактор, который, являясь составной частью сигнального пути Wnt, участвует в экспрессии генов, продукты которых вовлечены в процессы роста и развития β-клеток ПЖ [6].

Структурное и функциональное состояние генов ADIPOQ, KCNJ11и TCF7L2 могут определять генетическую предрасположенность к СД-2 [1]. Варианты аллелей и генотипов полиморфных локусов G276T гена ADIPOQ, Glu23Lys гена KCNJ11 и IVS3C>T гена TCF7L2, кодируя пептиды, обладающие различной биологической активностью и участвующие на различных этапах метаболизма углеводов и жиров, могут определять метаболические различия между людьми и индивидуальную предрасположенность к СД-2.

Цель работы — изучить генетический профиль кыргызской популяции по полиморфизмам генов ADIPOQ, KCNJ11 и TCF7L2 и провести анализ ассоциации комбинаций генотипов полиморфных локусов G276T гена ADIPOQ, Glu23Lys гена KCNJ11 и IVS3C>T гена TCF7L2 с развитием СД-2 в кыргызской популяции.

В исследование включили давших добровольное письменное информированное согласие на участие 223 представителя кыргызской национальности, из которых у 114 имелся СД-2 и у 109 СД-2 отсутствовал (контрольная группа) (табл. 1).

Всем обследованным измеряли САД и ДАД, а также антропометрические показатели (масса тела, рост, ОТ и ОБ). ИМТ рассчитывали по формуле: ИМТ= масса тел (кг)/рост² (м); отношение ОТ/ОБ. Ожирение констатировали при ИМТ ≥30 кг/м². АО диагностировали у мужчин при ОТ более 102 см, а у женщин — более 88 см, при отношении ОТ/ОБ у мужчин >0,95 и у женщин >0,85.

Кровь для биохимических исследований брали утром натощак, после 14-часового ночного голодания. УГК, уровни ОХС, ТГ, ХС ЛПВП определяли на биохимическом анализаторе Beckman (США). Содержание Х.С. ЛПНП вычисляли по формуле Фридвальда. Уровень иммунореактивного инсулина натощак в сыворотке крови определяли иммуноферментным методом. Индекс инсулинорезистентности (ИР) рассчитывали по формуле: HOMA-IR=инсулин · глюкоза/22,5. ИР считали при индексе НОМА-IR 2,77 и выше.

Геномную ДНК выделяли из периферической крови стандартным методом фенольно-хлороформной экстракции. Идентификацию генотипов полиморфизмов G276T гена ADIPOQ, Glu23Lys гена KCNJ11 и IVS3C>T гена TCF7L2 проводили методом полиморфизма длин рестрикционных фрагментов с использованием пары специфичных праймеров. Продукты амплификации подвергали гидролизу соответствующими эндонуклеазами. Электрофорез проводили в 3% агарозном геле.

Для амплификации полиморфного локуса G276T гена ADIPOQ использовали праймеры 5’-GGCCTCTTTCATCACAGACC-3’ и 5’-AGATGCAGCAAAGCCAAAGT-3’ и рестриктаза BsmI согласно протоколу исследования (рис. 1).

Для амплификации полиморфного локуса Glu23Lys гена KCNJ11 использовали нуклеотидные последовательности 5`-GACTCTGCAGTGAGGCCCTA-3` (прямой праймер) и 5`-ACGTTGCAGTTGCCTTTCTT-3` (обратный праймер). В соответствии с протоколом исследования после проведения ПЦР продукты амплификации (размер 210 п.н.) обрабатывали эндонуклеазой Ban II (рис. 2).

Амплификацию полиморфного локуса IVS3C>T гена TCF7L2 проводили с использованием олигонуклеотидных праймеров: прямой 5-ACAATTAGAGAGCTAAGCACTTTTTAAATA-3 и обратный 5-CTAACCTTTTCCTAGTTATCTGACATTG-3. Для идентификации генотипов после проведения ПЦР продукты амплификации обрабатывали эндонуклеазой SspI (рис. 3).

Статистическую обработку полученных данных осуществляли с помощью пакета программ Statistica v.8.0. (StatSoft) и GraphPad Prism v 5.0. Количественные данные, имеющие нормальное распределение, представлены в виде среднего ± стандартное отклонение, данные, распределение которых отличается от нормального, представлены в виде медианы и интерквартильного размаха (25-й процентиль; 75-й процентиль). Качественные данные представлены в виде числа больных с указанным признаком и процента от их числа в группе. Для сравнения частот аллелей и генотипов исследуемых полиморфных маркеров в группах с наличием и отсутствием СД-2 использовали критерий χ² с поправкой Йетса на непрерывность. Силу ассоциации выражали отношением шансов (ОШ) с 95% доверительным интервалом (ДИ). Статистически значимыми считали различия при p<0,05. Распределение частот аллелей и генотипов в исследуемых популяциях проверяли на соответствие распределению Харди—Вайнберга.

Для исследования предрасположенности к СД-2 в кыргызской популяции нами выбраны 3 классических гена (ADIPOQ, KCNJ11, TCF7L2), для которых доказана ассоциация с СД-2, а также с сосудистыми осложнениями при СД-2 в других популяциях [5—7], в том числе в Российской Федерации [8—10].

Ген ADIPOQ картирован на 3-й хромосоме (3q27) и кодирует многофункциональный белок адипонектин, участвующий в регуляции УГК посредством повышения чувствительности тканей к инсулину [7]. Секреция адипонектина стимулируется инсулином, а его концентрация в крови колеблется от 2 до 20 мкг/мл [8]. У больных с ожирением, ИР, СД-2, МС и ишемической болезнью сердца выявлено снижение в крови уровня адипонектина [11—17].

Предполагают, что однонуклеотидный полиморфизм G276T (rs1501299), локализованный во 2-м интроне гена ADIPOQ, влияет на экспрессию адипонектина [12, 13]. В ряде исследований пониженный уровень экспрессии гена ADIPOQ и низкое содержание адипонектина в плазме крови связывают с аллелем Т [12, 13], а в других работах, наоборот, с носительством аллеля G [14—17].

Результаты крупных метаанализов [18] и отдельных исследований, проведенных в азиатских [17—20], европейских [15, 18] и арабских популяциях [13], свидетельствуют об ассоциации полиморфного маркера G276Т гена ADIPOQ с СД-2, что указывает на роль адипонектина в патогенезе СД-2.

В кыргызской популяции полиморфный локус G276Т гена ADIPOQ также ассоциирован с развитием СД-2. В нашем исследовании у больных с СД-2 по сравнению с контрольной группой статистически значимо чаще выявлялись гетерозиготный генотип G276T (χ²=6,65; р=0,036) и аллель Т (χ²=5,008; р=0,025) (табл. 2). При расчете ОШ выявлено, что при наличии гетерозиготного генотипа G276T риск развития СД-2 повышается почти в 2 раза (ОШ 1,8 при 95% ДИ от 1,05 до 3,05; p=0,036), а при аллеле 276T в 1,68 раза (ОШ 1,68 при 95% ДИ от 1,09 до 2,60; p=0,025). C пониженным риском развития СД-2 ассоциирован гомозиготный генотип G276G (ОШ 0,51 при 95% ДИ от 0,30 до 0,86; p=0,036) и аллель G (ОШ 0,59 при 95% ДИ от 0,38 до 0,92; p=0,025). Таким образом, у кыргызов аллель Т и гетерозиготный генотип G276T полиморфного маркера G276T гена ADIPOQ могут рассматриваться в качестве прогностических маркеров повышенного риска развития СД-2.

Ген KCNJ11 локализован на хромосоме 11p15.1 и кодирует белок Kir6.2., являющийся составной частью АТФ-КК, который участвует в секреции инсулина, стимулированной глюкозой [21].

В 1-м экзоне гена KCNJ11 выявлена миссенс-мутация в позиции 67 G→A (rs5219), приводящая к замене глутаминовой кислоты на лизин в позиции 23 (Glu23→Lys) белка Kir 6.2 [21]. Исходя из комбинации аллелей возможны 3 варианта генотипа, кодирующие соответственно 3 варианта белка Kir 6.2 (Glu23Glu, Glu23Lys, Lys23Lys), которые определяют функциональную активность АТФ-КК и процесс экзоцитоза инсулина из β-клеток ПЖ.

При исследовании полиморфного локуса Glu23Lys гена KCNJ11 выяснилось, что у китайцев [22], японцев [23], корейцев [24], тайванцев [25], тунисцов [26], а также русских [27], англичан [21], иранцев [28] и арабов [29], имеющих в генотипе редкий аллель 23Lys, повышен риск развития СД-2. Предполагают, что при варианте белка Kir 6.2., имеющего в своей структуре аминокислоту лизин (23Lys), нарушается функция АТФ-КК и секреция инсулина из β-клеток ПЖ в кровоток, что способствует развитию СД-2 [21, 23, 24].

В нашем исследовании у больных СД-2 по сравнению с лицами контрольной группой статистически значимо чаще встречались аллель 23Lys, генотипы Glu23Lys и Lys23Lys (χ²=5,54; р=0,019) (см. табл. 2). У лиц, имеющих аллель 23Lys, риск развития СД-2 повышен в 1,62 раза (ОШ 1,62 при 95% ДИ от 1,10 до 2,38; p=0,019). В то же время носители распространенного аллеля Glu23 (ОШ 0,62 при 95% ДИ от 0,42 до 0,91; p=0,019) и генотипа Glu23Glu (ОШ 0,51 при 95% ДИ от 0,29 до 0,87; p=0,045) имели пониженный риск развития СД-2. Таким образом, в популяции кыргызов полиморфный маркер Glu23Lys гена KCNJ11 ассоциирован с СД-2, что полностью согласуется с функциональным значением этого гена, продукт которого — белок Kir 6.2., являясь структурным компонентом АТФ-КК и влияя на экзоцитоз инсулина из β-клеток ПЖ, может играть роль в патогенезе СД-2.

Ген TCF7L2 локализован на хромосоме 10q25.3 и кодирует транскрипционный фактор (TCF-4), который является одним из структурных компонентов сигнального пути Wnt (Wingless type), контролирующего экспрессию генов, белковые продукты которых участвуют в механизмах роста и пролиферации β-клеток ПЖ, в секреции глюкагонподобного пептида и в механизмах превращения проинсулина в инсулин [6, 30].

Ген TCF7L2 считают одним из основных генов предрасположенности к СД-2 [2, 3]. В 3-м интроне этого гена есть полиморфный участок IVS3C>T (rs7903146) с двумя аллельными вариантами: С и Т [30]. У представителей европеоидной расы распространенность редкого аллеля Т выше (22—36%) [30—36], чем у представителей монголоидной расы (3—6%) [37—42].

При исследовании полиморфного локуса IVS3C>T гена TCF7L2 выявлено, что у европейцев [30—36], американцев мексиканского происхождения [43], южных азиатов [44] и представителей Западной Африки [45] аллель Т ассоциирован с повышенным риском развития СД-2.

В азиатских популяциях — у японцев [38, 39] полиморфный маркер IVS3C>T гена TCF7L2 ассоциирован с СД-2, тогда как у китайцев [40, 41], корейцев [42] и персов из города Джехро́м из Ирана [46] ассоциации этого маркера с СД-2 не выявлено.

У кыргызов, по результатам нашего исследования, полиморфный маркер IVS3C>T гена TCF7L2 самостоятельно статистически значимо не ассоциирован с развитием СД-2, однако его предрасполагающее влияние выявлялось в составе комбинации с вариантами генотипов полиморфных локусов G276T гена ADIPOQ и Glu23Lys гена KCNJ11.

В результате анализа межгенных взаимодействий выявлены двух- и трехлокусные комбинации генотипов генов ADIPOQ, KCNJ11, TCF7L2, статистически значимо ассоциированные с высоким риском развития СД-2. Статистически значимые комбинации вариантов генотипов генов ADIPOQ, KCNJ11 и TCF7L2 в группе больных СД-2 и контроля приведены в табл. 3.

При анализе сочетаний генотипов полиморфных локусов G276T гена ADIPOQ и Glu23Lys гена KCNJ11 3 генотипа из 9 возможных комбинаций в разной степени ассоциированы с повышенным риском развития СД-2. При комбинации генотипов G276T/Glu23Lys риск развития СД-2 повышался в 4,88 раза (ОШ 4,88 при 95% ДИ от 1,93 до 12,35; р=0,0013), при комбинации G276G/Lys23Lys — в 4,65 раза (ОШ 4,65 при 95% ДИ от 1,42 до 15,21; р=0,019), при комбинации G276T/Glu23Glu — 3,10 раза (ОШ 3,10 при 95% ДИ от 1,27 до 7,59; р=0,022).

При попарном сравнении комбинаций генотипов полиморфных локусов G276T гена ADIPOQ и IVS3C>T гена TCF7L2 между группой больных СД-2 и контрольной группой выявлено, что среди больных СД-2 лица с комбинацией генотипов G276T/СС (42%) встречаются статистически значимо чаще, чем среди лиц контрольной группы (31%) (см. табл. 3). Комбинация генотипов G276T/СС повышала риск развития СД-2 почти в 2 раза (ОШ 1,97 при 95% ДИ от 1,07 до 3,61; р=0,04). ОШ для носителей генотипа G276T полиморфизма гена ADIPOQ составило 1,8, а для генотипа СС гена TCF7L2 — 0,89.

Предполагается, что ген оказывает однонаправленное влияние и самостоятельно, и в комбинации. Однако в литературе имеются многочисленные подтверждения того, что некоторые полиморфные варианты генов, не проявляющие свойств самостоятельно, в составе межгенных взаимодействий могут демонстрировать синергичный эффект и как следствие способствовать развитию тех или иных заболеваний [47].

При сравнении частот комбинации генотипов полиморфных локусов Glu23Lys гена KCNJ11 и IVS3C>T гена TCF7L2 у больных СД-2 и лиц контрольной группы выявлены 2 комбинированных генотипа из 9 возможных комбинаций (Lys23Lys/CC и Glu23Lys/CT), которые достоверно чаще встречались у больных СД-2 по сравнению с контрольной выборкой (χ² 4,21; р=0,04). При комбинации генотипов Lys23Lys/CC генов KCNJ11/TCF7L2 риск развития СД-2 повышался в 2,65 раза (ОШ 2,65 при 95% ДИ от 1,12 до 6,28; р=0,042), а при комбинации Glu23Lys/CT — в 3,88 раза (ОШ 3,88 при 95% ДИ от 1,27 до 11,91; р=0,027). ОШ для носителей генотипа Glu23Lys полиморфизма гена KCNJ11 составило 1,49, а для генотипа СТ гена TCF7L2 — 1,24.

При сопоставлении 27 различных трехчленных комбинаций генотипов полиморфных локусов 3 генов ADIPOQ (G276T), KCNJ11 (Glu23Lys) и TCF7L2 (IVS3C>T) лишь одна комбинация, представленная гетерозиготными вариантами (G276T/Glu23Lys/CT), статистически значимо ассоциировалась с повышенным риском развития СД-2 (ОШ 14,48; р=0,02). Очевидно, что в риск комбинации гетерозиготных генотипов (G276T/Glu23Lys/CT) вносят вклад отдельные минорные аллели 276T гена ADIPOQ и 23Lys гена KCNJ11, для которых показана ассоциация с СД-2. Таким образом, результаты нашего исследования свидетельствуют, что комбинация функционально измененных генотипов, несущих минорные аллели генов ADIPOQ, KCNJ11 и TCF7L2, существенно повышает риск развития СД-2.

При анализе ассоциации комбинаций генотипов полиморфных локусов G276T гена ADIPOQ, Glu23Lys гена KCNJ11 и IVS3C>T гена TCF7L2 с развитием СД-2 в кыргызской популяции выявлены следующие закономерности. Сочетание любых «неблагоприятных» генотипов у одного и того же больного существенно повышает риск развития СД-2. Гаплотипы, включающие генотипы, каждый из которых по отдельности ассоциирован с СД-2, повышают риск развития заболевания в большей степени по сравнению с гаплотипами, состоящими из «благоприятных» и «неблагоприятных» генотипов.

В нашем исследовании в составе комбинации генотипов, ассоциированных с повышенным риском развития СД-2, преобладали гетерозиготные варианты генотипов, в то время как гомозиготные варианты встречались реже. Комбинации из 2 редких и 2 частых генотипов повышают риск развития заболевания, тогда как гаплотипы, представленные распространенными генотипами, чаще являются протективными.

При типировании по полиморфным локусам G276T гена ADIPOQ, Glu23Lys гена KCNJ11 и IVS3C>T гена TCF7L2 с развитием СД-2 у кыргызов ассоциированы аллель Т (ОШ 1,68; р=0,025), гетерозиготный генотип G276T (ОШ 1,79; p=0,036) гена ADIPOQ; аллель 23Lys (ОШ 1,62; p=0,019) гена KCNJ11; а также двухлокусные комбинации генотипов генов ADIPOQ/KCNJ11: G276T/Glu23Lys (ОШ 4,88; p=0,0013), G276G/Lys23Lys (ОШ 4,65; p=0,019), G276T/Glu23Glu (ОШ 3,10; p=0,022), двухлокусная комбинация генотипов генов ADIPOQ/TCF7L2: G276T/СС (ОШ 1,97; p=0,04); двухлокусные комбинации генотипов генов KCNJ11/TCF7L2: Lys23Lys/CC (ОШ 2,65; p=0,042), Glu23Lys/CT (ОШ 3,88; p=0,027); трехлокусная комбинация генотипов генов ADIPOQ/KCNJ11/TCF7L2: G276T/Glu23Lys/CT (ОШ 14,48; p=0,02).

Среди генов, вошедших в эти комбинации, чаще встречаются варианты генотипов генов ADIPOQ и KCNJ11, ассоциированные с СД-2 самостоятельно, в комбинации друг с другом, а также с вариантами гена TCF7L2. Это позволяет предположить, что в популяции кыргызов в развитии СД-2 основную роль играют гены ADIPOQ и KCNJ11, влияющие преимущественно на развитие ИР, чем ген TCF7L2, ассоциированный в большей степени с дисфункцией β-клеток ПЖ.

Результаты нашего исследования согласуются с данными литературы и показывают, что одни и те же аллели и генотипы в разных этнических группах могут по-разному влиять на развитие многофакторных заболеваний; возможно, это обусловлено состоянием аллелей, присутствующих в других полиморфных локусах.

Исследование ассоциации комбинации генотипов генов — кандидатов СД-2 способствует лучшему пониманию механизмов развития СД-2 и важны для прогноза риска развития заболевания, проведения индивидуальной профилактики и лечения больных СД-2.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.